Genoomtechniek van primaire menselijke B-cellen met CRISPR/Cas9
3 november 2020
Hier bieden we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor CRISPR/ Cas9-gebaseerde genoomengineering van primaire menselijke B-cellen voor gen knock-out (KO) en knock-in (KI) om biologische functies van genen in B-cellen en de ontwikkeling van B-celtherapieën te bestuderen.
Dit protocol stelt onderzoekers in staat om precies een gen in B-cellen te elimineren om de effecten van functieverlies van dat gen te bestuderen of om een transgen in te voegen voor stabiele transgenexpressie die kan worden gebruikt voor onderzoek of therapeutische doeleinden. Het grootste voordeel van deze methode is dat het een universeel platform biedt dat het mogelijk maakt om B-cellen eenvoudig en nauwkeurig te engineeren met hoge efficiëntie. Deze methode kan worden gebruikt om B-cellen te engineeren om recombinante antilichamen of enzymen tot expressie te brengen en vervolgens die B-cellen over te dragen om infecties te behandelen of bij enzymopathieën.
Om te beginnen, ontdooi B-cellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Terwijl je wacht, giet twee milliliter voorverwarmde FBS in een steriele, 15-milliliter conische buis. Zodra de B-cellen volledig ontdooid zijn, voeg je onmiddellijk één milliliter voorverwarmde FBS druppelsgewijs toe aan het monster.
Incubeer een minuut bij kamertemperatuur. Pipet voorzichtig om het monster te hersuspenderen en breng vervolgens het hele volume druppelsgewijs over in een conische buis met twee milliliter voorverwarmde FBS. Breng het volume op 15 milliliter met steriele PBS, dek de buis af en draai hem voorzichtig twee tot drie keer om.
Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 400 keer G en gooi vervolgens het supernatant weg zonder de cellenpellet te verstoren. Hersuspendeer de pellet met één milliliter voorgeëquilibreerd B-cel expansiemedium en tel de cellen. Het totale aantal cellen moet ongeveer 10 tot de zevende cel zijn.
Breng de cellen over in een flacon met 20 milliliter voorgeëquilibreerd B-cel expansiemedium. De uiteindelijke concentratie van de cellen moet ongeveer vijf keer 10 tot de vijfde cel per milliliter zijn. Incuber de flacon verticaal in een weefselkweekincubator.
Bereid het CRISPR/Cas9 transfectiesubstraat voor door één microgram chemisch gemodificeerd sgRNA te mengen met 1,5 microgram chemisch gemodificeerd streptococcus pyogenes Cas9 nucleus mRNA per transfectiereactie. Als controle, voeg je één microliter TE-buffer toe, in plaats van sgRNA, in een 0,2-milliliterbuis van een strip met acht buizen. Zet een electroporator aan en bereid de nucleaire infectie reagentia voor.
Tel en breng 1 miljoen B-cellen per transfectiereactie over in een steriele conische buis. Breng het volume op 15 milliliter met steriele PBS en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 400 keer G. Gooi na centrifugatie het supernatant weg.
Hersuspendeer de cellen met 10 milliliter steriele PBS en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 400 keer G, gooi vervolgens het supernatant volledig weg zonder de cellenpellet te verstoren. Voeg 0,5 microgram chemisch gemodificeerd GFP mRNA toe per 1 miljoen B-cellen aan de cellenpellet. Hersuspendeer de pellet met 20 microliter primaire celtransfectiereagens per 1 miljoen B-cellen en meng voorzichtig door vijf tot zes keer te pipetten.
Breng 20,5 microliter per transfectiereactie over in de 0,2-milliliterbuizen met CRISPR/Cas9 reagens. Pipet eenmaal omhoog en omlaag om te mengen en breng vervolgens het hele volume over in een transfectiecuvet. Dek de cuvet af en tik voorzichtig op de werktafel om ervoor te zorgen dat de vloeistof de bodem van de cuvet bedekt.
Gebruik het humane primaire B-cel protocol op de electroporator voor transfectie. Laat de geëlectropeerde cellen in de cuvet gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur rusten. Breng vervolgens 80 microliter van het voorgeëquilibreerde B-cel expansiemedium over in de transfectiereactie in de cuvet.
Plaats de cuvet gedurende 30 minuten in de weefselkweekincubator. Pipet een paar keer voorzichtig om te mengen en breng vervolgens het hele volume van het monster over van de cuvet naar een geschikte put van een 48-puts weefselkweekplaat met één milliliter van het B-cel expansiemedium. De uiteindelijke concentratie van de cellen moet 1 miljoen cellen per milliliter zijn.
Voer een gen knock-in experiment uit door recombinant adeno geassocieerd type-zes viraal vector met een multipliciteit van infectie van 500.000 over te brengen naar de geschikte put met geëlectropeerde cellen. Plaats de plaat in een weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met vochtigheid. In het knockout experiment, toonde het B-cel aantal meer dan 80% levensvatbare cellen met een lichte vermindering in celrecuperatie in zowel de controle als de CD19 knockout monsters op 24 uur na elektroporatie.
B-cellen werden op dag vijf na transfectie verzameld voor flowcytometrie en getijdeanalyse. Representatieve scatterplots van de controle- en knockout monsters toonden respectievelijk 14 en 95% CD19 negatieve cellen, wat een significante vermindering van CD19 expressie in de knockout monsters aantoont. Chromatogrammen van genomische sequentiebepaling toonden dubbele pieken in de CD19 knockout B-cellen, wat wijst op inserties of deleties van nucleotiden na dubbelstrengsbreuken gemedieerd door CRISPR/Cas9.
Indel analyse van de chromatogrammen van de knockout monsters toonde een hoog percentage indel vorming op het CD19 locus, wat consistent is met het percentage CD19 eiwitverlies gedetecteerd door flowcytometrie. B-cellen van het knock-in experiment werden verzameld op dag 12, na engineering. Scatterplots toonden 64% EGFP positieve cellen in het monster dat de recombinante adeno geassocieerd type-zes viraal vector ontving, samen met RNP, terwijl geen of minimale EGFP positiviteit werd waargenomen in de controle en vector-alleen monsters respectievelijk.
Een junction PCR versterking, toonde 1,5 kilobase paar amplicons in het knock-in monster en er werd geen PCR product waargenomen in zowel het controle als vector-alleen monster. Celtellingen toonden aan dat het engineering proces de celrecuperatie in het knock-in monster meer beïnvloedt dan de controle of de vector-alleen monsters. Echter, alle monsters herstelden zich snel binnen drie dagen na engineering.
Deze procedure kan ook worden gebruikt om base editor agentia te introduceren om enkele basenparen te wijzigen om enkelvoudige puntmutaties in het B-cel genoom te induceren of te corrigeren. Het zou ook kunnen worden gebruikt om voortijdige stopcodons te introduceren of om splice sites te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een gedetailleerd protocol voor CRISPR/Cas9-gebaseerde genoommodificatie in primaire menselijke B-cellen, wat gene knockout en knock-in mogelijk maakt om genfuncties te onderzoeken en therapeutica voor B-cellen te ontwikkelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Genomica
- Celbiologie
- Therapeutische Ontwikkeling
Achtergrond
- Het belang van het bestuderen van genfuncties in B-cellen
- CRISPR/Cas9-technologie die nauwkeurige aanpassingen mogelijk maakt
- Potentiële toepassingen bij infectieziekten en enzymopathieën
Gebruikte methoden
- CRISPR/Cas9-transfectie van primaire B-cellen
- Primaire menselijke B-cellen als biologisch model
- Elektroporatie voor het afleveren van genbewerkingsinstrumenten
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle knockout van het CD19-gen met een reductie in expressie van meer dan 95%
- Hoge percentages indel-vorming op de CD19-locus, bevestigd door genomische sequencing
- In staat tot het introduceren van transgenen en het bewerken van baseparen voor functionele studies
Conclusies
- Dit protocol verbetert effectief de studie van de B-celbiologie en therapeutica.
- Het biedt een robuust platform voor genbewerking, met aanzienlijke implicaties voor medisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt nauwkeurige genoommodificatie van primaire menselijke B-cellen mogelijk met behulp van CRISPR/Cas9, wat targetvalidatie en de expressie van therapeutische eiwitten ondersteunt. Het biedt een schaalbaar platform voor de ontwikkeling van op B-cellen gebaseerde therapieën voor infectieziekten en enzymopathieën. De methode verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij studies naar genfuncties en vermindert de risico's bij translationele vooruitgang.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functioneel onderzoek mogelijk naar de effecten van verlies van genfunctie in primaire menselijke B-cellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt efficiënte knockout van endogene genen om biologische pathways en mechanismen te verduidelijken.
- Strategische waarde: Faciliteert risicoreductie van targets door de essentie van genen te valideren in een ziekterelevant immuuncelmodel.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gemanipuleerde B-cellen met een stabiele transgene expressie voor consistente functionele read-outs.
- Operationele waarde: Maakt de grootschalige productie van recombinante antilichamen of enzymen mogelijk voor downstream screening-applicaties.
- Strategische waarde: Biedt een vernieuwbaar cellulair systeem voor de ontwikkeling van assays gericht op humorale immuunresponsen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de preklinische evaluatie van B-celtherapeutica via stabiele transgeenintegratie en -expressie.
- Operationele waarde: Demonstreert herstelkinetiek na engineering, wat inzicht geeft in doserings- en productietijdlijnen.
- Strategische waarde: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door genbewerkingen te koppelen aan functionele uitkomsten in een klinisch relevant celtype.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in de vroege ontdekkingsfase voor targetvalidatie, gaat over in lead-identificatie via transgeen-expressie en ondersteunt preklinisch werk via functionele B-celengineering.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten mogelijk via knockout van genen van belang in primaire menselijke B-cellen.
- Screening: Produceert gestandaardiseerde, uitbreidbare B-celpopulaties voor consistente evaluatie van verbindingen of antigenen.
- Analytics: Levert kwantitatieve resultaten, waaronder flowcytometrie, genomische sequencing en junction PCR voor validatie van de bewerking.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genbewerking met therapeutisch potentieel via expressie van recombinante antilichamen of enzymen.
- Herbruik op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar platform voor iteratieve genbewerking van meerdere targets in B-celtherapieën.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Hoge bewerkings-efficiëntie met meer dan 95% CD19-knockout en 64% knock-in rates, wat betrouwbare mechanistische studies mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Levering via elektroporatie waarborgt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende transfectiereacties heen.
- Strategische waarde: Vermindert de afhankelijkheid van complexe genetische engineering-benaderingen, waardoor ontwikkelingstijden en kosten worden verlaagd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door functionele gegevens te leveren over gen-essentialiteit en de opbrengst van therapeutische eiwitten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van primaire cellen, elektroporatie en de bereiding van CRISPR/Cas9-reagentia.
- Afhankelijk van toegang tot elektroporatoren, transfectiereagentia en infrastructuur voor de productie van rAAV-vectoren.
- Necessiteert gestandaardiseerde protocollen voor B-celisolatie, expansie en mediumequilibratie tussen teams.
- Vereist aanpassingsbeoordelingen voor verschillende genen-targets of transgen-cassettes in primaire B-cellen.
- Praktische beperkingen omvatten een variabele celrecovery na engineering, hoewel monsters gewoonlijk binnen drie dagen herstellen.
