Fecale (micro) RNA-isolatie
October 28th, 2020
Dit protocol isoleert totaal RNA van hoge kwaliteit uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Een commerciële miRNA-isolatiekit wordt gebruikt met aanzienlijke aanpassing om zuiver RNA te isoleren met geoptimaliseerde kwantiteit en kwaliteit. De RNA-isolaten zijn goed voor de meeste downstream RNA-assays zoals sequencing, micro-array en RT-PCR.
We presenteren een protocol voor het isoleren van RNA uit fecale monsters om microRNA's te bestuderen. Dit protocol kan worden gebruikt om RNA met hoge kwaliteit en kwantiteit uit ontlasting te isoleren. Het minimaliseert RNA's van levende microben.
Het is belangrijk om te benadrukken dat de bindingsbuffer niet wordt gebruikt in dit protocol. Dit protocol is eenvoudig en rechttoe rechtaan. Begin door 25 tot 100 milligram fecale monsters te resuspenderen in 600 microliter steriele 1X DPBS in een microcentrifugebuisje van twee milliliter.
Incubeer de buis met het monster op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Maal vervolgens het mengsel met een pipettetip van één milliliter en vortex goed. Resuspendeer het mengsel in een homogenisator met een instelling voor één cyclus van 4.000 rotaties per minuut gedurende 45 seconden om de kwantiteit en kwaliteit van RNA te optimaliseren en te verhogen.
Voeg 600 microliter zure fenol chloroform-oplossing toe aan het monster en vortex het mengsel gedurende 60 seconden. Of, om een grotere hoeveelheid RNA in de opbrengst te optimaliseren, meng het met een homogenisator. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 10.000 x g bij kamertemperatuur om de waterige en organische fase te scheiden.
Herhaal de centrifugatie totdat de interface compact is. Breng de bovenste waterige fase voorzichtig over zonder de onderste fase te verstoren naar een nieuw microcentrifugebuisje van twee milliliter met een scharniersluiting. Voeg ACS-graad 100% ethanol toe bij 1,25 x het volume van de verkregen waterige fase en vortex gedurende drie seconden.
Plaats de filtercartridge in de opvangbuisjes. Laad 600 microliter van elk van de monsters in de filtercartridge die wordt geleverd in de microRNA-isolatiekit. Centrifugeer gedurende 90 seconden bij 10.000 x g om het mengsel door de cartridge te filteren.
Gooi vervolgens het filtraat weg. Herhaal dit totdat het hele volume van het mengsel in opeenvolgende toepassingen door dezelfde filtermembraan is gefilterd. Nadat al het monster is gefilterd.
voeg 700 microliter microRNA-wasoplossing 1 toe aan dezelfde filtercartridge. Centrifugeer gedurende 60 seconden om de wasoplossing door de filtercartridge te filteren. Gooi het filtraat weg en plaats de filtercartridge op dezelfde opvangbuis.
Was de filtercartridge met 700 microliter wasoplossing 2/3 bereid in ACS-graad 100% ethanol en centrifugeer gedurende een minuut bij 10.000 x g. Gooi het verkregen filtraat weg en plaats de filtercartridge in dezelfde buis. Was de filtercartridge met 500 microliter wasoplossing 2/3 en centrifugeer gedurende een minuut bij 10.000 x g.
Gooi het verkregen filtraat weg en plaats de filtercartridge in dezelfde opvangbuis. Was de filtercartridge met 250 microliter wasoplossing 2/3 bereid in ACS-graad 100% ethanol en centrifugeer gedurende een minuut bij 10.000 x g. Gooi het verkregen filtraat weg en plaats de filtercartridge in dezelfde opvangbuis.
Ten slotte breng de filtercartridge over in een nieuwe opvangbuis en draai de constructie vijf minuten om de resterende vloeistof te verwijderen. Breng de filtercartridge over in een nieuwe opvangbuis en voeg vervolgens 50 microliter nuclease-vrij water toe aan het midden van de filter en sluit de buis. Incubeer de buis gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
Draai vervolgens de buis gedurende vijf minuten bij 8.000 x g om het RNA te herstellen in een nieuwe opvangbuis. Een op chip gebaseerde elektroforese-assay van RNA suggereert dat representatieve RNA-isolaatjes uit muis- en menselijke ontlasting laag zijn in of ontbreken van 18S en 28S rRNA-samenstellingen en de grootte van RNA-isolaatjes valt in het kleine RNA-gebied. Een verdere kleine RNA-elektroforese met de op chip gebaseerde elektroforese toonde aan dat een groot deel van de RNA's van microRNA-grootte is.
De zuiverheid van het geëxtraheerde RNA was hoog, zoals aangegeven door de absorptie-verhouding van 2,0 voor 260 en 280-nanometer golflengten en een verhoudingswaarde van 1,8 voor absorptie bij 260 en 230 nanometer. Om het succes van de organische extractie te garanderen, zorg ervoor dat de gezichten duidelijk zijn en breng alleen de bovenste waterige fase over zonder de onderste fase te verstoren, zelfs ten koste van een verminderd volume van onze waterige fase.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol presenteert een eenvoudige methode voor het isoleren van hoogwaardig RNA uit fecale monsters, waarbij de besmetting door levende microben tot een minimum wordt beperkt. Het is ontworpen voor zowel dierlijke als menselijke proefpersonen, waardoor een geoptimaliseerde opbrengst en zuiverheid wordt gegarandeerd voor downstream-toepassingen.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Microbiologie
- Moleculair Biologie
Achtergrond
- Isolatie van RNA uit fecale monsters is cruciaal voor het bestuderen van microRNA's.
- Traditionele methoden kunnen leiden tot besmetting door microbieel RNA.
- Hoogwaardig RNA is essentieel voor nauwkeurige downstream-assays.
- Dit protocol past een commercieel miRNA-isolatiekit aan voor betere resultaten.
Doel van het Onderzoek
- Om een betrouwbare methode te bieden voor RNA-extractie uit uitwerpselen.
- Om de kwaliteit en kwantiteit van RNA-isolaten te verbeteren.
- Om onderzoek naar microRNA's in verschillende biologische contexten te faciliteren.
Gebruikte Methoden
- Resuspensie van fecale monsters in steriele 1X DPBS.
- Gebruik van een microcentrifugebuisje van twee milliliter voor verwerking.
- Aanpassing van een commerciële miRNA-isolatiekit.
- Minimalisatie van RNA-besmetting door levende microben.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van hoogwaardig totaal RNA uit fecale monsters.
- Geoptimaliseerd protocol levert RNA op dat geschikt is voor sequencing en RT-PCR.
- Aangetoonde effectiviteit in het verminderen van microbiële RNA-besmetting.
- Protocol is eenvoudig en duidelijk voor onderzoekers.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor RNA-extractie uit fecale monsters.
- Hoogwaardig RNA is cruciaal voor downstream-toepassingen.
- Aanpassingen aan commerciële kits kunnen de opbrengst en zuiverheid van RNA verbeteren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity RNA from fecal samples enables mechanistic de-risking in target validation by providing access to host-derived microRNAs without microbial contamination. This supports predictive confidence in biomarker discovery and pathway analysis for gastrointestinal and systemic diseases. The protocol’s scalability and reproducibility facilitate enterprise reuse across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host microRNA signatures in feces for therapeutic hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing confounding signals from living microbes in sample preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces RNA isolates suitable for sequencing, RT-PCR, and microarray applications, enabling reliable compound screening readouts.
- Operational Value: Standardized washing steps and phase separation ensure reproducibility and scalability for high-throughput assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by yielding disease-relevant small RNA profiles from animal and human fecal models.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with consistent RNA quality and quantity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical validation by providing a standardized input for omics and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by isolating host-derived RNA from complex fecal matrices.
- Screening: Enables assay readiness through high-yield, pure RNA outputs compatible with downstream analytical platforms.
- Analytics: Delivers quantitative RNA measurements with high purity (A260/A280 ~2.0, A260/A230 ~1.8) for accurate condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via species-agnostic application in mouse and human models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for fecal RNA isolation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced microbial contamination and enhanced target validation in host-microbiome studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via optimized resuspension, washing, and filtration steps.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker-driven programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reliable RNA-derived data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and phase separation techniques to avoid interphase disruption.
- Dependent on centrifugation equipment capable of 10,000 x g and homogenization at 4,000 rpm for sample processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample mass limits (25–200 mg) to ensure consistent aqueous phase recovery.
- Adaptation considerations include adjusting wash volumes and incubation times for varying sample types and inhibitor loads.
- Practical limitation: samples exceeding 200 mg may compromise phase separation and RNA purity due to interface instability.
