Evaluatie van de impact van hydraulische breuk op stromen met behulp van microbiële moleculaire handtekeningen

Dit protocol kan worden gebruikt om de vraag te beantwoorden of en hoe hydraulische breuk bacteriën in nabijgelegen beken en bij uitbreiding de beken zelf beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het holistische karakter ervan, omdat het de onderzoeker van monsterverzameling tot en met data-analyse brengt. Jeremy Chansee, een bio-informaticus in mijn laboratorium, Sydney Regal, een niet-gegradueerde student aan het Juniata College, en Gillian Leister, mijn laboratoriummanager, demonstreren de procedure.

Om sedimentmonsters te verzamelen voor nucleïnezuurextractie, gebruikt u handschoenen om een afgedekte, steriele conische buis van 50 milliliter vanaf de kust in het stroomwater onder te dompelen. Terwijl de buis ondergedompeld is, verwijdert u de dop en gebruikt u de dop om ongeveer drie milliliter sediment van een diepte van één tot drie centimeter in de buis te scheppen. Na het verzamelen van het monster, dumpt u op ongeveer één milliliter na alle water uit de buis en gebruikt u een pipet van 1.000 microliter om drie milliliter DNA / RNA-conserveermiddel aan het monster toe te voegen.

Draai de afgedekte conische buis gedurende vijf seconden om het conserveermiddel grondig te mengen en monster en bewaar het monster op ijs. Bij terugkeer in het laboratorium bewaart u het monster bij min 20 graden Celsius voor 16S DNA-analyse of min 70 graden Celsius voor metatranscriptomics RNA-analyse. Voor het verzamelen van filters vult en leegt u een hele steriele fles van één liter drie keer met beekwater om de fles te conditioneren voordat u de fles nog een laatste keer vult.

Trek op een stabiel oppervlak een volledig volume stroomwater in een steriele luer lock spuit en sluit de spuit aan op een steriel en DNA/RNA vrij polyethersulfonfilter met een diameter van 1,7 centimeter met een poriegrootte van 0,22 micron. Spoel het volledige volume beekwater door het filter. Wanneer het volledige monstervolume op dezelfde manier is gefilterd, trekt u ongeveer 20 milliliter lucht in de spuit en duwt u de lucht door het filter om overtollig water uit het filter te verwijderen.

Gebruik vervolgens een P1000 micropipette om twee milliliter DNA /RNA-conserveermiddel toe te voegen aan de grotere opening van het filter terwijl u het filter horizontaal houdt met de punt van de pipet in de loop van het filter om ervoor te zorgen dat het conserveermiddel het filter binnenkomt. Sluit het filter vervolgens af met strak omwikkelde vierkanten paraffinefilm rond elke opening en plaats het filter in een steriele monsterzak op ijs. Bewaar de filters bij terugkomst van bemonstering voor 16S of voor metatranscriptomische analyse zoals aangetoond.

Voordat u met een monsteroverdracht begint, reinigt u het werkgebied met 10% bleekmiddel en 70% ethanol. Gebruik voor nucleïnezuurextractie uit een sedimentmonster een vlam en ethanol gesteriliseerd metaalgereedschap om ongeveer 250 milligram monster over te brengen in een microcentrifugebuis. Gebruik voor nucleïnezuurextractie uit een filtermonster een 70% ethanol- en vlamgesteriliseerde bankschroef om de filterbehuizing op het steriele oppervlak open te breken en de kern uit de behuizing te verwijderen.

Gebruik een steriel scalpel om aan de boven-, onder- en langs de naad van de kern te snijden en gebruik een steriel pincet om het filtreerpapier te vouwen voordat je het met het scalpel in kleine stukjes snijdt. Plaats vervolgens de filterstukken voorzichtig in een microcentrifugebuis zonder contact te maken met niet-gesteriliseerde oppervlakken. Voor lysis van de cellen in beide soorten monsters, onderwerp de buis met hoge snelheid aan een celverstoorder.

Centrifugeer de monsters na ten minste vijf minuten en breng het supernatant over naar een nieuwe steriele microcentrifugebuis. Voeg lysisbuffer toe aan het supernatant in een één-op-één verhouding en breng de oplossing over naar het meegeleverde filter. Plaats het filter in een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 400 microliter voorbereidingsbuffer toe aan de buis.

Voeg na het centrifugeren 700 microliter wasbuffer toe aan de buis en centrifugeer het filter opnieuw. Voeg na het weggooien van de doorstroom 400 microliter wasbuffer toe aan de buis voor een extra centrifugatie en breng het filter over naar een nieuwe steriele microcentrifugebuis. Om het DNA te elueren, behandelt u het filter gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met 50 microliter DNase/RNase-vrij water.

Plaats in de tussentijd een drie HRC-filter in een opvangbuis en voeg 600 microliter HRC-voorbereidingsoplossing toe. Breng na centrifugeren het filter over in een nieuwe steriele microcentrifugebuis en breng het geïlueerde DNA over naar het filter voor centrifugering. De doorstroming bevat het geëxtraheerde DNA.

Om een DNA 16S RNA-bibliotheek te maken, gebruikt u eerst het vers geëxtraheerde DNA-product voor 16S ribosomale RNA-amplificatie met een standaard PCR-protocol. Meng zeven microliter van het resulterende PCR-product en 13 microliter DNase-vrij water en laad de PCR-oplossing op een 2% agarosegel. Laat de gel vervolgens 60 tot 90 minuten op 90 volt draaien om te controleren op een bandgrootte van 386 basenparen als bewijs van een succesvolle versterking.

Om de DNA 16S ribosomale RNA-bibliotheek te zuiveren, bundel 10 microliter van de PCR-producten die heldere banden en 13 microliter van de monsters opleverden die zwakke banden in een steriele microcentrifugebuis opleverden en laad ongeveer 150 tot 200 nanogram van elk gepoold monster in individuele putten van een nieuwe 2% gel. Nadat u de gel hebt uitgevoerd zoals gedemonstreerd, schraft u de 386 basenpaarbanden uit de gel en gebruikt u een commerciële kit om het DNA te zuiveren. Eluteer vervolgens het gezuiverde DNA met 30 microliter 10 millimolair Tris-hydrochloride en verpak de gezuiverde bibliotheken in droogijs voordat ze worden verzonden voor sequencing van de volgende generatie.

In deze representatieve analyse zouden alle extracties op één na succesvol worden genoemd. Heldere banden waargenomen na PCR-versterking duiden op succes voor het 16S-protocol. 16S-monsters moeten minimaal 1.000 sequenties hebben waarvan er ten minste 5.000 ideaal zijn, terwijl metatranscriptsomische monsters minimaal 500.000 sequenties moeten hebben, waarbij ten minste 2 miljoen ideaal zijn.

Sedimentmonsters van 21 verschillende locaties op 13 verschillende stromen voor 16S en metatranscriptomics-analyse worden getoond. Van die 21 locaties waren er 12 stroomafwaarts van fracking-activiteit en geclassificeerd als hydraulisch frackingpositief, en negen waren ofwel stroomopwaarts van fracking-activiteit of in een stroomgebied waarin fracking afwezig was en geclassificeerd als hydraulisch fracking negatief. Zoals beoordeeld door de PERMANOVA-analyse, suggereert de waargenomen scheiding tussen de positieve en negatieve gegevens over hydraulische breuken dat de hydraulische frackingpositieve monsters werden beïnvloed door fracking.

De belangrijkste willekeurige bosvoorspellers zouden onthullen welke kenmerken het meest essentieel waren voor het correct differentiëren van monsters. Als een taxon door het willekeurige bosmodel als belangrijk wordt geïdentificeerd, kan het antimicrobiële resistentieprofiel in hydraulische frackingpositieve monsters worden vergeleken met zijn profiel in hydraulische frackingnegatieve monsters. Als ze sterk verschillen, zou dat erop kunnen wijzen dat frackingvloeistof met biociden in de stroom terecht is gekomen.

Microben zijn overal, dus besmetting is een belangrijk potentieel probleem met dit soort werk. Vooral de eerste monsteroverdrachtsstappen zijn hier gevoelig voor. Als men geïnteresseerd is in microbiële biologische afbraak of andere stofwisselingen, kan shotgun sequencing van RNA worden gebruikt om actieve microbiële genexpressie te onderzoeken.

Deze techniek maakt de standaardisatie van moleculaire technieken voor het onderzoeken van in-situ bacteriële gemeenschappen mogelijk, evenals bio-informatica-analyses van bacteriële sequentiegegevens.