3D-celgeprinte hypoxische kanker-op-een-chip voor het samenvatten van pathologische progressie van solide kanker

Hypoxie is een belangrijke aanjager van de ontwikkeling van kanker die genomische instabiliteit en tumorigenese veroorzaakt. We demonstreren een methode voor het genereren van centrale hypoxie in een solide kanker in vitro op basis van 3D-bioprintingtechnologie. Met behulp van deze methode kan een radiohypoxische gradiënt worden gereproduceerd met behulp van een eenvoudige strategie die een 3D-geprinte gasdoorlatende barrière en een glazen afdekking combineert.

Deze hypoxische kanker on-a-chip technologie kan worden gebruikt om de werkzaamheid van geneesmiddelen te voorspellen om het voorschrijven van patiëntenspecifieke geneesmiddelen tegen kanker te vergemakkelijken. En er wordt ook verwacht dat het een snelle diagnose van agressieve kankers mogelijk maakt. Om te helpen bij de bereiding van een drie milliliter geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing, snijd 30 milligram collageen sponzen in een vijf bij vijf millimeter vierkante stukken.

Doe de stukjes in een steriele glazen flacon van 10 milliliter en voeg 2,4 milliliter spuitfilter 0,2 micron normaal zoutzuur toe aan de flacon voor een incubatietijd van drie dagen bij vier graden Celsius en 15 omwentelingen per minuut. Na de spijsvertering, stam alle onverteerd collageen deeltjes door een 40 micron celzeef en bewaar de zure collageenoplossing op vier graden Celsius voor maximaal zeven dagen. Om de pH van de 1%geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing aan te passen, voegt u 30 microliters fenol rode oplossing toe aan een eindconcentratie van 1% en 300 microliter van 10X PBS tot een eindconcentratie van 10%Na mengen en centrifugeren, gebruikt u één normaal natriumhydroxide om de pH tot zeven te neutraliseren, controleert u de kleurverandering en voegt u gedestilleerd water toe om een totaal volume van drie milliliter te verkrijgen.

Bewaar vervolgens de pH-aangepaste 1% geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing op vier graden Celsius voor gebruik binnen drie dagen. Om de gelatie van de geneutraliseerde collageen pre-gel oplossing vooraf te controleren, gebruikt u een pipet met positieve verplaatsing om 50 microliter collageendruppels toe te voegen aan een klein gerecht en de druppels gedurende een uur in een incubator van 37 graden Celsius te incuberen. Controleer aan het einde van de incubatie of het collageen is veranderd van een transparante kleur in een ondoorzichtig wit.

Kantel de container om te bevestigen dat het collageen aan de onderkant van de container is hecht. En giet PBS op de druppel om te bevestigen dat de collageenconstructie niet in oplossing breekt. Voor 3D-afdrukken van een offerende PEVA-mal klikt u op Bestand en slaat u bestandstype op als STL om het 3D CAD-bestand naar een STL-bestand te converteren en klikt u op Optie en uitvoerformulier als ASCII om de G-code te genereren.

Als u het gegenereerde STL-bestand wilt importeren, klikt u op Bestand en opent u het STL-bestand en selecteert u het opgeslagen STL-bestand. Als u automatisch de G-code van de offer-PEVA-mal wilt genereren, selecteert u het segmentmodel van de STL-CAD-wisselaar. Gebruik vervolgens een precisiemondstuk van 50 gauge bij een pneumatische druk van 500 kilopascal bij 110 graden Celsius om de offerende PEVA-mal op een steriele hydrofiele histologieschuif af te drukken.

Om de PDMS-barrière te gieten, mengt u gedurende vijf minuten zes milliliter PDMS-basis elastomeer en 600 microliter uithardingsmiddel in een plastic reservoir en laadt u de homogeen gemengde oplossing in een wegwerpspuit van 10 milliliter. Uitgerust met de spuit met een 20 gauge plastic taps toelopende doseertip en vul de offerENDE PEVA-mal met de gemengde PDMS-oplossing. De gemengde PDMS vult deze offerende PEVA-mal met een bol oppervlak en de barrière zal hoger zijn dan die van de mal.

Nadat u de PDMS-barrière gedurende meer dan 36 uur in een oven van 40 graden Celsius hebt uitgehard om te voorkomen dat de PEVA smelt, gebruikt u een precisie-pincet om de offerende PEVA-mal los te maken en de gasdoorlatende barrière bij 120 graden Celsius in een autoclaaf te steriliseren. Om de oplossing met kankercellen te mengen, resuspendeer elk type verzamelde celkorrel in 20 microliter kweekmedium en voeg een milliliter van 1% geneutraliseerde collageen pre-geloplossing toe aan elk van de geresuspendeerde celsuspensusingen op nat ijs met zachte menging. Gebruik een pipet met positieve verplaatsing om elke celsuspensie te mengen.

Wanneer homogene oplossingen worden verkregen, gebruik dan een positieve wegwerppipet om de inkapselde collageenbioinks van de cel over te brengen in individuele wegwerpspuiten van drie milliliter en bewaar de spuiten op vier graden Celsius tot 3D-celprinten. Voor 3D-printen van kanker-stroma concentrische ringen, converteer het juiste 3D CAD-bestand naar een STL-bestandsformaat en gebruik een STL-CAD-wisselaar om een G-code van de kanker-stroma concentrische ringen te genereren. Laad de cel ingekapselde collageen bioinks in de 3D-printerkop en stel de temperatuur van de kop en plaat in op 15 graden Celsius.

Laad het gegenereerde printpad op de besturingssoftware van de 3D-printer en klik op Start om de collageenbioinks op de gasdoorlatende barrière te printen volgens de geladen G-code met een 18 gauge plastic naald bij een pneumatische druk van ongeveer 20 kilopascal bij 15 graden Celsius. Plaats aan het einde van elke drukbewerking handmatig een gesteriliseerde glazen afdekking van 22 bij 50 millimeter bovenop de gasdoorlatende barrière om de hypoxische gradiënt te genereren. Na het genereren van drie hypoxische kanker-op-chips overbrengen de chips naar een 37 graden Celsius incubator voor een uur om crosslink de collageen bioinks.

Wanneer alle hypoxische kanker-op-een-chips zijn afgedrukt, wreef u voorzichtig de afdekglazen bovenop de gasdoorlatende barrières met een celschraper voor een strakke hechting. Om het celkweekmedium naar de chips te vernieuwen zonder de kankerconstructie los te maken, kantelt u de chips en gebruikt u een pipet om 1,5 milliliter endotheelcelgroeimedium aan de zijkant van elke chip te introduceren. De hypoxische kanker-op-een-chip is ontworpen in de vorm van concentrische ringen om de radiale zuurstofdiffusie en uitputting waargenomen in kankerweefsels na te bootsen.

Na het definiëren van het regelvolume van een ruimte waarin zuurstof wordt verspreid en verbruikt door cellen, kan een geschikte cellulaire dichtheid voor centrale hypoxiegeneratie worden bepaald door middel van computationele eindige-elementenanalyse. Bij 3D-celprinten kan een gecompartimenteerde kanker-stroma concentrische ringstructuur worden gecreëerd om de anatomische kenmerken van de solide kanker te reproduceren. Kwantitatief is de levensvatbaarheid van de cellen na het afdrukken meestal groter dan 96%, wat bevestigt dat de productieomstandigheden geschikt zijn voor kanker en stromale cellen.

In deze representatieve analyse werden twee groepen vergeleken op basis van de aan- en afwezigheid van de zuurstofgradiënt om de effecten van een hypoxische gradiënt op de progressie van kanker te verifiëren. Onder beide omstandigheden waren volwassen CD31-positieve endotheelcellen aanwezig in de perifere regio's, wat aangeeft dat ruimtelijk gevormde levende constructies werden geproduceerd met behulp van 3D-bioprinttechnologie. In vergelijking met de negatieve toestand van de zuurstofgradiënt vertoonde de gradiëntpositieve toestand een hypoxische gradiënt, wat wijst op de geleidelijke expressie van HIF1-alfa.

Shmt2 positieve pseudopalisaded cellen en SOX2 positieve pluripotente cellen werden ook waargenomen, wijzend op de aanwezigheid van agressieve pathofysiologische kenmerken van solide kanker. De hypoxische kanker-op-een-chip is een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van de pathofysiologische kenmerken van solide kankers en de dynamische kruising tussen kankercellen en tumorigenese die micromilieu bevordert. Aangezien de methodologie binnen een redelijk tijdsbestek kan worden aangepast voor een patiëntspecifiek geneesmiddelontwerp, wordt verwacht dat deze aanpak de kloof tussen in vivo en in vitro modellen van kanker zal overbruggen.