Name: Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer een waterstofperoxide-model voor oxidatieve stress in retinale pigmentepitheelcellen. Deze methode evalueert antioxidanteffecten van eiwitten voor behandeling van leeftijdsgebonden maculadegeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Gregg Sealy en Alain Conti bedanken voor hun uitstekende technische assistentie en Prof. Zsuzsanna Izsvák van het Max-Delbrück Center in Berlijn voor het leveren van de pSB100X en pT2-CAGGS-Venus plasmiden. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Sciences Foundation en de Europese Commissie in het kader van het zevende kaderprogramma. Z.I werd gefinancierd door european research council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

<ol><li>Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+ARPE-19+cultures%3A+Do+melanosomes+confer+cytoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection.</a> Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).</li>
<li>Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+macular+carotenoid+lutein+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells.</a> Antioxidants. 6 (4), (2017).</li>
<li>Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+current+and+future+management+of+geographic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Review of current and future management of geographic atrophy.</a> Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).</li>
<li>Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Interventions+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Recent developments in age-related macular degeneration: a review.</a> Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).</li>
<li>Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+complement+membrane+attack+complex+in+dry+and+wet+AMD+-+From+hypothesis+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials.</a> Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).</li>
<li>Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and reactive oxygen species.</a> Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).</li>
<li>Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li>
<li>Alhasani, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gypenosides+protect+retinal+pigment+epithelium+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress.</a> Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).</li>
<li>National Institute of Health. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics">https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics</a> (2020).</li>
<li>Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).</li>
<li>He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+improves+mitochondrial+function+in+RPE+cells+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).</li>
<li>Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cytokine+profiles+of+human+retinal+pigment+epithelium%3A+Oxidant+injury+and+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence.</a> Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).</li>
<li>Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+expression+affects+the+oxidative+and+inflammatory+state+of+choroidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells.</a> Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).</li>
<li>Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolato%2C+F+%22Retinal+Degenerative+Diseases%22">Retinal Degenerative Diseases</a>. , Springer. 699-706 (2016).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+the+ERK1%2F2+pathways+and+protects+injured+retinal+ganglion+cells+from+induced+death%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death.</a> Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+protects+rat+photoreceptors+from+death+by+activating+the+SRC-dependent+signalling+and+elevating+anti-apoptotic+factors+and+neurotrophins%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Archives+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins.</a> Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).</li>
<li>Thumann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+PEDF-expressing+primary+pigment+epithelial+cells+by+the+SB+transposon+system+delivered+by+pFAR4+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).</li>
<li>Garcia-Garcia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+PEDF+release+in+rat+iris+and+retinal+epithelial+cells+after+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+and+neurogenic+activities+of+Sleeping+Beauty-mediated+PEDF-transfected+RPE+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+H2O2-%2C+HNE-%2C+or+tBH-treated+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).</li>
<li>Allen, R. G., Tresini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and gene regulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).</li>
<li>Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+H2O2+induce+catalase+and+metallothionein+gene+expression+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).</li>
<li>Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide in the human body.</a> FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).</li>
<li>Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+correlation+between+the+levels+of+ascorbic+acid+and+H2O2+in+aqueous+humor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor.</a> Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).</li>
<li>Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KGF+prevents+oxygen-mediated+damage+in+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).</li>
<li>Campochiaro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+gene+transfer+of+endostatin%2Fangiostatin+for+macular+degeneration+%28GEM%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study.</a> Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).</li>
<li>Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+affects+retinal+pigment+epithelial+cell+survival+through+epidermal+growth+factor+receptor%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway.</a> International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).</li>
<li>Tu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allicin+attenuates+H2O2+-+induced+cytotoxicity+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+by+regulating+the+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species.</a> Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).</li>
<li>Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piceatannol+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+hydrogen+peroxide+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+through+modulating%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating.</a> Nutrients. 11, 1-13 (2019).</li>
<li>Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+causes+significant+mitochondrial+DNA+damage+in+human+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells.</a> Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+overexpression+of+uncoupling+protein+2+attenuates+salt-induced+vascular+dysfunction+by+inhibition+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress.</a> American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li>
<li>Mátés, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html">https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html</a> (2020).</li>
<li>Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx">https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx</a> (2020).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%5E%28-%CE%94%CE%94CT%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).</li>
<li>Bascuas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-virally+transfected+primary+human+pigment+epithelium+cells+overexpressing+the+oxidative+stress+reduction+factors+PEDF+and+GM-CSF+to+treat+retinal+neurodegeneration+neurodegenerationl%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).</li>
<li>Zhuge, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fullerenol+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+stress-induced+premature+senescence+via+activating+SIRT1%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).</li>
<li>Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+H2O2+Availability+to+ARPE-19+cultures+in+models+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).</li>
<li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+oxidative+stress+via+upregulation+of+UCP2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).</li>
<li>Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCP2%2C+a+mitochondrial+protein+regulated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier gepresenteerde protocol biedt een benadering om de anti-oxidatieve en beschermende functie van PEDF en GM-CSF geproduceerd door getransfecteerde cellen te analyseren, die kunnen worden toegepast op cellen die zijn getransfecteerd met elk vermeend gunstig gen. In gentherapeutische strategieën die tot doel hebben eiwitten aan weefsel te leveren door genetisch gemodificeerde cellen te transplanteren, is het van cruciaal belang om informatie te verkrijgen over het niveau van eiwitexpressie, de levensduur van express...

Het hier beschreven model biedt een nuttige benadering om de efficiëntie van biofarmaceutische middelen te evalueren voor het verminderen van oxidatieve stress in cellen. We hebben het model gebruikt om de beschermende effecten van PEDF en GM-CSF op de H2O2-gemedieerde oxidatieve stress op retinale pigmentepitheelcellen te onderzoeken, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van O2en zichtbaar licht, en de fagocytose van fotoreceptor buitenste segmentmembranen, die aanzienlijke niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren1, 2. Ze worden beschouwd als een belangrijke bijdrage aan de pathogenese van avasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (aAMD)3,4,5,6,7,8. Bovendien is er een afname van RPE-gesynthetiseerde neuroprotectieve factoren, met name de pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF), insuline-achtige groeifactoren (IGF's) en granulocyt macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) die leidt tot de disfunctie en het verlies van RPE-cellen, gevolgd door fotoreceptor en retinale ganglioncel (RGC) dood3,4,5 . AMD is een complexe ziekte die het gevolg is van de interactie tussen metabole, functionele, genetische en omgevingsfactoren4. Het gebrek aan behandelingen voor aAMD is de belangrijkste oorzaak van blindheid bij patiënten ouder dan 60 jaar in geïndustrialiseerde landen9,10. De reconstitutie van de neuroprotectieve en neurogene retinale omgeving door de subretinale transplantatie van genetisch gemodificeerde RPE-cellen die PEDF en GM-CSF overexpressie geven, heeft het potentieel om retinale degeneratie te voorkomen door de effecten van oxidatieve stress te verminderen, ontstekingen te remmen en celoverleving te ondersteunen11,12,13,14,15,16 . Hoewel er verschillende methodologieën zijn om genen aan cellen te leveren, hebben we gekozen voor het niet-virale hyperactieve Doornroosje transposonsysteem om de PEDF- en GM-CSF-genen aan RPE-cellen te leveren vanwege het veiligheidsprofiel, de integratie van de genen in het genoom van de gastheercellen en de neiging om de afgeleverde genen te integreren in niet-transcriptioneel actieve sites zoals we eerder hebben aangetoond17, 18,19.
Cellulaire oxidatieve stress kan worden geïnduceerd in cellen die in vitro zijn gekweekt door verschillende oxidatieve middelen, waaronder waterstofperoxide (H2O2),4-hydroynonenaal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), hoge zuurstofspanningen en zichtbaar licht (volledig spectrum of UV-straling)20,21. Hoge zuurstofspanningen en licht vereisen speciale apparatuur en omstandigheden, die de overdraagbaarheid naar andere systemen beperken. Middelen zoals H 2 O2,HNE en tBH induceren overlappende oxidatieve stress moleculaire en cellulaire veranderingen. We kozen H2O2 om de antioxiderende activiteit van PEDF en GM-CSF te testen omdat het handig en biologisch relevant is omdat het wordt geproduceerd door RPE-cellen als een reactief zuurstoftussenproduct tijdens fotoreceptor buitenste segment fagocytose22 en het wordt gevonden in oculaire weefsels in vivo23. Aangezien de oxidatie van glutathion gedeeltelijk verantwoordelijk kan zijn voor de productie van H2O2 in het oog, hebben we de niveaus van GSH / glutathion in onze studies geanalyseerd, die verband houden met H2O2-geïnduceerde oxidatieve stress en het regeneratieve vermogen van cellen21,22. De analyse van glutathionspiegels is vooral relevant omdat het deelneemt aan de anti-oxidatieve beschermingsmechanismen in het oog24. Blootstelling aan H2O2 wordt vaak gebruikt als een model om de oxidatieve stressgevoeligheid en antioxiderende activiteit van RPE-cellen1,25,26,27,28,29,30te onderzoeken en bovendien vertoont het overeenkomsten met door licht geïnduceerde oxidatieve stressschade, een "fysiologische" bron van oxidatieve stress21.
Om de functionaliteit en de effectiviteit van neuroprotectieve factoren te evalueren, hebben we een in vitro model ontwikkeld dat de analyse mogelijk maakt om het anti-oxidatieve effect van groeifactoren uitgedrukt door cellen die genetisch gemodificeerd zijn om PEDF en GM-CSF te overexpressie te kwantificeren. Hier laten we zien dat RPE-cellen getransfecteerd met de genen voor PEDF en GM-CSF beter bestand zijn tegen de schadelijke effecten van H2O2 dan niet-getransfecteerde controlecellen, zoals blijkt uit celmorfologie, dichtheid, levensvatbaarheid, intracellulair niveau van glutathion en expressie van het UCP2-gen, dat codeert voor het mitochondriale ontkoppelingseiwit 2 waarvan is aangetoond dat het reactieve zuurstofsoorten (ROS) vermindert31.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Greiner</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>96-well culture plate white with clear flat bottom&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3610</td><td>Staat toe om de cellen te controleren voor het meten van de luminescentie (GSH-Glo Assay)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Corning&nbsp;</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid 40%</td><td>Biorad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>AMIMED</td><td>4-05F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-GMCSF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PA5-24184</td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-PEDF&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-390172</td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-penta-His&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-phospho-Akt</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-rabbit IgG H&amp;L-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Antibody goat anti-mouse Alexa 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>ARPE-19 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-500G</td><td></td></tr><tr><td>chamber culture glass slides</td><td>Corning</td><td>354118</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham`s F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Duo Set ELISA kit</td><td>R&amp;D Systems&nbsp;</td><td>DY215-05</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>ELISAquant kit</td><td>BioProducts MD</td><td>PED613-10-Human</td><td></td></tr><tr><td>Eyes (human)</td><td>Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega plate reader&nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software (version 8.0)</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH-Glo Glutathione Assay</td><td>Promega</td><td>V6912</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software (image processing program)</td><td>W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997&ndash;2014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazol&nbsp;</td><td>Axonlab</td><td>A1378.0010</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI4000B microscope&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II&nbsp;</td><td>Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SW1.5.1 software</td><td>Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Axonlab</td><td>3468.1000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System 10 &micro;L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer chamber</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-3197</td><td></td></tr><tr><td>Omega Lum G Gel Imaging System</td><td>Aplegen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quantabio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Primers&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td>Zie Tabel 1 in Aanvullende Materialen</td></tr><tr><td>pSB100X (250 ng/&micro;L)</td><td></td><td></td><td>M&aacute;t&eacute;s et al., 2009. Verstrekt door Prof. Zsuzsanna Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&micro;L)</td><td></td><td></td><td>Geconstrueerd met behulp van het bestaande pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid gerapporteerd in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&micro;L)</td><td></td><td></td><td>Geconstrueerd met behulp van het bestaande pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid gerapporteerd in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>recombinant hGM-CSF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>recombinant hPEDF&nbsp;&nbsp;</td><td>BioProductsMD</td><td>004-096</td><td></td></tr><tr><td>ReliaPrep RNA Cell Miniprep System</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase Set</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Applichem</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>Semi-dry transfer system for WB&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperMix qScript</td><td>Quantabio</td><td>95048-025</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline (TBS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td>

inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidatieve stress speelt een cruciale rol bij verschillende degeneratieve ziekten, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een pathologie die wereldwijd ~ 30 miljoen patiënten treft. Het leidt tot een afname van retinale pigmentepitheel (RPE) - gesynthetiseerde neuroprotectieve factoren, bijvoorbeeld pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) en granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), gevolgd door het verlies van RPE-cellen, en uiteindelijk fotoreceptor en retinale ganglioncel (RGC) dood. We veronderstellen dat de reconstitutie van de neuroprotectieve en neurogene retinale omgeving door de subretinale transplantatie van getransfecteerde RPE-cellen die PEDF en GM-CSF overexpresseren, het potentieel heeft om retinale degeneratie te voorkomen door de effecten van oxidatieve stress te verminderen, ontsteking te remmen en celoverleving te ondersteunen. Met behulp van het Doornroosje transposonsysteem(SB100X)zijn menselijke RPE-cellen getransfecteerd met de PEDF- en GM-CSF-genen en hebben ze stabiele genintegratie, genexpressie op lange termijn en eiwitsecretie aangetoond met behulp van qPCR, western blot, ELISA en immunofluorescentie. Om de functionaliteit en de potentie van de PEDF en GM-CSF uitgescheiden door de getransfecteerde RPE-cellen te bevestigen, hebben we een in vitro assay ontwikkeld om de reductie van H2O2-geïnduceerde oxidatieve stress op RPE-cellen in cultuur te kwantificeren. Celbescherming werd geëvalueerd door celmorfologie, dichtheid, intracellulair niveau van glutathion, UCP2-genexpressie en levensvatbaarheid van cellen te analyseren. Zowel getransfecteerde RPE-cellen die PEDF en/of GM-CSF overexpressie geven als cellen die niet-getransfecteerd zijn maar voorbehandeld met PEDF en/of GM-CSF (in de handel verkrijgbaar of gezuiverd uit getransfecteerde cellen) vertoonden een significante antioxidant celbescherming in vergelijking met niet-behandelde controles. Het huidige H2O2-model is een eenvoudige en effectieve benadering om het antioxiderende effect te evalueren van factoren die effectief kunnen zijn om AMD of vergelijkbare neurodegeneratieve ziekten te behandelen.

Inductie van oxidatieve stress in menselijke retinale pigmentepitheelcellen ARPE-19 en primaire hRPE-cellen werden behandeld met verschillende concentraties van H2O2 gedurende 24 uur en het intracellulaire niveau van de antioxidant glutathion werd gekwantificeerd (Figuur 2A,B). H2O2 bij 50 μM en 100 μM had geen invloed op de glutathionproductie, terwijl er bij 350 μM een signific...

We presenteren een protocol voor de ontwikkeling en het gebruik van een oxidatieve stress-model door retinale pigmentepitheelcellen te behandelen met H2O2, waarbij celmorfologie, levensvatbaarheid, dichtheid, glutathion en UCP-2-niveau worden geanalyseerd. Het is een nuttig model om het antioxiderende effect te onderzoeken van eiwitten die worden uitgescheiden door getransfecteerde cellen om neuroretinale degeneratie te behandelen.

Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Het waterstofperoxidemodel is een eenvoudige en effectieve benadering voor het evalueren van de antioxiderende effecten van factoren die nuttig kunnen zijn bij de behandeling van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie of vergelijkbare neurodegeneratieve ziekten. Het oxidatiemiddel, waterstofperoxide, wordt in één enkele puls toegediend, waardoor het sneller en eenvoudiger uit te voeren is dan modellen waarbij de waterstofperoxidebehandeling gedurende meerdere dagen moet worden herhaald. Omdat het aantal gezaaide cellen de oxidatieve effecten van de behandeling beïnvloedt, is het belangrijk om de cellen zorgvuldig te tellen voordat ze worden gekweekt.Thais Bascuas, een postdoctoraat uit het laboratorium van Gabriele Thumann, zal de procedure demonstreren. Voor de bereiding van geconditioneerd medium, 28 dagen na transfectie met PEDF, GM-CSF, of beide, zaait u de humane ARPE-19 cel lijn T-75 flacons van 500.000 cellen per milliliter van volledige medium concentratie. Wanneer de cellen ongeveer 80% confluency bereiken, vervangt u het supernatant met vers volledig medium en verzamelt u het nieuwe supernatant na 24 uur.Om de histidine-gelabelde GM-CSF en PEDF eiwitten te zuiveren, centrifugeert u het supernatant om potentiële resterende cellen te elimineren en zet u het monster opzij. Voeg vervolgens 30 microliters nikkel NTA oplossing toe aan een 1,5 milliliter buis. Na het centrifugeren, gooit u de nikkel NTA flow-through weg en wast u de pellet twee keer met 200 microliters van 1X incubatiebuffer per wasbeurt.Na de tweede wasbeurt, re-suspendeert u de pellet in 40 microliters van 4X incubatiebuffer en 900 microliters van het gecentrifugeerde, geconditioneerde medium. Incubeer het geconditioneerde medium oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur en 70 rotaties per minuut. Aan het einde van de incubatie, centrifugeert u het monster en wast u de pellet twee keer met 175 microliters van 1X incubatie per wasbeurt.Na de tweede wasbeurt, voegt u 20 microliters elutiebuffer toe voor een incubatie van 20 minuten bij 70 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, centrifugeert u het monster. Zet het supernatant opzij en bepaal de totale eiwithoeveelheid die is geëlueerd door de BCA-eiwittest volgens standaardprotocollen.Voor de behandeling van niet-getransfecteerde retinale pigmentepitheelcellen met geconditioneerd medium en waterstofperoxide, zaait u 3000 cellen in 200 microliters van volledig medium in elke put van een 96-well plaat voor 24-uurs incubatie in de celkweekincubator. De volgende ochtend vervangt u de supernatanten met 200 microliters van geconditioneerd medium per put en brengt u de cellen terug naar de celkweekincubatoren voor 10 dagen. Op dag 11 van de cultuur, behandel u de cellen met 350-micromolair waterstofperoxide in volledig medium gedurende 24 uur.Voor de behandeling van niet-getransfecteerde RPE-cellen met gezuiverde of commerciële PEDF en/of GM-CSF, zaait u 3000 cellen in 200 microliters van volledig medium aangevuld met 500 nanogram per milliliter van recombinant PEDF en/of 50 nanogram per milliliter van recombinant GM-CSF per put voor een 48-uurs incubatie in de celkweekincubator. Aan het einde van de incubatie, vervangt u de supernatanten met volledig medium bevattend 350 micromolair waterstofperoxide en 500 nanogram per milliliter van PEDF en/of 50 nanogram per milliliter van GM-CSF per put gedurende 24 uur. Voor waterstofperoxide behandeling van getransfecteerde RPE-cellen, kweekt u 5.000 getransfecteerde cellen in 200 microliters van volledig medium per put gedurende 24 uur in de celkweekincubator voordat u de cellen behandelt met 350 micromolair waterstofperoxide zoals gedemonstreerd.Om de glutathionniveaus te meten die worden geproduceerd in getransfecteerde cellen die PEDF en/of GM-CSF overdrukken, of niet-getransfecteerde cellen voorbehandeld met groeifactor na waterstofperoxide behandeling, vervangt u het supernatant in elke put met 100 microliters van vers bereid 1X reagensmengsel per put en mengt u de cellen met een reagensmengsel gedurende 14 seconden bij 500 omwentelingen per minuut op een orbitale shaker. Na het schudden, incubeert u de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voordat u 100 microliters van gereconstitueerd luciferine detectiereagens toevoegt aan elke put. Meng de oplossing gedurende 15 seconden op de shaker, gevolgd door een 15-minuten incubatie bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, laadt u de plaat op een platelezer en selecteert u Layout wijzigen. Onder het tabblad Basisparameters, moeten 96-well plaat en Top optica worden geselecteerd en de positioneringsvertraging moet worden ingesteld op 0,1, de Meetstarttijd op nul, de Meetintervaltijd op één, en de Tijd om resultaten te normaliseren op nul. Definieer de blanco's, standaarden en monsters, en klik op Meet starten.Exporteer vervolgens de gegevens als een spreadsheetbestand en bereken de concentratie van glutathion in elk monster door interpolatie van de standaardcurve. Om de celviabiliteit te meten, vervangt u het supernatant in elke put met 100 microliters van volledig medium aangevuld met 1%FBS per put, en plaatst u de cellen in de celkweekincubator tot de analyse. Na het verzamelen van onbehandelde ARPE-19 cellen uit de cultuur, re-suspendeert u de cellen bij een concentratie van 100.000 cellen per milliliter in DMEM Hams F-12 medium aangevuld met 1%FBS concentratie.Bereid vervolgens zeven seriële 1:1 verdunningen in 200 microliters van medium aangevuld met 1%FBS, en brengt u 100 microliters van elke standaard over naar de geschikte putten van een 96-well plaat in duplicaat. Voeg 50 microliters van vers bereid reagensmengsel toe aan alle putten en mengt u de cellen met het mengsel gedurende 15 seconden op de shaker voordat u de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incubeert. Aan het einde van de incubatie, meet u de luminescentie zoals gedemonstreerd.Na het verkrijgen van de meting, voegt

induction-analysis-oxidative-stress-sleeping-beauty-transposon

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een screening methode om oxidatieve cellulaire omgevingen te detecteren is het meten van de oxidatie van CM-H2DCFDA. Zodra geoxideerd in een cel, CM-H2DCFDA veranderingen ten opzichte van niet-fluorescerende in een fluorescerende verbinding. Deze verandering in fluorescentie wordt gemeten door middel van flowcytometrie en geeft het aantal cellen in een oxidatieve omgeving.

Screening Assay voor oxidatieve stress in een Feline astrocyten cellijn, G355-5

Hier rapporteren we een protocol om oxidatieve stress in levende zebravisembryo's te meten. Deze procedure maakt de detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) mogelijk in zowel volledige embryoweefsels als enkele-celpopulaties. Dit protocol zal zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses mogelijk maken.

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo&#39;s

Niet-coherent xenonlicht werd door smalbandige interferentie en neutrale dichtheidsfilters geleid om licht met verschillende golflengten en intensiteit aan gekweekte cellen te leveren. Dit protocol werd gebruikt om de effecten van rood/nabij-infrarood lichttherapie op de productie van reactieve soorten in vitro te beoordelen: er werden geen effecten waargenomen met de geteste parameters.

Methode voor de evaluatie van de effecten van een golflengtebereik en intensiteiten van Rood / nabij-infrarood Lichttherapie op oxidatieve stress In Vitro

Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

We hebben een protocol ontwikkeld om primaire menselijke pigmentepitheelcellen te transfecteren door elektroporatie met het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Succesvolle transfectie werd aangetoond door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), immunoblotting en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

Het huidige protocol beschrijft een methode om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de intestinale muriene organoïden te detecteren met behulp van kwalitatieve beeldvorming en kwantitatieve cytometrie-assays. Dit werk kan mogelijk worden uitgebreid naar andere fluorescerende sondes om het effect van geselecteerde verbindingen op ROS te testen.

Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde

Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.

Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen

De metabole status van menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE) weerspiegelt hun gezondheid en functie. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het onderzoeken van de real-time metabole flux van H-RPE met behulp van respirometrie met hoge resolutie.

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

We introduceren een nieuw apparaat voor het meten van zuurstofverbruik (OCR) in retinale pigmentepitheliale (RPE) culturen. Het apparaat kan OCR wekenlang meten op RPE die is gekweekt op standaard celkweekplaten met standaardmedia, terwijl de platen zich in een standaard celcultuurincubator bevinden.

Langdurige monitoring van zuurstofverbruiken in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde retinale pigmentepitheelculturen

Werkwijze voor het identificeren van onbekende oorzaken van kanker met een objectieve benadering beschreven. De methode maakt gebruik van...

Identificatie van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon inserties in vaste tumoren met Linker-gemedieerde PCR

Leer een waterstofperoxide-model voor oxidatieve stress in retinale pigmentepitheelcellen. Deze methode evalueert antioxidanteffecten van eiwitten voor behandeling van leeftijdsgebonden maculadegeneratie.

Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

Meer video's verkennen