Een DNA/Ki67-gebaseerde flowcytometrietest voor celcyclusanalyse van antigeenspecifieke CD8 T-cellen bij gevaccineerde muizen
5 januari 2021
Klonale expansie is een belangrijk kenmerk van antigeenspecifieke T-celrespons. De celcyclus van antigeen-reagerende T-cellen is echter slecht onderzocht, deels vanwege technische beperkingen. We beschrijven een flowcytometrische methode om klonaal uitdijende antigeenspecifieke CD8 T-cellen in milt- en lymfeklieren van gevaccineerde muizen te analyseren.
Ons protocol biedt een praktische benadering waarmee de milt en lymfeklieren van muizen kunnen worden gebruikt om de dynamiek van T-celrespons groter weer te geven dan het verstrekken van een steady-state fenotypische momentopname. Onze techniek detecteert gevoelig antigeenspecifieke CD8 T-cellen die bezig zijn met een voortdurende respons. Prolifererende CD8 T-cellen worden gemeten zonder de mogelijk verstorende effecten van in vivo medicamenteuze behandeling of celoverdracht.
Onze techniek kan een venster bieden op de immuundynamiek in verschillende omgevingen. Bijvoorbeeld met betrekking tot de respons op vaccinatie en infecties, auto-immuunziekten en kankerimmunotherapie. Bereid verse 1x permeabilisatie wasbuffer door 10x permeabilisatiebuffer te verdunnen met gedestilleerd water en filtreer het door een filter van 0,45 micrometer om aggregaten te elimineren.
Verdun monoklonaal antilichaam Ki67 FITC in 1x permeabilisatiewasbuffer zoals bepaald met een titratie-experiment voor een eindvolume van 100 microliter per monster. Voeg 3 milliliter van de 1x permeabilisatie wasbuffer toe aan elke buis met cellen en centrifugeer bij 400 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
Voeg nogmaals de 1x permeabilisatiewasbuffer toe en centrifugeer om de cellen te pelleteren. Gooi vervolgens het supernatant weg. Voeg 100 microliter verdund monoklonaal antilichaam Ki67 FITC toe aan de pellet, draai vervolgens vortex en incubeer gedurende 30 minuten in het donker.
Na de incubatie, was de cellen twee keer met 4 milliliter van 1x permeabilisatiebuffer, centrifugeer na elke wasbeurt en gooi het supernatant weg. Voeg 350 microliter PBS toe aan de celkorrel voor monsters die direct bij de flowcytometer kunnen worden verkregen en 250 microliter PBS aan de celkorrel voor monsters die met Hoechst moeten worden geïncubeerd voor DNA-kleuring. Bereid Hoechst en PBS-oplossing voor en voeg deze aan elk monster toe, zodat de uiteindelijke concentratie twee microgram per milliliter bedraagt.
Vortex en incubeer de monsters gedurende 15 minuten in het donker. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende vijf minuten en voeg 350 microliter PBS toe aan de celkorrel. Open de software en maak verschillende groepen die overeenkomen met de verschillende organen die moeten worden geanalyseerd door te klikken op Groep maken "in het lintgedeelte van de werkruimte.Open de software en maak verschillende groepen die overeenkomen met de verschillende organen die moeten worden geanalyseerd door te klikken op Groep maken" in het lintgedeelte van de werkruimte.
Open het gewijzigde groepsvenster door te dubbelklikken op de groepsnaam en synchroniseer de nieuw gemaakte groepen door een vinkje in te voegen op de gesynchroniseerde functie. Sleep elk FCS-bestand naar de bijbehorende groep en maak vervolgens een gatingstrategie die begint met de a-LN-groep. Open het grafiekvenster door te dubbelklikken op het volledig gekleurde monster om de ongeschonden gebeurtenissen die voor het monster zijn verkregen in een puntplot weer te geven.
Merk op dat de x- en y-as zijn gelabeld zoals in de FCS-bestanden, zoals aangegeven in tabel twee van het flowcytometerinstellingenbestand van dit manuscript. Controleer of er voldoende gebeurtenissen worden weergegeven voor de juiste visualisatie. Open indien nodig voorkeuren door op het hartpictogram in het werkruimtelint te klikken, grafieken te selecteren en vervolgens Dot Plot "als grafiektype" en controleer of het aantal punten dat in het overeenkomstige vak is getekend correct is of wijzig het.
Geef de ungated events in het grafiekvenster weer in een dot plot met DNA-A op de x-as en DNA-W op de y-as. Gebruik lineaire schaal voor beide assen. Verander indien nodig de schaal van logaritmisch naar lineair door op het vakje te klikken dat is aangegeven met een T dicht bij elke as in het grafiekvenster.
Selecteer een enkele celpopulatie door op de rechthoek in het gedeelte gating tool te klikken en dubbelklik vervolgens in het midden van de rechthoekige poort om enkele cellen weer te geven in een dot plot met FSC-A parameter op de x-as en dode cel matrijs op de y-as. Klik op de veelhoek om de levende celpopulatie te selecteren, die negatief zijn voor dode celmatrijs. Dubbelklik in het midden van de polygoonpoort om de cellen in een puntplot weer te geven met de parameter FSC-A op de x-as en de parameter SSC-A op de y-as.
Klik op de rechthoek en maak een ontspannen poort om alle afzonderlijke levende cellen in die grafiek op te nemen. Dubbelklik in het midden van de ontspannen poort om de cellen weer te geven in een dot plot met CD3 op de x-as en CD8 op de y-as. Gebruik de juiste toegangsschaal voor visualisatie in het grafiekvenster.
Wijzig indien nodig de x- en y-schaal door op het vakje te klikken, aangegeven met een T dicht bij elke as, kies Toegangsfunctie aanpassen en wijzig indien nodig extra neg-decennia met bases en positieve decennia. Selecteer de CD3+CD8+cellen door op polygoon te klikken. Dubbelklik in het midden van de CD3+CD8+gate om de cellen weer te geven in een dot plot met Tetr-gag op de x-as en Pent-gag op de y-as.
Selecteer de antigeenspecifieke CD8 T-cellen door op polygoon te klikken. Dubbelklik in het midden van de gag-specifieke poort om de cellen weer te geven in een dot plot met DNA-A op de x-as en Ki67 op de y-as. Selecteer de cellen in de verschillende celcyclusfasen door te klikken op Quad"in het gating tool-gedeelte van het grafiekvenster.
Kopieer de gatingstrategie die in één voorbeeld is gemaakt naar de overeenkomstige groep om de poorten toe te passen op alle voorbeelden van de groep. Kopieer vervolgens gatingstrategieën voor de b-milt- en CBM-groepen, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Controleer of alle poorten geschikt zijn voor elk monster van de drie groepen.
Desynchroniseer indien nodig de groep en wijzig poorten zoals beschreven in het manuscript. Toon de BM-cellen van de ontspannen poort in een dot plot met DNA-A op de x-as en Ki67 op de y-as. Visualiseer de resultaten door te klikken op Lay-outeditor in het lintgedeelte van de werkruimte.
Sleep elke poort van de gatingstrategie in het voorbeeldvenster naar de lay-outeditor en plaats de plots volgens de volgorde van de gating. Wijzig indien nodig het grafiektype door te dubbelklikken op de bijbehorende plot in de lay-out en het juiste type te selecteren in het grafiekdefinitievenster. Klik op de groep en herhaal functies op het lay-outlint om de resultaten te visualiseren die zijn verkregen in antigeenspecifieke CD8 T-cellen van elk orgaan en verschillende monsters te vergelijken.
Visualiseer resultaten van beenmergcellen die een positieve controle vertegenwoordigen. Een typisch voorbeeld van celcyclusanalyse van beenmergcellen wordt hier getoond. Het protocol leverde een lage variatiecoëfficiënt op van G0 tot G1 en G2 tot M DNA-pieken, wat wijst op een uitstekende kwaliteit van de DNA-kleuring.
Een vijfstappenstrategie werd gebruikt om antigeenspecifieke CD8-cellen te identificeren. Twee multimeren werden gebruikt om de gevoeligheid van gag-specifieke CD8 T-celdetectie bij gevaccineerde muizen te verbeteren zonder de kleurachtergrond bij onbehandelde muizen te vergroten. Gag-specifieke CD8 T-cellen in de drainerende lymfeklieren en in de milt bevatten een hoog percentage cellen in de S-G2 / M-fasen op dag drie na de boost.
Bovendien hadden gag-specifieke CD8 T-cellen in de S-G2/M-fasen een hoge FSC-A en SSC-A wanneer ze over de totale CD8 T-cellen van hetzelfde orgaan werden gelegd. Offset histogrammen toonden aan dat cd62l-expressie door gag-specifieke CD8 T-cellen laag was, zoals verwacht voor geactiveerde T-cellen, behalve een paar cellen in G0 in de lymfeklieren. Deze methode is ontworpen voor T-cellen om een uitstekende kwaliteit van DNA-kleuring te bereiken samen met het membraan en Ki67-kleuring.
Flowcytometrie data-analyse is een belangrijk punt. Zorg ervoor dat u de juiste bediening gebruikt voor het plaatsen van poorten. Met behulp van deze methode ontdekten we T-cellen in S-G2 / M-fasen van de celcyclus in muizen en menselijk perifeer bloed.
Deze techniek was nuttig in immunomonitoringstudies bij type 1 diabetes, infectieuze mononucleosis en COVID-19.
Overzicht
Deze studie presenteert een flowcytometrische methode om klonaal expanderende antigeenspecifieke CD8 T-cellen in de milt en lymfeklieren van gevaccineerde muizen te analyseren. De techniek maakt de detectie van T-celresponsen mogelijk zonder de storende effecten van in vivo drugbehandeling of celtransfer.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Flowcytometrie
- T-celbiologie
Achtergrond
- Klonale expansie is essentieel voor antigeenspecifieke T-celresponsen.
- De celcyclus van responderende T-cellen is wegens technische uitdagingen onvoldoende onderzocht.
- Inzicht in de dynamiek van T-cellen is noodzakelijk voor een beter begrip van immuunresponsen.
- Deze studie richt zich op de behoefte aan een methode om T-celresponsen in real-time te analyseren.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het in vivo analyseren van antigeenspecifieke CD8 T-cellen.
- Om inzicht te verschaffen in de proliferatie van T-cellen tijdens immuunresponsen.
- Om de studie naar de dynamiek van T-cellen in verschillende immunologische contexten te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een verse permeabilisatiewasbuffer voor celkleuring.
- Gebruik van het monoklonale antilichaam Ki67 FITC om prolifererende T-cellen te detecteren.
- Flowcytometrische analyse om T-celpopulaties en hun activatietoestanden te beoordelen.
- Gating-strategieën om antigeenspecifieke CD8 T-cellen te isoleren uit gemengde populaties.
Belangrijkste resultaten
- De methode detecteert met succes antigeenspecifieke CD8 T-cellen die betrokken zijn bij actieve responsen.
- De proliferatie van CD8 T-cellen kan nauwkeurig worden gemeten zonder storende variabelen.
- De techniek biedt inzicht in de dynamiek van T-cellen tijdens vaccinatie en infectie.
- De resultaten tonen het nut van deze methode aan bij het bestuderen van auto-immuunziekten en kankerimmunotherapie.
Conclusies
- De ontwikkelde flowcytometrische methode is effectief voor het analyseren van T-celresponsen.
- Deze benadering vergroot het inzicht in immuundynamiek in diverse contexten.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek gebruiken om het gedrag van T-cellen bij gezondheid en ziekte te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode maakt nauwkeurige kwantificering van antigeenspecifieke CD8 T-celproliferatie in vivo mogelijk, waardoor een kritisch hiaat in immuno-monitoring voor de ontwikkeling van vaccins en immunotherapie wordt opgevuld. Door G0-, G1- en S-G2/M-fasen te onderscheiden zonder afhankelijkheid van nucleotideanalogen of kleurstofverdunning, biedt het een mechanisch overzicht van de dynamiek van clonale expansie. Dit ondersteunt doelwitvalidatie en lead-identificatie door antigeeninteractie te koppelen aan functionele proliferatieve toestanden in preklinische modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door antigeenspecificiteit te correleren met de celcyclusprogressie in reagerende T-cellen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare flowcytometrie-uitlezing voor functionele targetvalidatie, onafhankelijk van de beperkingen van BrdU of CFSE.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het kwantificeren van het aandeel antigeenspecifieke T-cellen dat is toegeschreven aan mitose versus die in G1 of G0.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten (DNA-A vs Ki67) die geschikt zijn voor high-throughput screening van vaccinkandidaten of immunomodulatoren.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van Hoechst 33342 voor een hoge resolutie bij het onderscheiden van DNA-pieken, wat een consistente scheiding van G0/G1 en G2/M over verschillende monsters waarborgt.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-orgaananalyse (milt, lymfeklieren, beenmerg) en aanpasbaar aan preklinische soorten voor vergelijking tussen studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Toepasbaar op studies naar vaccinefficiëntie, zoals aangetoond bij HIV-gag vector-gevaccineerde muizen die een S-G2/M verrijking vertoonden in antigeenspecifieke CD8 T-cellen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische fase door een kinetisch opgeloste maat voor T-cel-expansie te bieden die voorspellend is voor de omvang van de immuunrespons.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Maakt go/no-go-criteria mogelijk op basis van de proliferatiekinetiek van antigeenspecifieke klonen, waardoor de afhankelijkheid van enkel fenotypische eindpuntmarkers wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van discovery naar prekliniek, waardoor een vroege beoordeling van de proliferatiecapaciteit van T-cellen na immunisatie mogelijk wordt en lead-optimalisatie kan worden geïnformeerd via functioneel immuunprofilering.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door antigeenherkenning (via MHC-multimeer) te koppelen aan de status van de celcyclus, waardoor duidelijk wordt of interactie leidt tot proliferatie of anergie.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve gegevens over de celcyclusdistributie voor het vergelijken van vaccineplatforms of adjuvanteffecten op T-cel-expansie.
- Analytics: Genereert multiparametrische read-outs (DNA-gehalte, Ki67, scatter, antigeenspecificiteit) die statistische vergelijking van proliferatie-indices over verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Koppelingsmogelijkheid aan preklinische validatie door geactiveerde, cyclende T-cel-subsets te identificeren die correleren met protectieve immuniteit in infectie- en kankermodellen.
- Bedrijfbrede hergebruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar immuno-monitoringplatform voor longitudinale studies in pipelines voor auto-immuunziekten, infectieziekten en immuno-oncologie.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door proliferatieve heterogeniteit binnen antigeenspecifieke T-celpopulaties op te lossen.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie via een vaste gating-strategie en Hoechst-gebaseerde DNA-kleuring, waardoor inter-assay variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van immunomodulerende kandidaten mogelijk te maken op basis van functionele T-celkinetiek.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde voortgang door de proliferatieve fractie van antigeenspecifieke T-cellen te kwantificeren als biomarker voor responskwaliteit.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in multicolor flowcytometrie, inclusief compensatiecontroles voor FITC-Ki67- en Hoechst-signalen.
- Vereist toegang tot een flowcytometer die in staat is tot UV-excitatie voor de detectie van Hoechst 33342 en passende filtersets.
- Vraagt om gestandaardiseerde permeabilisatie- en wasprotocollen om de epitope-integriteit van Ki67, multimeren en oppervlaktemarkers te behouden.
- Omvat optimalisatie van de Hoechst-concentratie (2 µg/mL) en incubatietijd om cytotoxiciteit te vermijden en tegelijkertijd een optimale DNA-piekresolutie te bereiken.
- Is afhankelijk van een correcte gating-hiërarchie, beginnend met de uitsluiting van singlets en dode cellen, om een nauwkeurige identificatie van antigene-specifieke T-cellen te garanderen.
