Name: Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer elektroporatie-gebaseerde transfektie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met het Sleeping Beauty Transposon-systeem. Deze methode realiseert stabiele transgenexpressie voor gentherapie bij retinale degeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het zevende kaderprogramma van de Europese Unie voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie, subsidieovereenkomst nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák werd gefinancierd door de European Research Council, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). De auteurs willen Anna Dobias en Antje Schiefer (afdeling Oogheelkunde, Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) bedanken voor uitstekende technische ondersteuning, en de Aachen Cornea Bank (Afdeling Oogheelkunde, Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) voor het verstrekken van de menselijke donorogen.

Menselijke donorogen werden verkregen van de Aachen Cornea Bank van de afdeling Oogheelkunde (Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming in overeenstemming met de Protocollen van de Verklaring van Helsinki. Procedures voor het verzamelen en gebruiken van menselijke monsters zijn goedgekeurd door de institutionele ethische commissie.
1. Isolatie van primaire menselijke RPE-cellen
<ol><li>Leg steriele beschermende kleding en handschoenen neer. Plaats een steriele drape onder een laminaire stroming.</li>
	<li>Plaats steriele bereidingsinstrumenten en andere noodzakelijke steriele apparatuur onder de laminaire stroom.</li>
	<li>Noteer de ontvangst van de oogbollen, het begin van de voorbereiding en mogelijke afwijkingen. Registreer de leeftijd van de donor, het geslacht, de doodsoorzaak en de periode tussen het moment van overlijden en het verwijderen van de ogen.</li>
	<li>Plaats de oogbol in een steriel gaaskompres en houd deze in één hand.</li>
	<li>Scheid het voorste segment van het achterste segment door een omtreksnede ongeveer 3,5 mm achter de limbus met behulp van een scalpel en een extra fijne puntige oogschaar.</li>
	<li>Nadat u het achterste segment naar beneden hebt gekanteld, verwijdert u voorzichtig het glasvocht en het netvlies met behulp van een colibri-tang.</li>
	<li>Herschik discreet het ingeklapte RPE/choroidea-complex met behulp van een rechte iristang en houd het vervolgens op zijn plaats met een gebogen iristang.</li>
	<li>Vul de achterste oogschelp met 1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Ham's F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F12) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 80 U / ml penicilline en 80 μg / ml streptomycine (pen / streptop) en 2,5 μg / ml amfotericine B (AmphoB). OPMERKING: In tegenstelling tot de isolatie van primaire RPE-cellen uit varkens- of runderogen 36,37, hoeft de achterste oogschelp niet te worden gevuld en geïncubeerd met trypsine.</li>
	<li>Oogst de RPE-cellen door het retinale pigmentepitheel voorzichtig van de oogzenuw naar de limbus te borstelen met een vuurgepolijste gebogen glazen Pasteur-pipet, terwijl het RPE / choroidea-complex aan de limbus wordt bevestigd met behulp van een colibri-tang. Breng de celsuspensie over in een petrischaaltje.</li>
	<li>Herhaal de stappen 1.8 en 1.9 en verzamel alle cellen in de petrischaal. Resuspendeer de celsuspensie zorgvuldig door op en neer te pipetteren met een eenkanaals pipet (100-1.000 μL).</li>
	<li>Zaai de RPE-celsuspensie van elke oogbol in drie putten van een celkweekplaat met 24 putten en vul ze tot 1 ml met DMEM / F12 aangevuld met FBS, Pen / Strep en AmphoB.</li>
	<li>Houd de RPE-celculturen op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 totdat de samenvloeiing is bereikt. Verander het celkweekmedium twee keer per week.</li>
</ol>2. Elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellen
<ol><li>Bereiding van het SB100X transposase/PEDF transposon plasmidemengsel
	<ol><li>Zuiver de SB100X transposase en PEDF transposon plasmide DNA met behulp van gebruikelijke plasmide zuiveringskits, die geschikt zijn voor gebruik in toepassingen zoals transfectie, volgens het protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Kwantificeer de plasmide-DNA-inhoud met behulp van een microvolumespectrofotometer en stel deze in op een concentratie van 250 ng/μL met 10 mM Tris-HCl (pH 8,5).</li>
		<li>Meng een portie van 250 ng/μL SB100X transposase plasmide DNA (bijv. 2,5 μL) met 16 porties van 250 ng/μL PEDF transposon plasmide DNA (bijv. 40 μL). Restplasmidemengsel kan worden bewaard bij -20 °C. OPMERKING: Meerdere herhaalde vries- en ontdooicycli van het plasmidemengsel moeten worden vermeden.</li>
		<li>Breng 2 μL van het SB100X transposase/PEDF transposon plasmidemengsel, dat 29,4 ng SB100X transposase plasmide en 470,6 ng PEDF transposon plasmide bevat, in een steriele 1,5 ml safe-lock microcentrifugebuis. Houd op ijs tot het gemengd is met cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Opstelling van het capillaire transfectiesysteem OPMERKING: Elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellen is uitgevoerd via een capillair transfectiesysteem met behulp van de 10 μL-kit volgens het protocol van de fabrikant. Het systeem bestaat uit het transfectieapparaat, de transfectiepipet en het pipetstation. De kit bevat 10 μL transfectietips, bufferbuizen, elektrolytische buffer E (buffer E) en resuspensiebuffer R (buffer R).<ol><li>Sluit het pipetstation aan op het transfectieapparaat.</li>
		<li>Vul een bufferbuis met 3 ml buffer E en steek deze in het pipetstation totdat er een klikgeluid wordt gehoord. OPMERKING: Zorg ervoor dat de zijelektrode van de bufferbuis is aangesloten op de zijkogelzuiger van het pipetstation.</li>
		<li>Stel voor de elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellen de volgende pulsomstandigheden in op het transfectieapparaat: 1.100 V (pulsspanning), 20 ms (pulsbreedte), twee pulsen (pulsnummer).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van de gecultiveerde primaire menselijke RPE-cellen
	<ol><li>Documentvorm en morfologie van de primaire RPE-celculturen via fasecontrastmicroscopie. Neem micrografieën met een lage vergroting om de groei van de RPE-cellen tot een confluente en geïntegreerde monolaag aan te tonen, evenals microfoto's met een hogere vergroting om de typische kasseimorfologie van de RPE-cellen aan te wijzen.</li>
		<li>Aspirateer het celkweekmedium en was de cellen tweemaal met 1 ml gebufferde fosfaatzoutoplossing (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Trypsinize primaire menselijke RPE-cellen met 0,5 ml 0,05% trypsine-EDTA bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 gedurende 7-15 min (maximaal). Controleer het loslating van de cel microscopisch.</li>
		<li>Stop trypsinisatie met 1 ml DMEM/F12 aangevuld met FBS. Neem een aliquot van 20 μL voor het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de RPE-celsuspensie bij 106 x g gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Meng de 20 μL aliquot met 20 μL trypan blauwe oplossing. Pipetteer 10 μL in elke helft van de hemocytometer en tel de cellen onder een fasecontrastmicroscoop.</li>
		<li>Na centrifugatie resuspenseert u de RPE-celpellet in 1 ml PBS.</li>
		<li>Neem 10.000-100.000 RPE-cellen per transfectiereactie en centrifugeer ze bij 106 x g gedurende 10 minuten. OPMERKING: Naast de transfectiereacties met elektrische veldtoepassing en toevoeging van plasmide-DNA, omvat elke benadering ook twee verschillende controleculturen: (1) zonder elektrische veldtoepassing en zonder plasmide-DNA; (2) met elektrische veldtoepassing, maar zonder plasmide-DNA.</li>
		<li>Resuspendeer de celpellet in 11 μL buffer R en combineer deze met 2 μL van het SB100X transposase/PEDF transposon plasmidemengsel (zie stap 2.1.4). OPMERKING: Na resuspensie in buffer R moeten de cellen binnen 15 minuten worden verwerkt om een vermindering van de levensvatbaarheid van de cel en de efficiëntie van de transfectie te voorkomen.</li>
		<li>Steek de kop van de transfectiepipet in de transfectiepunt van 10 μL totdat de klem de montagesteel van de zuiger volledig oppakt. Trek de cel/plasmide-oplossing op in de transfectiepunt. OPMERKING: Vermijd het genereren van luchtbellen en hun aspiratie in de transfectiepunt.</li>
		<li>Zorg voor 1 ml DMEM/F12 aangevuld met FBS, maar zonder pen/strep en zonder amphob, in het vereiste aantal putten van een celkweekplaat met 24 putten.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektroporatieproces
	<ol><li>Steek de transfectiepipet in de bufferbuis in het pipetstation (zie stap 2.2.2) totdat een klikgeluid wordt gehoord. OPMERKING: Zorg ervoor dat de metalen kop van de transfectiepipet is aangesloten op de kogelzuiger in het pipetstation en op de bufferbuis.</li>
		<li>Druk op Start op het touchscreen van het transfectieapparaat. Voordat de elektrische puls wordt aangebracht, controleert het apparaat automatisch of de bufferbuis en de transfectiepipet correct zijn ingebracht. Na levering van de elektrische pulsen wordt Complete weergegeven op het touchscreen.</li>
		<li>Verwijder de transfectiepipet voorzichtig uit het pipetstation en laat de geëlektroporated cellen onmiddellijk los uit de transfectiepunt van 10 μL door de cel/plasmide-oplossing in de voorbereide putten van de celkweekplaat te pipetteren (zie stap 2.3.10).</li>
		<li>Behoud getransfecteerde RPE-celculturen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2. Voeg Pen/Strep en AmphoB toe met de eerste medium uitwisseling 3 dagen na elektroporatie.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyses van getransfecteerde primaire menselijke RPE-cellen
<ol><li>Monstervoorbereiding
	<ol><li>Na een teelttijd van 3 weken incubeer je uiteindelijk de RPE-celculturen in een gedefinieerd volume van 1,0 ml DMEM/F12 aangevuld met FBS, Pen/Strep en AmphoB gedurende een bepaalde tijd van 24 uur.</li>
		<li>Neem de celkweeksupernatanten en bewaar ze bij -20 °C tot verdere verwerking nabij of bij -80 °C voor thermisch onstabiele monsters en langdurige opslag.</li>
		<li>Trypsinize getransfecteerde RPE-celculturen met 0,5 ml 0,05% trypsine-EDTA bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Stop trypsinisatie met 1 ml DMEM/F12 aangevuld met FBS. Neem kleine aliquots voor het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer (zie stap 2.3.5). Centrifugeer de RPE-celsuspensies bij 106 x g gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Bewaar de RPE-celpellets bij -80 °C tot verdere verwerking.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluatie van PEDF-secretie door western blotting OPMERKING: Voor een kwalitatieve beoordeling worden celkweeksupernatanten (zie stap 3.1.2) geanalyseerd via natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE) en daaropvolgende western blotting. Afhankelijk van de PEDF transposon plasmide DNA gebruikt, de supernatanten moeten anders worden verwerkt.<ol><li>Zuivering van his-tagged PEDF-fusie-eiwitten uit celkweeksupernatanten
		<ol><li>Neem 30 μL nikkel-nitrilotriacetinezuur (Ni-NTA) slurry per monster met behulp van een afgeschuinde punt en pelleteer de Ni-NTA hars door centrifugatie (2.660 x g gedurende 30 s).</li>
			<li>Resuspendeer de Ni-NTA-hars zorgvuldig met 200 μL 1x incubatiebuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8,0) en pelleteer het door centrifugatie (2.660 x g gedurende 30 s).</li>
			<li>Herhaal de vorige stap.</li>
			<li>Resuspendeer de Ni-NTA-hars zorgvuldig met 40 μL 4x incubatiebuffer (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazool, pH 8,0) per monster.</li>
			<li>Meng 900 μL celkweeksupernatant met 260 μL 4x incubatiebuffer en 55 μL voorbehandelde Ni-NTA-slurry (zie stap 3.2.1.4).</li>
			<li>Incubeer het mengsel op een schommelende shaker op kamertemperatuur gedurende 60 minuten.</li>
			<li>Pellet de Ni-NTA hars door centrifugatie (2660 x g gedurende 60 s).</li>
			<li>Resuspendeer de Ni-NTA hars zorgvuldig met 175 μL 1x incubatiebuffer en pellethars door centrifugatie (2.660 x g gedurende 60 s).</li>
			<li>Herhaal de vorige stap.</li>
			<li>Resuspenseer de Ni-NTA-hars zorgvuldig met 30 μL el elutibuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8,0) en incubeer het mengsel op een schommelschudder bij kamertemperatuur gedurende 20 min.</li>
			<li>Pellet de Ni-NTA hars door centrifugeren (2.660 x g gedurende 30 s).</li>
			<li>Neem het supernatant voorzichtig in en meng het met 2x SDS monsterbuffer47.</li>
			<li>Verwarm het mengsel op 95 °C gedurende 5 minuten en scheid de Ni-NTA gezuiverde eiwitten op een 10% SDS-polyacrylamide gel.</li>
			<li>Voer western blotting uit met behulp van anti-Penta-His antilichamen (muis monoklonaal, 1:500) en mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde antimuisantistoffen (konijn polyklonaal, 1:1.000) zoals eerder beschreven36,37.</li>
		</ol></li>
		<li>Directe analyse van niet-gelabelde PEDF-eiwitten
		<ol><li>Neem 15 μL celkweek supernatant en meng dit met 2x SDS monster buffer47.</li>
			<li>Verwarm het mengsel gedurende 5 minuten op 95 °C en scheid de eiwitten op een 10% SDS-polyacrylamidegel.</li>
			<li>Voer western blotting uit met behulp van anti-humane PEDF-antilichamen (konijnenpolyklonaal, 1:4.000) en HRP-geconjugeerde antikonijnantistoffen (geitenpolyklonaal, 1:2.000) zoals eerder beschreven38.</li>
		</ol></li>
		<li>Kwantificering van PEDF-secretie door ELISA
		<ol><li>Analyseer celkweeksupernatanten (zie stap 3.1.2) met behulp van een menselijke PEDF ELISA-kit volgens het protocol van de fabrikant.</li>
			<li>Relateer de hoeveelheid uitgescheiden PEDF aan de tijd en het celnummer dat voor elke transfectiereactie is bepaald (zie stap 3.1.4).</li>
		</ol></li>
		<li>Analyse van PEDF-genexpressie in getransfecteerde RPE-cellen
		<ol><li>Isoleer totaal RNA uit de RPE-celpellets (zie stap 3.1.5) met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens het protocol van de fabrikant.</li>
			<li>Kwantificeer RNA-inhoud met behulp van een microvolumespectrofotometer.</li>
			<li>Voer reverse transcriptie uit op 0,1 μg RNA met behulp van een reverse transcriptiesysteem volgens het protocol van de fabrikant.</li>
			<li>Voer real-time qPCR uit zoals eerder beschreven38.</li>
		</ol></li>
		<li>Analyse van transgene insertieplaatsen in getransfecteerde RPE-cellen
		<ol><li>Isoleer genomisch DNA uit de RPE-celpellets (zie stap 3.1.5) met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens het protocol van de fabrikant.</li>
			<li>Kwantificeer DNA-inhoud met behulp van een microvolumespectrofotometer.</li>
			<li>Genereer insertieplaatsbibliotheken met behulp van een computerondersteund hemi-specifiek PCR-schema zoals eerder beschreven38.</li>
			<li>Voer computationele analyse uit zoals eerder beschreven38.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Zoltán Ivics en Zsuzsanna Izsvák zijn uitvinders van verschillende patenten op SB transposon technologie

In ons project streven we naar de niet-virale productie van genetisch gemodificeerde primaire menselijke RPE-cellen die voortdurend overexpressie en afscheiding van een effectieve factor om de getransfecteerde cellen te gebruiken als langetermijntherapeutisch middel voor het creëren en onderhouden van een beschermende omgeving. We hebben de introductie vastgesteld van het gen dat codeert voor PEDF, een alomtegenwoordig tot expressie gebracht multifunctioneel eiwit met anti-angiogene en neuroprotectieve functies. Het hier...

Gevorderde leeftijd wordt beschreven als het belangrijkste risico voor neurodegeneratieve ziekten. Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een polygene ziekte die leidt tot ernstig verlies van het gezichtsvermogen bij patiënten ouder dan 60 jaar, behoort tot de vier meest voorkomende oorzaken van blindheid en slechtziendheid1 en zal naar verwachting toenemen tot 288 miljoen mensen in 20402. Disfuncties van het retinale pigmentepitheel (RPE), een enkele laag dicht opeengepakte cellen tussen de choriocapillaris en de retinale fotoreceptoren, dragen bij aan de pathogenese van AMD. De RPE vervult meerdere taken die essentieel zijn voor een normale retinale functie3 en scheidt een verscheidenheid aan groeifactoren en factoren af die essentieel zijn om de structurele integriteit van het netvlies en de choriocapillaris te behouden, waardoor de overleving van de fotoreceptor wordt ondersteund en een basis wordt gelegd voor de circulatie en de toevoer van voedingsstoffen.
In gezonde ogen is pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) verantwoordelijk voor het balanceren van de effecten van vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) en beschermt neuronen tegen apoptose, voorkomt proliferatie van endotheelcellen en stabiliseert het capillaire endotheel. Een verschoven VEGF-pedf-verhouding is gerelateerd aan oculaire neovascularisatie, die werd waargenomen in diermodellen 4,5 en in monsters van patiënten met choroïdale neovascularisatie (CNV) als gevolg van AMD en proliferatieve diabetische retinopathie 6,7,8,9,10 . De verhoogde VEGF-concentratie is het doel voor de huidige standaardbehandeling. De anti-VEGF-geneesmiddelen bevacizumab, ranibizumab, aflibercept en, meest recent, brolucizumab verbeteren de gezichtsscherpte bij ongeveer een derde van de CNV-patiënten of stabiliseren het gezichtsvermogen in 90% van de gevallen 11,12,13. De frequente, vaak maandelijkse, intravitreale injecties dragen echter het risico op bijwerkingen14, tasten de therapietrouw van de patiënt aan en vormen een aanzienlijke economische last voor de gezondheidszorgstelsels15. Bovendien reageert een bepaald percentage van de patiënten (2%-20%) niet of slechts slecht op de anti-VEGF-therapie 16,17,18,19. Deze negatieve gelijktijdige factoren vereisen de ontwikkeling van alternatieve behandelingen, bijvoorbeeld intraoculaire implantaten, cel- en/of gentherapeutische benaderingen.
Gentherapie is geëvolueerd als veelbelovende behandeling voor erfelijke en niet-erfelijke ziekten en is bedoeld om niet-functionele gensequenties te herstellen of slecht functionerende te onderdrukken. Voor polygene ziekten, waarbij identificatie en vervanging van de oorzakelijke factoren nauwelijks mogelijk is, streven strategieën naar de continue levering van een beschermende factor. In het geval van AMD zijn verschillende additieve therapieën ontwikkeld, zoals de stabiele expressie van endostatine en angiostatine20, de VEGF-antagonist oplosbare fms-achtige tyrosinekinase-1 (sFLT-1)21,22, het complementregulerende eiwitcluster van differentiatie 59 (CD59)23 of PEDF24,25 . Het oog, en vooral het netvlies, is een uitstekend doelwit voor een op genen gebaseerd medicijn vanwege de gesloten structuur, goede toegankelijkheid, kleine omvang en immuunprivilege, waardoor een gelokaliseerde levering van lage therapeutische doses mogelijk is en transplantaties minder vatbaar zijn voor afstoting. Bovendien maakt het oog niet-invasieve monitoring mogelijk en kan het netvlies worden onderzocht met verschillende beeldvormingstechnieken.
Virale vectoren zijn, vanwege hun hoge transductie-efficiëntie, het belangrijkste voertuig om therapeutische genen in doelcellen af te leveren. Afhankelijk van de gebruikte virale vector zijn echter verschillende bijwerkingen beschreven, zoals immuun- en ontstekingsreacties26, mutagene en oncogene effecten27,28 of verspreiding in andere weefsels29. Praktische beperkingen zijn onder meer een beperkte verpakkingsgrootte30 en moeilijkheden en kosten in verband met de productie van partijen31,32 van klinische kwaliteit. Deze nadelen hebben de verdere ontwikkeling bevorderd van niet-virale, op plasmide gebaseerde vectoren die worden overgedragen via lipo-/polyplexen, echografie of elektroporatie. Genomische integratie van het transgen in het gastheergenoom wordt echter meestal niet bevorderd met plasmidevectoren, wat resulteert in een voorbijgaande expressie.
Transposons zijn natuurlijk voorkomende DNA-fragmenten die hun positie in het genoom veranderen, een kenmerk dat is aangenomen voor gentherapie. Dankzij een actief integratiemechanisme zorgen transposon-gebaseerde vectorsystemen voor een continue en constante expressie van het ingebrachte transgen. Het Sleeping Beauty (SB) transposon, gereconstitueerd uit een oud Tc1/mariner-type transposon gevonden in vis33 en verder verbeterd door moleculaire evolutie resulterend in de hyperactieve variant SB100X34, maakte efficiënte transpositie in verschillende primaire cellen mogelijk en werd gebruikt voor de fenotypische correctie in verschillende ziektemodellen35. Op dit moment zijn 13 klinische onderzoeken gestart met behulp van het SB transposon systeem. Het SB100X transposon systeem bestaat uit twee componenten: het transposon, dat bestaat uit het gen van belang geflankeerd door terminale inverted repeats (TIRs), en het transposase, dat het transposon mobiliseert. Na plasmide-DNA-levering aan de cellen bindt het transposase de TIRs en katalyseert het de excisie en integratie van het transposon in het genoom van de cel.
We hebben een niet-virale celgebaseerde additieve therapie ontwikkeld voor de behandeling van neovasculaire LMD. De aanpak omvat de op elektroporatie gebaseerde insertie van het PEDF-gen in primaire pigmentepitheelcellen (PE) door middel van het SB100X transposonsysteem 36,37,38. De genetische informatie van de transposase en PEDF wordt verstrekt op afzonderlijke plasmiden, waardoor de ideale SB100X-PEDF-transposonverhouding kan worden aangepast. Elektroporatie wordt uitgevoerd met behulp van een op pipet gebaseerd capillair transfectiesysteem dat wordt gekenmerkt door een maximale spleetgrootte tussen de elektroden terwijl hun oppervlak wordt geminimaliseerd. Het apparaat bleek uitstekende transfectiesnelheden te bereiken in een breed scala van zoogdiercellen 39,40,41. Het kleine elektrodeoppervlak zorgt voor een uniform elektrisch veld en vermindert de verschillende bijwerkingen van elektrolyse42.
De anti-angiogene functionaliteit van PEDF uitgescheiden door getransfecteerde pigmentepitheelcellen werd aangetoond in verschillende in vitro experimenten die het kiemen, migreren en apoptose van menselijke navelstrenga-endotheelcellen analyseerden43. Bovendien vertoonde transplantatie van PEDF-getransfecteerde cellen in een konijnenmodel van cornea-neovascularisatie44 en een rattenmodel van CNV 43,45,46 een afname van neovascularisatie.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de stabiele insertie van het PEDF-gen in primaire menselijke RPE-cellen via het SB100X-transposonsysteem met behulp van een capillair transfectiesysteem. De getransfecteerde cellen werden gedurende 21 dagen in cultuur gehouden en vervolgens geanalyseerd in termen van PEDF-genexpressie door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en in termen van PEDF-eiwitsecretie door immunoblotting en enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA, figuur 1).

<table><tbody><tr><td>Isolatie van primaire humane RPE-cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-Wells Cultuurschaal</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td>0030722019</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B [250 &micro;g/mL] (AmphoB)</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Colibri Pincet</td><td>Geuder, Heidelberg, Duitsland</td><td>G-18950</td><td></td></tr><tr><td>Geboogd Iris Pincet</td><td>Geuder, Heidelberg, Duitsland</td><td>G-18856</td><td></td></tr><tr><td>Vuilnismesje (Nr. 11)</td><td>Feather, Osaka, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Aangepast Eagle&rsquo;s Medium/Ham&rsquo;s F-12 Nutrient Mixtuur (DMEM/F12)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Duitsland</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fijne Puntige Oogschaartje</td><td>Geuder, Heidelberg, Duitsland</td><td>G-19405</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum [0,2 &micro;m Sterieel Gefilterd] (FBS)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Duitsland</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Pasteur Pipetten</td><td>Brand, Wertheim, Duitsland</td><td>747715</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline [10.000 eenheden/mL] en Streptomycine [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Pipettipuntjes (1000 &micro;L)</td><td>Starlab, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eenkanaals Pipet (100-1000 &micro;L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele Afdekdoek</td><td>Lohmann &amp; Rauscher, Rengsdorf, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele Gauzekompres</td><td>Fink-Walter, Merchweiler, Duitsland</td><td>321063</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Handschoenen</td><td>Sempermed, Wien, Oostenrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele Petrischaal (Falcon 60 mm x 15 mm)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Chirurgische Kleding</td><td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recht Iris Pincet</td><td>Geuder, Heidelberg, Duitsland</td><td>G-18855</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatie van primaire humane RPE-cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-Wells Cultuurschaal</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>24-Wells Cultuurschaal</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td>0030722019</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B [250 &micro;g/mL] (AmphoB)</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Aangepast Eagle&rsquo;s Medium/Ham&rsquo;s F-12 Nutrient Mixtuur (DMEM/F12)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Duitsland</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifugebuisjes (1,5 mL)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum [0,2 &micro;m Sterieel Gefilterd] (FBS)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Duitsland</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd Microscoop</td><td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Duitsland</td><td>Leica DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Microvolume Spectrofotometer (NanoDrop Spectrofotometer)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaire Transfectie Systeem (Neon Transfectie Systeem)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfectie Systeem 10 &micro;L Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer (Neubauer Kamer)</td><td>Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Duitsland</td><td>0640110</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco zonder Ca2+ zonder Mg2+</td><td>Biochrom, Berlijn, Duitsland</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline [10.000 eenheden/mL] en Streptomycine [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Pipettipuntjes (10 &micro;L)</td><td>Starlab, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettipuntjes (1000 &micro;L)</td><td>Starlab, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettipuntjes (200 &micro;L)</td><td>Starlab, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Duitsland</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>Eenkanaals Pipet (0,1-10 &micro;L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eenkanaals Pipet (100-1000 &micro;L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eenkanaals Pipet (10-200 &micro;L)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw Oplossing</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05&nbsp;%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Analyses van getransfecteerde primaire humane RPE-cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Incubatie Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SDS Sample Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Incubatie Buffer (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazool, pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran Ondersteunde 0,2 &micro;m&nbsp;Nitrocellulose Blotting Membraan</td><td>Cytiva, Marlborough, MA</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B [250 &micro;g/mL] (AmphoB)</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PEDF Antilichamen (Konijn Polyklonaal)</td><td>BioProducts, Middletown, MD</td><td>AB-PEDF1</td>

op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het sleeping beauty transposon-systeem

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Onze steeds ouder wordende samenleving leidt tot een groeiende incidentie van neurodegeneratieve ziekten. Tot nu toe zijn de pathologische mechanismen onvoldoende begrepen, waardoor de vaststelling van gedefinieerde behandelingen wordt belemmerd. Celgebaseerde additieve gentherapieën voor de verhoogde expressie van een beschermende factor worden beschouwd als een veelbelovende optie om neurodegeneratieve ziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), te mediteren. We hebben een methode ontwikkeld voor de stabiele expressie van het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF), die wordt gekenmerkt als een neuroprotectief en anti-angiogeen eiwit in het zenuwstelsel, in het genoom van primaire menselijke pigmentepitheelcellen (PE) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Primaire PE-cellen werden geïsoleerd uit menselijke donorogen en in cultuur gehouden. Na het bereiken van confluence werden 1 x 104 cellen gesuspendeerd in 11 μL resuspensiebuffer en gecombineerd met 2 μL van een gezuiverde oplossing met 30 ng hyperactief SB (SB100X) transposaseplasmide en 470 ng PEDF transposonplasmide. Genetische modificatie werd uitgevoerd met een capillair elektroporatiesysteem met behulp van de volgende parameters: twee pulsen met een spanning van 1.100 V en een breedte van 20 ms. Getransfecteerde cellen werden overgebracht in kweekplaten met medium aangevuld met foetaal runderserum; antibiotica en antimycotica werden toegevoegd met de eerste medium uitwisseling. Succesvolle transfectie werd aangetoond in onafhankelijk uitgevoerde experimenten. Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) toonde de verhoogde expressie van het PEDF-transgen . PEDF-secretie was significant verhoogd en bleef stabiel, zoals geëvalueerd door immunoblotting en gekwantificeerd door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-gemedieerde overdracht zorgde voor een stabiele PEDF-genintegratie in het genoom van PE-cellen en zorgde voor de continue afscheiding van PEDF, wat van cruciaal belang is voor de ontwikkeling van een celgebaseerde gentoevoegingstherapie voor de behandeling van AMD of andere retinale degeneratieve ziekten. Bovendien wees analyse van het integratieprofiel van het PEDF-transposon in menselijke PE-cellen op een bijna willekeurige genomische verdeling.

Teelt en elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellen We hebben aangetoond dat het zaaien van een voldoende aantal primaire RPE-cellen van dierlijke oorsprong de teelt en groei mogelijk maakt tot een geïntegreerde monolaag van gepigmenteerde, zeshoekig gevormde cellen 36,37,48. Hun vermogen om tight junctions te vormen, fagocytische activiteit te vertonen en specifieke ma...

We hebben een protocol ontwikkeld om primaire menselijke pigmentepitheelcellen te transfecteren door elektroporatie met het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Succesvolle transfectie werd aangetoond door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), immunoblotting en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Deze methode demonstreert op elektroporatie gebaseerde transfectie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon System, een bewijs voor transgene expressie en eiwitsecretie. De combinatie van het Sleeping Beauty Transposon-systeem en elektroporatie maakt een efficiënte transfectie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen mogelijk, evenals stabiele en persistente transgene expressie en eiwitsecretie. Het algemene doel is om een celgebaseerde genadditietherapie op te zetten voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten, die een stabiele en aanhoudende afscheiding van het therapeutisch actieve eiwit vereist.De procedure wordt gedemonstreerd door Anne Freialdenhoven en Antje Schiefer, medisch technisch assistenten van het laboratorium. Om Plasmid DNA voor te bereiden op primaire menselijke RPE-celelektroporatie, gebruikt u een microvolumespectrofotometer om de Plasmid DNA-inhoud te kwantificeren en de concentratie aan te passen tot 250 nanogram per microliter in 10 millimol Tris-HCL. Meng één volume van 250 nanogram per microliter SB100X transposase Plasmid DNA met 16 volumes van 250 nanogram per microliter pigmentepitheel afgeleide factor transposon Plasmid DNA.Voeg twee microliter van het resulterende plasmamengsel toe aan een steriele 1,5 milliliter veilige vergrendelingsmicrocentrifugebuis op ijs en vul een bufferbuis met drie milliliter buffer E.Steek vervolgens de buis in het pipetstation totdat een klik wordt gehoord en stel het transfectieapparaat in op 1.100 volt, een pulsbreedte van 20 milliseconden en twee pulsen. Om de cellen voor te bereiden op elektroporatie. Controleer eerst de morfologie van de primaire RPE-celculturen via fasecontrastmicroscopie om hun groei en confluentie te beoordelen.Behandel de cellen met 500 microliter van 0,05% Trypsine EDTA per put gedurende zeven tot 15 minuten in de celkweekincubator. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, verzamelen de cellen door centrifugatie, resuspenseren de cellen in één milliliter PBS en centrifugeer één tot 10 keer 10 tot de vier cel aliquots per transfectiereactie. Resuspendeer de pellets in 11 microliter buffer R per buis en voeg twee microliter van het bereide plasmidemengsel toe aan elke buis.Steek de kop van een transfectiepipet in een transfectiepunt van 10 microliter totdat de klem de montagesteel van de zuiger volledig oppakt en laad de cel- en plasmideoplossing in de transfectiepunt. Plaats de transfectiepipet in de bufferbuis in het pipetstation totdat een klik wordt gehoord en druk op start om het elektroporatieproces te starten. Verwijder na de transfectie voorzichtig de transfectiepipet uit het pipetstation en pipetteer onmiddellijk de cel en plasmide-oplossing in de voorbereide putten van de celkweekplaat.Om zijn gelabelde pigmentepitheel te zuiveren, zijn factorfusie-eiwitten afgeleid van RPE-celkweeksupernatanten. Gebruik eerst een schuine gesneden punt om één 30 microliter aliquot nikkel NTA-slurry per monster te verzamelen en pelleteer de nikkel NTA-hars door centrifugatie. Resuspenseer de nikkel NTA-hars voorzichtig met 200 microliter One X incubatiebuffer en pelleteer de oplossing twee keer met een extra centrifugatie.Na de tweede centrifugatie resuspenseert u de nikkel NTA-harspellets zorgvuldig met 40 microliter Four X incubatiebuffer per monster. Meng vervolgens 55 microliter van één aliquot voorbehandelde nikkel NTA-slurry met 260 microliter Four X incubatiebuffer en 900 microliter van elk transefcted RPE-celkweeksupernatant. Incubeer het mengsel op een schommelende shaker bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten en pelleteer de nikkel NTA-harsmengsels opnieuw.Resuspenseer de pellets voorzichtig in 175 microliter One X incubatiebuffer en centrifugeer de mengsels nog twee keer. Na de tweede centrifugatie de nikkel NTA-harspellets zorgvuldig resuspenseren in 30 microliter elutiebuffer gedurende een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur met schudden en de monsters opnieuw centrifugeren. Verzamel vervolgens zorgvuldig de supernatanten en meng ze met Two X SDS-monsterbuffer voor westerse bloedanalyse van de gezuiverde eiwitten.Gecultiveerde primaire RPE-cellen geïsoleerd uit menselijke donorogen vertonen een typische kasseimorfologie, ongeacht de leeftijd van de donor, postmortale tijd van isolatie of tijd van cultivatie. De toepassing van kortdurende elektrische pulsen op primaire menselijke RPE-cellen. Het gebruik van het capillaire transfectiesysteem heeft geen nadelige invloed op de epitheliale morfologie.Westerse bloedanalyse van getransfecteerde primaire humane RPE-celkweeksupernatanten toont pigmentepitheel afgeleide factorsecretie op consistente niveaus zonder transgene uitschakeling gedurende meer dan 500 dagen. Zoals waargenomen in deze representatieve westerse bloedanalyse van celkweekmedium van in serieel uitgevoerde transfecties, wordt een universeel hogere van pigmentepitheel afgeleide factorsecretiesnelheid waargenomen op 21 dagen na transfectie. In een nagestreefde cultuur duurt langdurige verhoogde PEDF-secretie minstens 165 dagen.Bovendien onthult elisa-gebaseerde kwantificering een 20-voudige toename van totale pigmentepitheel afgeleide factorsecretie in getransfecteerde primaire menselijke RPE-cellen in vergelijking met respectieve niet-getransfecteerde controlecellen. Deze toename werd ook bevestigd op het genexpressieniveau waarop de totale PEDF-expressie meer dan 30 keer werd verhoogd. Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om pigmentepitheelcellen te gebruiken waarvan de morfologie overeenkomt met de In Vivo-status.Vergeet ook niet om de celoplossing in de transfectiepunt op te zuigen zonder luchtbellen. De stabiel getransfecteerde cellen kunnen worden gebruikt in verschillende Ex Vivo- of In vivo-modellen om de functionaliteit van deze op cellen gebaseerde gentoevoegingstherapie te verifiëren.

electroporation-based-genetic-modification-primary-human-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie...

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

We beschrijven een werkwijze voor genetisch primaire humane T cellen te veranderen met een transgen via de...

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

This video demonstrates the procedure to generate motor neurons by transfection of human iPSCs with PiggyBac transposon system by the ectopic expression of lineage-specific transcription factors.

PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System

T cellen die een CD19-antigen specifieke chimere receptor (CAR) worden toegediend als onderzoek behandeling van B-cel maligniteiten in de eerste-in-humane gentherapie trials. We beschrijven genetische modificatie van T cellen met behulp van...

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

De pial oppervlak is een uniek voorlopercellen zone in het CZS, die krijgt steeds meer aandacht. Hierin hebben we gedetailleerd een methode voor snelle genetische manipulatie van deze voorlopercellen zone met een aangepaste elektroporatiewerkwijze. Deze procedure kan worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire analyses van cellijnen en signaalwegen betrokken bij celdifferentiatie en het lot en de eigenschappen van dochtercellen helderen.

Neonatale Pial Surface Elektroporatie

Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Ex-ovo Elektroporatie Aanpak

Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.

Een efficiënte In Vitro omzetting methode door een Transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty systeem verpakt in een defecte lentivirale Vector integratie

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

We presenteren een protocol voor de ontwikkeling en het gebruik van een oxidatieve stress-model door retinale pigmentepitheelcellen te behandelen met H2O2, waarbij celmorfologie, levensvatbaarheid, dichtheid, glutathion en UCP-2-niveau worden geanalyseerd. Het is een nuttig model om het antioxiderende effect te onderzoeken van eiwitten die worden uitgescheiden door getransfecteerde cellen om neuroretinale degeneratie te behandelen.

Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire iris- en retinale pigmentepitheelcellen van verschillende zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, varkens en runderen) te isoleren en te transfecteren. De methode is bij uitstek geschikt om oculaire gentherapiebenaderingen te bestuderen in verschillende opstellingen voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen.

Isolatie, kweek en genetische manipulatie van primaire pigmentepitheelcellen van zoogdieren voor niet-virale gentherapie

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Leer elektroporatie-gebaseerde transfektie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met het Sleeping Beauty Transposon-systeem. Deze methode realiseert stabiele transgenexpressie voor gentherapie bij retinale degeneratieve ziekten.

Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem (Video) | JoVE Journal

Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

Meer video's verkennen