Elektroporatie-gemedieerde RNA Interferentie Methode in Odonata

Dit is een videoprotocol voor elektroporatie-gemedieerde RNA interferentie methode in Odonata. Libellen en jonkvrouwen, leden van de orde Odonata, behoren tot de meest voorouderlijke insecten. Volwassen Odonata tonen een opmerkelijke diversiteit in lichaamskleuren en patronen, en vele ecologische en gedragsstudies zijn uitgevoerd.

Echter, moleculaire genetische studies op Odonata zijn ontbreekt, omdat gen functionele analyse is zeer moeilijk. De conventionele RNAi-methode is bijvoorbeeld niet effectief bij Odonata-soorten. Onlangs hebben we een RNM-methode in combinatie met in vivo elektroporatie.

Hier bieden we een videoprotocol voor de elektroporatie-gemedieerde RNAi in zowel libellen als jonkvliegen. Als onze representatieve damselflies soorten gebruiken we de blauwstaartdamselfly. Ischnura senegalensis.

Dit is een van de meest voorkomende damselfly soorten en vaak gevonden in zonnige vijvers in Japan. Eerst tonen we het RNAi-protocol gericht op de buik van een moederlijk, Ischnura senegalensis. Na ijskoude anesthesie bij dat twee spelden aan beide kanten van prothorax en bevestig de larve aan een vaste tribune.

Trek en rek het intersegmentale membraan tussen het zevende en achtste buiksegment met tangen. Houd het intersegmentale membraan met de hand uitgerekt. Plaats de punt van de voorbereide capillaire in het uitgerekte intersegmentale membraan.

Injecteer 1 microliter siRNA- of dsRNA-oplossing. Breng twee druppels ultrasone gel aan op het larvenoppervlak met tangen. Plaats elektroden op de ultrasone gel, met de positieve elektrode aan de zijkant van de injectie.

Genereer 10 keer elektroporatie pulsen met behulp van een elektroporator. Veeg de resterende gel op het oppervlak af met een papertowel. Verwijder insectenspelden en bewaar de behandelde larven ongeveer een dag op een natte papieren handdoek voor herstel.

Vervolgens tonen we het RNAi-protocol gericht op de thorax van een moederlijk, Ischnura senegalensis. Na ijskoude anesthesie bevestig twee pinnen aan beide zijden van de prothorax en bevestig de larve op een vaste standaard. Trek en strek het intersegmentale membraan tussen de prothorax en synthorax met de hand.

Plaats de punt van de voorbereide capillaire in het uitgerekte intersegmentale membraan. Injecteer een microliter siRNA- of dsRNA-oplossing. Breng twee druppels ultrasone gel aan op het oppervlak van de larve met tangen.

Plaats elektroden op de ultrasone gel, met een positieve elektrode aan de zijkant van de injectie. Genereer 10 keer elektroporatie pulsen met behulp van een elektroprolator. Veeg de resterende gel op het oppervlak af met een papertowel.

Verwijder insectenspelden en bewaar de behandelde larven ongeveer een dag op een natte papieren handdoek voor herstel. Als representatieve libellensoort gebruiken we de Pied skimmer libelle. Pseudothemis zonata.

Dit is een van de meest voorkomende libellen soorten en vaak gevonden in schaduwrijke vijvers in Japan. Tot slot tonen we het RNI-protocol gericht op de buik van een libelle, Pseudothemis zonata. Strek het intersegmentale membraan tussen het vierde en vijfde buiksegment.

Maak een klein gaatje met een fijne naald tussen het vierde en vijfde buiksegment. Steek de punt van de voorbereide capillaire in het voorbereide gat. Injecteer een microliter siRNA- of dsRNA-oplossing.

Bevestig de larve op een vaste standaard met behulp van pinnen. Breng twee druppels ultrasone gel aan op het larvenoppervlak met tangen. Plaats elektroden op de ultrasone gel met de positieve elektrode aan de zijkant van de injectie.

Genereer 10 keer elektroporatie pulsen met behulp van een elektroporator. Veeg de resterende gel op het oppervlak af met een papertowel. Verwijder insectenspelden en bewaar de behandelde larven ongeveer een dag op een natte papieren handdoek voor herstel.

Hier hebben we gekozen voor een melanine synthese gen MCO2 als het doel gen, en EGFP of bla als een negatieve controle doel. MCO2 is essentieel voor de zwarte kleurvorming bij verschillende insecten. Eerst tonen we de resultaten in de buik van Ischnura senegalensis.

Witte pijlpunten geven de gebieden van onderdrukte zwarte pigmentatie aan waar de positieve elektrode bij elektroporatie werd geplaatst. Incubatie van pigmentatie werd waargenomen, zowel door siRNA behandeling en dsRNA behandeling. De grootte en locatie van het RNI fenotype varieerden aanzienlijk tussen individuen.

Zonder elektroporatie werden geen RNI-fenotypes waargenomen, wat aangeeft dat elektroporatie essentieel is voor RNI bij deze soort. Vervolgens tonen we de resultaten in de thorax van Ischnura senegalensis. Ook remming van zwarte pigmentatie werd waargenomen rond het gebied waar de positieve elektrode werd geplaatst op elektroporatie.

Tot slot tonen we de resultaten in de buik van Pseudothemis zonata. Zoals verwacht werd het RNI-fenotype gedetecteerd rond het gebied waar de positieve elektrode bij elektroporatie werd geplaatst. We bevestigen dat de elektroproratie-gemedieerde RNAi-methode zeer nuttig is in Odonata.

Het kan leiden tot lokale genonderdrukking bijna 100% efficiëntie. Tenminste bij opperhuid, wanneer we de juiste ontwikkelingsstadia selecteren. Deze methode heeft verschillende over de CRISPR / Cas9 methode.

Zo kan het gebied waar de RNAi fenotypes verschijnen worden gecontroleerd door de positie van de positieve elektrodee bij electrporatie, en de RNA-fenotypes kunnen gemakkelijk worden vergeleken met de besturingsfenotypen naast elkaar in dezelfde persoon. Bovendien vereist deze methode geen micro-injectie in kleine eieren. Het is dus veel gemakkelijker en sneller om het fenotype sneller te observeren dan de CRISPR/Cas9-methode.

Bovendien kan deze methode worden toegepast op insecten waarvan de nieuw gelegde eieren moeilijk te verzamelen zijn. Bijvoorbeeld, vrouwtjes van Pseudothemis zonata leggen eieren tijdens de vlucht. Het is dus erg moeilijk om hun nieuw gelegde eieren te verzamelen.

We verwachten dat dit protocol algemeen van toepassing kan zijn op niet-modelorganismen wanneer de conventionele RNI niet efficiënt werkt.