Name: Zandvlieg (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection voor CRISPR/Cas9 Mutagenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Leer CRISPR/Cas9-mutagenese in zandvliegen via embryomicro-injectie. Dit protocol toont embryo-verzameling, injectie, kweken en mutatie-identificatie voor genetisch onderzoek naar vectorbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Vanessa Meldener-Harrell voor het kritisch lezen van het manuscript.

Het gebruik van muizen als bloedbron voor zandvliegvoeding werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH). Het protocol is goedgekeurd door de Commissie Dierverzorging en Gebruik van het NIAID, NIH (protocolnummer LPD 68E). Ongewervelde dieren vallen niet onder de NIH-richtlijnen.
1. Naaldvoorbereiding (Figuur 1)
<ol><li>Trek naalden en schuine kanten zoals beschreven in Meuti en Harrell19. Trek kort naalden op een tweetraps glazen micropipettrekker, met behulp van borosilicaatglas haarvaten.</li>
	<li>Slijp de naalden door nat af te schuinen op de micropipet beveller, met behulp van een extra fijne steen.</li>
</ol>2. Embryoverzameling en micromanipulatie (figuur 2)
<ol><li>Vijf dagen voor de dag van injectie, bloedvoer zand vliegen vrouwtjes zoals routinematig uitgevoerd voor kolonie onderhoud. Voor meer informatie over de opfokprocedures van zandvliegkolonies en het vereiste materiaal, raadpleegt u Lawyer et al.1 Onderhoud de insecten in incubators bij 70% vochtigheid en 26 °C, tijdens hun hele ontwikkeling.<ol>
<li>Op een dag na het bloeden, vangen bloed gevoede vrouwtjes door groepen van 100-150 in gipsen potten met een zijpoort. Onderhoud de vrouwtjes door ze te voeden met suikeroplossing (30% sacharose - genoeg volume om een kleine katoenen bal te weken) wat gebruikelijk is voor kolonieonderhoud.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bevochtig de gipspotten NIET op dag 2-3 na het bloeden. Door de vrouwtjes op een droog substraat te houden, voorkomt u voortijdige eierlegging, omdat vrouwtjes liever eieren leggen op een vochtige omgeving.</li>
	<li>Voer op dag 5 na bloedvoeding de embryoverzameling, micromanipulatie en micro-injection uit. Breng een vochtig filterpapier in de legkamer. Vers gelegde embryo's hebben geen volledig ontwikkeld koraal en lijken wit. Gebruik zwart filterpapier tijdens de procedure om het visualiseren van de witte embryo's te vergemakkelijken.</li>
	<li>Breng een kleine groep vrouwtjes over van de gipspot naar de eierlegkamer via de zijpoorten met behulp van een mondaspirator. De aanwezigheid van een vochtig substraat (het filterpapier) induceert vrouwtjes tot legboor.</li>
	<li>Haal na 30-60 minuten het filterpapier met nieuw gelegde embryo's voorzichtig uit de kamer. Bewaar het filterpapier en de embryo's maximaal 3 uur in een petrischaaltje. Beoordeel gedurende deze tijd regelmatig het vochtgehalte van het filterpapier om ervoor te zorgen dat het vochtig blijft. Herhaal gedurende deze tijd stap 2.4 tot 2.6 met nieuwe groepen vrouwtjes en verzamel zoveel mogelijk embryo's.</li>
	<li>Bereid microscoopglaasjes voor op de injectie: verzamel de eieren handmatig één voor één met een zeer fijne kwast en breng ze voorzichtig over op een ander stuk vochtig zwart filterpapier dat op een microscoopschuif is geplaatst, bedekt met een glazen afdeklip.<ol>
<li>Voeg water toe aan het filterpapier, genoeg om de embryo's vochtig te houden, maar niet om ze weg te laten drijven van de afdeklip of onder de afdeklip te worden gezogen. Zet de embryo's op een rij tegen de afdeklip. De afdeklip fungeert als een backstop die voorkomt dat de eieren wegrollen tijdens de injectie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Embryo-injecties (figuur 3)
<ol><li>Start injecties 2,5 tot 3 uur na het begin van de eierverzameling. Voer injecties uit bij kamertemperatuur en luchtvochtigheid in het laboratorium.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de uitgelijnde embryo's voldoende water hebben, zodat ze vochtig worden gehouden. OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de embryo's vochtig worden gehouden tijdens injecties. Als ze tijdens het injectieproces niet vochtig zijn, worden injecties moeilijk omdat de naald moeite heeft met het doorboren van het embryo. De juiste hoeveelheid water is het punt waarop de embryo's een meniscus van water om zich heen hebben, maar de deklip drijft niet bovenop het water waardoor de embryo's onder de afdeklip duwen. Het is van cruciaal belang om de hoeveelheid water rond de embryo's tijdens injecties te controleren. Voeg indien nodig water toe om de embryo's vochtig te houden.</li>
	<li>Voeg voorzichtig water toe door een borstel met water te bevochtigen en het water naar de achterkant van het filterpapier over te brengen. Door op deze manier water toe te voegen, kan water op een langzame en gecontroleerde manier worden toegevoegd, zodat net genoeg wordt toegevoegd om de embryo's vochtig te houden. Te veel water kan ervoor zorgen dat de embryo's uit de uitlijning zweven, waardoor het moeilijk is om de embryo's te injecteren.</li>
	<li>Rugbelasting injectiemix in de micro-injectienaald. Voeg ongeveer 0,5 tot 1 μL injectiemengsel toe aan de naald met behulp van een handgetekende borosilicaatnaaldvuller, gellaadpipettips kunnen ook worden gebruikt. De injectiemix bestaat uit een of meer geleide-RNA (elk 80 ng/μL) die is ontworpen om zich te richten op een specifieke locus gemengd met commercieel recombinant Cas9-eiwit (300 ng/μL).</li>
	<li>Vanaf de injectiedruk bij 30 psi drukt u op de injectietrigger om lucht uit de punt van de naald te verdrijven. Hierdoor wordt de injectiemix naar de punt van de naald geforceerd, waardoor de injectiemix kan stromen. Verhoog op dit punt langzaam de hold/constante druk totdat het injectiemateriaal begint te stromen en trek vervolgens de hold/constante druk terug zodat deze net onder het punt van de injectiemix uit de naald stroomt. De gated setting moet net genoeg injectiemateriaal leveren, zodat een kleine hoeveelheid materiaal in het embryo kan worden gezien. OPMERKING: Injectie van zandvliegembryo's onder halokoolstofolie vergelijkbaar met andere protocollen die worden gebruikt voor Drosophila en muggen werd aanvankelijk getest, maar het overlevingspercentage voor deze injecties was zeer laag. De overleving werd verbeterd door over te schakelen op injecties op vochtig filterpapier zoals hierboven beschreven.</li>
	<li>Steek de naald in de zijkant van het embryo. Gebruik de deklip achter het embryo als een backstop die de naald zal helpen om het embryo te doorboren. Breng een kleine hoeveelheid injectiemix aan in het embryo voordat u de naald voorzichtig verwijdert.</li>
	<li>Druk onmiddellijk na het verwijderen van de naald op de injector om eventueel opgevuld materiaal van de naaldpunt te verwijderen. Dit helpt om verstopping van de naald te voorkomen.</li>
	<li>Ga naar het volgende embryo. Zorg er tussen elke injectie voor dat het filterpapier vochtig is en dat de naald niet verstopt is.</li>
	<li>Zodra alle embryo's zijn geïnjecteerd, telt u het aantal geïnjecteerde embryo's om een lopende telling bij te houden.</li>
	<li>Verwijder de afdeklip door water aan het filterpapier toe te voegen, zodat de afdeklip drijft. Gebruik op dit punt een sonde (houten applicatorstok met insectenpen aan de punt gelijmd) om het filterpapier op zijn plaats te houden terwijl een vinger wordt gebruikt om de deklip weg te trekken van de geïnjecteerde embryo's.</li>
	<li>Vlek overtollig water van het filterpapier weg zodra de afdeklip is verwijderd.</li>
</ol>4. Opfok na injectie (G0) (figuur 4)
<ol><li>Breng het filterpapier over met de embryo's bovenop verschillende lagen vochtig filterpapier dat in een petrischaal is geplaatst om de vochtigheid te behouden. Bewaar de embryo's hier gedurende de tijd die nodig is om andere embryo's te injecteren. Embryo's kunnen maximaal 3 uur op deze plaats worden gehouden. Na injectie worden ze langzaam bruin.</li>
	<li>Zodra alle embryo's zijn geïnjecteerd, breng je ze handmatig over op eerder bevochtigde gipspotten van kleine omvang. Doe niet te veel embryo's in elke pot en houd afstand tussen hen, om mogelijke schimmelbesmetting tussen individuen te voorkomen. Bedek de potten met een scherm en bewaar ze zoals typisch zou worden gedaan voor zandvliegkolonie-eieren, onderhouden in incubators bij 70% vochtigheid en 26 °C, tijdens hun hele ontwikkeling.</li>
	<li>Verwijder op dag 1 na de injectie alle beschadigde en dode embryo's met een penseel. Voeg 100 μL propionzuur van 0,5% druppel voor druppel toe aan de gipspotten met de geïnjecteerde embryo's om schimmelverontreiniging te beperken. Het vrijkomen van cytoplasma uit embryo's die tijdens het injectieproces zijn beschadigd, is bijzonder gunstig voor schimmelgroei.</li>
	<li>Controleer elke dag de gipspotten en verwijder eventuele slechte of dode embryo's. Als schimmel aanwezig is, verwijder dan alle geïnfecteerde embryo's en voeg een paar druppels propionzuur van 0,5% toe.</li>
	<li>Larven komen uit tussen dag 8 en 12 na injectie. Breng twee keer per dag de nieuw ontstane larven over op nieuwe gipspotten, in groepen van maximaal 5-10. Voeg een kleine hoeveelheid voedsel toe en controleer het voedsel 2-3 keer per week.<ol>
<li>Controleer zorgvuldig de hoeveelheid larvaal voedsel, omdat te veel het risico op schimmelbesmetting aanzienlijk verhoogt. Zandvlieglarven overleven beter in groepen, maar ze kunnen kannibalistisch zijn als er niet genoeg voedsel is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer de larven verpoppen, scheidt u ze per geslacht om de vrouwtjes als maagden te behouden. Als er veel overlevenden zijn, gooi dan de mannetjes weg en houd alleen de vrouwtjes. OPMERKING: Zowel mannetjes als vrouwtjes kunnen mutaties dragen en overbrengen. Omdat vrouwtjes echter maagden moeten worden gehouden voordat ze moeten worden gekruist, is het gemakkelijker om alleen de G0 geïnjecteerde vrouwtjes te gebruiken om te voorkomen dat ze wt-insecten per geslacht moeten scheiden. De G0-mannetjes kunnen als back-up worden bewaard als het aantal volwassen overlevenden laag is en zullen in dit geval worden gepaard met gesorteerde wt maagdelijke vrouwtjes.</li>
</ol>5. Selectie en screening van gemuteerde allelen (Figuur 5)
<ol><li>Steek de G0-vrouwtjes massaal over met wt-mannetjes in een kooi. Voer ze helemaal, zoals zou worden gedaan voor normaal kolonieonderhoud.</li>
	<li>Breng op een dag na bloedvoeding elke G0-vrouw met 2-3 wt-mannetjes over in individuele gipsbuizen met behulp van een mondaspirator. Voed de vliegen met suiker op een kleine wattenbol die elke dag wordt verschoond en gebruik een spuit water om ervoor te zorgen dat het gipsvocht geschikt is voor het leggen van eieren.</li>
	<li>Nadat de G0-vrouwtjes eieren hebben gelegd (overeenkomend met G1),verzamelen ze hun lichaam in individuele, geannoteerde Eppendorf-buizen voor latere genotypering. Onderhoud de embryo's zoals gewoonlijk gedaan voor wt kolonies.</li>
	<li>Haal het DNA uit de G0-vrouwtjes volgens de methode naar keuze.</li>
	<li>Screen het DNA op de aanwezigheid van mutaties, bijvoorbeeld door een PCR-test te ontwerpen met primers rond het gebied van verwachte CRISPR-sneden.</li>
	<li>Houd alleen de G1 embryo's gelegd door G0 vrouwtjes die bewijs van transformatie vertonen. Wanneer deze G1 embryo's zich ontwikkelen tot poppen, scheid ze dan naar geslacht en houd alleen de vrouwtjes. Kruis de G1-vrouwtjes van hetzelfde G0-vrouwtje naar wt-mannetjes, voer ze met bloed en breng ze vervolgens over in kleine groepen van 2-3 vrouwtjes en 4-5 mannetjes in kleine containers. OPMERKING: Alle G1-individuen hebben een kans om een unieke mutatie te dragen, dus als het aantal overlevende individuen niet te hoog is, is het beter om G1-vrouwtjes individueel met wt-mannetjes te kruisen. Het geval van verschillende vrouwtjes die een andere mutatie in dezelfde buis dragen, is zeldzaam, maar kan voorkomen. Als een dergelijk geval wordt waargenomen na genotypering, moeten de G2-nakomelingen vervolgens individueel worden gedekt om mannetjes te wten. Dit paringsschema vermijdt de mogelijkheid van meerdere mutaties in het nageslacht.</li>
	<li>Verzamel na het leggen van eieren de G1 vrouwelijke lichamen en screen ze op mutaties. Bewaar alleen de buizen waar ten minste één vrouw bewijs van mutatie vertoonde.</li>
	<li>Maak voor latere generaties enkele paar in-crosses. Screen ouders na het leggen van eieren op aanwezigheid van mutatie. Herhaal dit bij elke generatie totdat beide ouders homozygoot zijn voor dezelfde mutatie. Eenmaal geïdentificeerd, zullen ze de oprichters zijn van een homozygoot mutantenbestand.</li>
</ol>

<ol><li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42(2017).</li>
<li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9%3A+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li>
<li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li>
<li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098(2008).</li>
<li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542(2009).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li>
<li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li>
<li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies%3A+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li>
<li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62(2009).</li>
<li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486(2011).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li>
<li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769(2018).</li>
<li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651(2020).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008(2018).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+%28Bemisia+tabaci%29%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li>
<li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes+and+Genetics+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li>
</ol>

We presenteren hier een recent ontwikkelde embryomicro-injectiemethode voor gerichte mutagenese door CRISPR/Cas9 in Phlebotomus papatasi zandvliegen. Embryomicro-injection voor genetische modificatie van insecten werd ontwikkeld in Drosophila in het midden van de jaren 198021 en wordt nu routinematig gebruikt bij een grote verscheidenheid aan insecten. Andere methoden voor de levering van genetisch modificatiemateriaal zijn ontwikkeld voor gebruik bij insecten, zoals ReMOT<sup cl...

Vector-overgedragen ziekten zijn een grote bedreiging voor de volksgezondheid in constante evolutie. Honderden vectorsoorten verspreid over zeer verschillende fylogene families (bijv. muggen, teken, vlooien) zijn verantwoordelijk voor de overdracht van een groot aantal microbiële pathogenen, wat volgens de Wereldgezondheidsorganisatie resulteert in meer dan 700.000 menselijke sterfgevallen per jaar. Onder vectorinsecten vormen flebotominezandvliegen (Diptera, Psychodidae) een enorme groep, met 80 bewezen vectorsoorten die verschillende fenotypische eigenschappen en vectoriële capaciteiten vertonen die in verschillende geografische regio's worden aangetroffen. Het zijn vectoren voor de protozoaanse parasieten van het geslacht Leishmania, die ongeveer 1,3 miljoen nieuwe gevallen van Leishmaniases en tussen de 20.000 en 30.000 sterfgevallen per jaar veroorzaken. De klinische resultaten van Leishmaniases zijn divers, met symptomen variërend van zelfbeperkende cutane laesies tot viscerale verspreiding die fataal is bij afwezigheid van behandeling.
Zandvliegen zijn strikt terrestrische insecten. Hun levenscyclus, relatief lang in vergelijking met andere Diptera, duurt maximaal drie maanden, afhankelijk van verschillende parameters zoals temperatuur, vochtigheid en voeding. Het bestaat uit één embryonaal stadium (6 tot 11 dagen), vier larvale stadia (die in totaal 23 tot 25 dagen duren) en één popstadium (9 tot 10 dagen) gevolgd door metamorfose en vervolgens volwassenheid. Zandvliegen vereisen een vochtige en warme omgeving voor de opfok. Zowel mannetjes als vrouwtjes voeden zich met suikers, in het wild verkregen uit bloemnectars. Alleen vrouwtjes zijn bloedvoeders, omdat ze eiwitten nodig hebben die zijn verkregen uit het bloedmeel voor de productie van eieren1.
Een belangrijk aandachtspunt van onderzoek is het identificeren van de aard van de vector/parasiet interacties die leiden tot de ontwikkeling van overdraagbare infecties. Net als bij andere vectorinsecten is aangetoond dat parameters die inherent zijn aan zandvliegen van invloed zijn op hun vectorcompetentie, die wordt gedefinieerd als hun vermogen om ziekteverwekkers naar hun gastheren te dragen en over te dragen. Bijvoorbeeld, de uitdrukking van galectines door de Phlebotomus papatasi zandvlieg midgut cellen, die fungeren als receptoren die parasietoppervlakcomponenten herkennen, kunnen hun vectorcompetentie voor Leishmania major2,3direct beïnvloeden . De insect immuunrespons route, Immune Deficiency (IMD), is ook cruciaal voor de Phlebotomus papatasi zandvlieg vector competentie voor Leishmania major4. Een cruciale rol voor vector insect immuunresponsroutes bij het beheersen van hun overdracht van infectieuze pathogenen is op dezelfde manier gemeld bij Aedes aegypti muggen5,6,7, in de tseetseevlieg Glossina morsitans8, en in Anopheles gambiae muggen9,10.
Studies van zandvlieg /Leishmania interacties zijn beperkt door het ontbreken van genexpressiemodificatiemethoden aangepast voor gebruik bij deze insecten. Tot voor kort werden alleen gen downregulatie door klein interfererend RNA (siRNA) uitgevoerd11,12,13,14. De techniek, beperkt door de mortaliteit geassocieerd met de micro-injection van volwassen vrouwtjes, leidt slechts tot een gedeeltelijk verlies van functie, dat niet van generatie op generatie kan worden overgedragen.
CRISPR/Cas9-technologie heeft een revolutie teweeggebracht in functioneel genomisch onderzoek in niet-modelorganismen zoals zandvliegen. Aangepast van het adaptieve immuunsysteem in prokaryoten voor verdediging tegen bacteriofagen15,16, is het CRISPR Cas9-systeem snel aangepast als een genoombewerkingstool voor superieure eukaryotische organismen, waaronder insecten. Het principe van CRISPR/Cas9 gerichte genoombewerking is gebaseerd op de complementariteit van een enkele guide RNA (sgRNA) tot een specifieke genomische locus. De Cas9 nuclease bindt zich aan de sgRNA en creëert een dubbelstrengs DNA (dsDNA) breuk in het genomische DNA waar de sgRNA associeert met zijn complementaire sequentie. Het Cas9-sgRNA-complex wordt door 17 tot 20 complementaire bases in de sgRNA naar de gekozen locus geleid, de dsDNA-breuk kan vervolgens worden gerepareerd door twee onafhankelijke trajecten: niet-homologe eindaanvoeging (NHEJ) of homologie-gerichte reparatie (HDR)17. NHEJ-reparatie omvat een eenvoudige sluiting van de onderbreking, maar leidt vaak tot kleine invoeg- / verwijderingsgebeurtenissen. DNA-reparatie via HDR maakt gebruik van een donor-DNA-molecuul dat homologie deelt met het doel-DNA als sjabloon voor reparatie. Insecten bezitten beide machines.
CRISPR/Cas9-technologie kan mutaties genereren in een gekozen locus, via het NHEJ-reparatietraject; of voor complexere genoombewerkingsstrategieën, zoals knock-ins of expressiereporters, via het HDR-traject met een geschikte donorsjabloon. Bij zandvliegen werden null mutante allelen van de immuunresponsfactor Relish gegenereerd via NHEJ-gemedieerde CRISPR in Phlebotomus papatasi4. Zandvliegembryo's werden ook geïnjecteerd in een andere studie met een CRISPR/Cas9-mix gericht op het gen dat codeert voor Geel. Toch werden er geen volwassenen geproduceerd die de mutatie droegen18. We beschrijven hier een gedetailleerde methode van zandvlieg gerichte mutagenese door NHEJ-gemedieerde CRISPR / Cas9, met een bijzondere focus op de embryomicro-injection, een kritieke stap van het protocol.

```html
<table><tbody><tr><td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td><td>VWR</td><td>28342-012</td><td>Snijd in rechthoeken van ongeveer 46 X 22mm. Deze worden tussen de dia en het dekglas geplaatst en fungeren als een vochtige onderlaag voor de embryo's tijdens de injectie.</td></tr><tr><td>Dekglazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Voor het uitlijnen van embryo's</td></tr><tr><td>Glijplaten</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Basislaag van de micro-injectie opstelling Figuur 2A</td></tr><tr><td>Insectenkooi</td><td>Op maat gemaakt of verschillende commerciële opties</td><td></td><td>Polycarbonaat kooi voor het houden en paren van volwassenen Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, en Petr Volf. &ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&rdquo; Parasite 24. Bezocht op 6 augustus 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Larvenvoeding</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>Een mix van konijnenvoer en konijnenuitwerpselen Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, en Petr Volf. &ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&rdquo; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Microcaps 100 ml</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Gebaten voor het terugvullen van micro-injectienaalden</td></tr><tr><td>Mondaspirator</td><td>John W. Hock Company</td><td>Model 612</td><td>mondaspirator met HEPA-filter</td></tr><tr><td>Olympus SZX12</td><td>Olympus Life Sciences</td><td></td><td>Micro-injectiemicroscoop</td></tr><tr><td>Ovipots</td><td>Nalge company</td><td></td><td>Ovipots zijn gemaakt van 125-ml of 500-ml rechtzijdige polypropyleen potten die zijn aangepast door het boren van 2,5 cm gaten in de bodem en gevuld met 1 cm gips van Parijs. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, en Petr Volf. &ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&rdquo; Parasite 24. Bezocht op 6 augustus 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Verfpenseel 6-0</td><td>Elk kunstbenodigdheden bedrijf</td><td>n/a</td><td>Gebaten voor het uitlijnen van embryo's</td></tr><tr><td>Propionzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>antifongisch middel</td></tr><tr><td>Standaard glazen capillairen</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td>Gebaten voor het maken van micro-injectienaalden</td></tr><tr><td>Trio-MPC100 Controller en MP845 Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Micro-injectie Controller en Micromanipulator</td></tr></tbody></table>
```

zandvlieg (phlebotomus papatasi) embryo microinjection voor crispr/cas9 mutagenese

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Zandvliegen zijn de natuurlijke vectoren voor Leishmania-soorten, protozoaanse parasieten die een breed spectrum van symptomen produceren, variërend van cutane laesies tot viscerale pathologie. Het ontcijferen van de aard van de vector/parasiet interacties is van primair belang voor een beter begrip van Leishmania transmissie naar hun gastheren. Onder de parameters die de competentie van de zandvliegvector controleren (d.w.z. hun vermogen om ziekteverwekkers te dragen en over te dragen), bleken parameters die inherent zijn aan deze insecten een sleutelrol te spelen. Insecten immuunrespons, bijvoorbeeld, beïnvloedt zandvlieg vector competentie naar Leishmania. De studie van dergelijke parameters is beperkt door het ontbreken van methoden voor genexpressiemodificatie die zijn aangepast voor gebruik in deze niet-modelorganismen. Gen downregulatie door kleine interfererende RNA (siRNA) is mogelijk, maar naast het feit dat het technisch uitdagend is, leidt het uitschakeling tot slechts een gedeeltelijk functieverlies, dat niet van generatie op generatie kan worden overgedragen. Gerichte mutagenese door CRISPR/Cas9 technologie is onlangs aangepast aan de Phlebotomus papatasi zandvlieg. Deze techniek leidt tot het genereren van overdraagbare mutaties in een specifiek gekozen locus, waardoor de genen van belang kunnen worden bestudeerd. Het CRISPR/Cas9-systeem is gebaseerd op de inductie van gerichte dubbelstrengs DNA-breuken, later gerepareerd door non-homologous end joining (NHEJ) of door Homology Driven Repair (HDR). NHEJ bestaat uit een eenvoudige afsluiting van de pauze en leidt vaak tot kleine invoeg-/verwijderingsgebeurtenissen. HDR gebruikt daarentegen de aanwezigheid van een donor-DNA-molecuul dat homologie deelt met het doel-DNA als sjabloon voor reparatie. Hier presenteren we een zandvliegembryomicro-injectiemethode voor gerichte mutagenese door CRISPR/Cas9 met behulp van NHEJ, de enige genoommodificatietechniek die tot nu toe is aangepast aan zandvliegvectoren.

Het CRISPR/Cas9 micro-injection protocol dat hier wordt beschreven om zandvliegmutanten te genereren, werd vastgesteld in een eerdere publicatie4. Deze aanpak produceerde zeer efficiënte mutagenese, omdat 11 van de 540 individuen de procedure overleefden, waarvan er 9 mutant waren. Bij het ontwerpen van handleidingen voor CRISPR/Cas9-mutatie is een cruciale eerste stap het opeenvolgen van het gebied rond het te richten gebied. Het sjabloon voor sequencing moet afkomstig zijn van de stam die zal wo...

Dit protocol beschrijft de stappen van CRISPR/Cas9 gerichte mutagenese bij zandvliegen: embryoverzameling, injectie, insectenopfok en identificatie, evenals selectie van mutaties van belang.

Zandvlieg (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection voor CRISPR/Cas9 Mutagenese

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Gentargete mutagenese is pas recent aangepast voor zandvliegen en is een cruciale techniek voor het begrijpen van de rol en functie van interessante genen in deze vectorinsecten. Embryo-microinjectie is een zeer belangrijke stap in het bewerken van het insectengenoom, maar het moet worden aangepast aan de soorten waarmee je werkt, in ons geval zandvliegen. Vergeleken met andere insectensoorten zijn embryo's van zandvliegen erg klein.Het duurt lang om zich te ontwikkelen en zijn bijzonder gevoelig voor het vochtniveau. Vijf dagen voor de injectie, voer vrouwelijke zandvliegen met bloed, zoals voor routineonderhoud van de kolonie. Een dag na het voeren, vangt u de met bloed gevoede vrouwtjes in gipsen pods met een zijpoort in groepen van 100 tot 150 en voer de vliegen met een 30% sucrose-oplossing.Op dag vijf na het bloedvoeren, plaatst u een wit stuk vochtig filterpapier in de eierlegkamer. En gebruik een mond-aspirator om ongeveer 10 vrouwtjes van de gipsen pod naar de eierlegkamer te verzamelen en over te brengen. Na 30 tot 60 minuten, verwijdert u de Petri-schaal en het filterpapier uit de eierlegkamer.Zorg ervoor dat het filterpapier vochtig blijft en verzamel gedurende deze periode doorgaans nieuwe groepen vrouwtjes en embryo's. Wanneer alle embryo's zijn verzameld, gebruikt u een stereomicroscoop en een zeer fijne verfpens om voorzichtig ongeveer 50 embryo's over te brengen naar afzonderlijke stukken vochtig zwart filterpapier, plaatst u deze op microscoopglaasjes, bedekt met een enkele deksel per glaasje. Voeg voldoende water toe aan elk filterpapier om de embryo's vochtig te houden zonder te drijven of onder de deksels te worden gezogen en lijn de embryo's uit tegen de deksels.Twee tot drie uur na het begin van de ei-verzameling, plaatst u een schuifje onder een disserterend microscoop en gebruikt u de penseel om voorzichtig water toe te voegen aan het achtereinde van het filterpapier. Laad achteraan 0,5 tot één microliter van de lading injectiemix in een micro-injectienaald en monteer de naald in een pneumatische injectiecontroller, ingesteld op 30 pond per vierkante inch druk onder de microscoop. Druk op de trekker om eventuele lucht uit de naaldpunt te verwijderen.Wanneer de lucht is vrijgekomen, verhoogt u langzaam de houddruk. Wanneer het injectiemateriaal begint te stromen, verlaagt u de houddruk tot net onder het punt waarop de injectiemix uit de naald stroomt en steekt u de naald in de zijkant van het eerste embryo. Gebruik de deksel achter het embryo als achterstop, lever een kleine hoeveelheid injectiemix in het embryo voordat u de naald voorzichtig verwijdert.Onmiddellijk nadat de naald is verwijderd, drukt u op de injector om eventueel teruggevuld materiaal uit de naaldpunt te verwijderen en gaat u naar het volgende embryo. Wanneer alle embryo's zijn geïnjecteerd, telt u het aantal geïnjecteerde embryo's om een loopt totaal bij te houden en voegt u water toe aan het filterpapier zodat de deksel drijft. Gebruik vervolgens een sonde om het filterpapier op zijn plaats te houden terwijl u de deksel van de embryo's trekt.En hij was filterpapier om het overtollige water van de schuifje te deppen. Breng het filterpapier over op een stapel vochtig filterpapier in een nieuwe Petri-schaal en breng elk embryo handmatig over naar bevochtigde, kleine gipsen pods zonder te drukken. Bedek vervolgens de pods met een scherm en bewaar de pods in een 26-graden incubator bij een vochtigheid van 70%.Zoals bij de meeste succesvolle micro-injectieprotocollen, is een goede micro-injectienaald die geschikt is voor de embryo's die worden geïnjecteerd belangrijk. Goede scherpe naalden kunnen gemakkelijk het embryo doorboren zonder dat het materiaal na de injectie kan ontsnappen. De getrokken naalden mogen geen taps toelopende punt hebben die te lang is.Anders wordt het lumen van de naald zeer smal voor een groot deel van de taps toelopende punt, waardoor het moeilijk wordt om de injectiedruk hoog genoeg te krijgen om het materiaal door de naald te forceren. Gezonde embryo's die na de injectie zijn grootgebracht, moeten worden behouden, terwijl beschadigde, met schimmels besmette, uitgedroogde of misvormde embryo's moeten worden weggegooid. Potentiële mutante allelen kunnen worden geïdentificeerd in na de injectie grootgebrachte individuen door PCR-analyse van het gebied rond de verwachte snijvlakken.Na de oprichting van mutante lijnen met behulp van de geïnjecteerde embryo's, maakt genotypering PCR de identificatie van homozygote mutante broers- en zussenkruisingen mogelijk. Het is essentieel om een goede naald te hebben om voorzichtig te manipuleren en de embryo's te injecteren. En om ervoor te zorgen dat de embryo's tijdens de hele procedure gehydrateerd blijven.Genoombewerking bij sommige vliegen is net begonnen. Deze techniek is echt een eerste stap die moet worden gevolgd door meer complexe strategieën voor genoommodificatie.

sand-fly-phlebotomus-papatasi-embryo-microinjection-for-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De mediterrane fruitvlieg (Ceratitis capitata) (Diptera: Tephritidae) is een wereldwijde plaag in de landbouw. Een dieper begrip van zijn biologie is cruciaal voor het beheersen van fruitvliegpopulaties en daarmee het verminderen van de economische impact. Micro-injectie van embryo's is een fundamenteel hulpmiddel dat zowel transformatie van de kiemlijn als reverse genetica studies in deze soort mogelijk maakt.

Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,<em&gt; Middellandse-Zeevlieg</em

Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo's, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.

Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Hier beschrijven we methoden voor efficiënte pop- en volwassen injecties in Nasonia vitripennis als toegankelijke alternatieven voor embryomicro-injectie, waardoor functionele analyse van genen van belang mogelijk is met behulp van RNA-silencing via RNA-interferentie (RNAi) of gen knock-out via CRISPR / Cas9 genoombewerking.

Pupal en volwassen injecties voor RNAi en CRISPR Gen editing in Nasonia vitripennis

Veel kenmerken van insectenesocialiteit zijn afhankelijk van communicatie binnen de kolonie en arbeidsverdeling. Genetische manipulatie van belangrijke regulerende genen in mierenembryo's via micro-injectie en CRISPR-gemedieerde mutagenese geeft inzicht in de aard van altruïstisch gedrag bij eusociale insecten.

Embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in de mier Harpegnathos saltator

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin staan protocollen voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire maïsplanthopperembryo's met als doel hun genoom te wijzigen via CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerking of voor de toevoeging van gemarkeerde transponeerbare elementen door kiembaantransformatie.

Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

Dit artikel presenteert de stapsgewijze protocollen voor CRISPR/Cas9-mutagenese van de Oosterse fruitvlieg Bactrocera dorsalis. Gedetailleerde stappen in dit gestandaardiseerde protocol zullen dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor functionele genstudies in B. dorsalis.

Protocollen voor CRISPR/Cas9 Mutagenese van de Oosterse Fruitvlieg Bactrocera dorsalis

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Leer CRISPR/Cas9-mutagenese in zandvliegen via embryomicro-injectie. Dit protocol toont embryo-verzameling, injectie, kweken en mutatie-identificatie voor genetisch onderzoek naar vectorbiologie.

Zandvlieg (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection voor CRISPR/Cas9 Mutagenese

Meer video's verkennen