Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

Deze methode demonstreert op elektroporatie gebaseerde transfectie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon System, een bewijs voor transgene expressie en eiwitsecretie. De combinatie van het Sleeping Beauty Transposon-systeem en elektroporatie maakt een efficiënte transfectie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen mogelijk, evenals stabiele en persistente transgene expressie en eiwitsecretie. Het algemene doel is om een celgebaseerde genadditietherapie op te zetten voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten, die een stabiele en aanhoudende afscheiding van het therapeutisch actieve eiwit vereist.

De procedure wordt gedemonstreerd door Anne Freialdenhoven en Antje Schiefer, medisch technisch assistenten van het laboratorium. Om Plasmid DNA voor te bereiden op primaire menselijke RPE-celelektroporatie, gebruikt u een microvolumespectrofotometer om de Plasmid DNA-inhoud te kwantificeren en de concentratie aan te passen tot 250 nanogram per microliter in 10 millimol Tris-HCL. Meng één volume van 250 nanogram per microliter SB100X transposase Plasmid DNA met 16 volumes van 250 nanogram per microliter pigmentepitheel afgeleide factor transposon Plasmid DNA.

Voeg twee microliter van het resulterende plasmamengsel toe aan een steriele 1,5 milliliter veilige vergrendelingsmicrocentrifugebuis op ijs en vul een bufferbuis met drie milliliter buffer E.Steek vervolgens de buis in het pipetstation totdat een klik wordt gehoord en stel het transfectieapparaat in op 1.100 volt, een pulsbreedte van 20 milliseconden en twee pulsen. Om de cellen voor te bereiden op elektroporatie. Controleer eerst de morfologie van de primaire RPE-celculturen via fasecontrastmicroscopie om hun groei en confluentie te beoordelen.

Behandel de cellen met 500 microliter van 0,05% Trypsine EDTA per put gedurende zeven tot 15 minuten in de celkweekincubator. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, verzamelen de cellen door centrifugatie, resuspenseren de cellen in één milliliter PBS en centrifugeer één tot 10 keer 10 tot de vier cel aliquots per transfectiereactie. Resuspendeer de pellets in 11 microliter buffer R per buis en voeg twee microliter van het bereide plasmidemengsel toe aan elke buis.

Steek de kop van een transfectiepipet in een transfectiepunt van 10 microliter totdat de klem de montagesteel van de zuiger volledig oppakt en laad de cel- en plasmideoplossing in de transfectiepunt. Plaats de transfectiepipet in de bufferbuis in het pipetstation totdat een klik wordt gehoord en druk op start om het elektroporatieproces te starten. Verwijder na de transfectie voorzichtig de transfectiepipet uit het pipetstation en pipetteer onmiddellijk de cel en plasmide-oplossing in de voorbereide putten van de celkweekplaat.

Om zijn gelabelde pigmentepitheel te zuiveren, zijn factorfusie-eiwitten afgeleid van RPE-celkweeksupernatanten. Gebruik eerst een schuine gesneden punt om één 30 microliter aliquot nikkel NTA-slurry per monster te verzamelen en pelleteer de nikkel NTA-hars door centrifugatie. Resuspenseer de nikkel NTA-hars voorzichtig met 200 microliter One X incubatiebuffer en pelleteer de oplossing twee keer met een extra centrifugatie.

Na de tweede centrifugatie resuspenseert u de nikkel NTA-harspellets zorgvuldig met 40 microliter Four X incubatiebuffer per monster. Meng vervolgens 55 microliter van één aliquot voorbehandelde nikkel NTA-slurry met 260 microliter Four X incubatiebuffer en 900 microliter van elk transefcted RPE-celkweeksupernatant. Incubeer het mengsel op een schommelende shaker bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten en pelleteer de nikkel NTA-harsmengsels opnieuw.

Resuspenseer de pellets voorzichtig in 175 microliter One X incubatiebuffer en centrifugeer de mengsels nog twee keer. Na de tweede centrifugatie de nikkel NTA-harspellets zorgvuldig resuspenseren in 30 microliter elutiebuffer gedurende een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur met schudden en de monsters opnieuw centrifugeren. Verzamel vervolgens zorgvuldig de supernatanten en meng ze met Two X SDS-monsterbuffer voor westerse bloedanalyse van de gezuiverde eiwitten.

Gecultiveerde primaire RPE-cellen geïsoleerd uit menselijke donorogen vertonen een typische kasseimorfologie, ongeacht de leeftijd van de donor, postmortale tijd van isolatie of tijd van cultivatie. De toepassing van kortdurende elektrische pulsen op primaire menselijke RPE-cellen. Het gebruik van het capillaire transfectiesysteem heeft geen nadelige invloed op de epitheliale morfologie.

Westerse bloedanalyse van getransfecteerde primaire humane RPE-celkweeksupernatanten toont pigmentepitheel afgeleide factorsecretie op consistente niveaus zonder transgene uitschakeling gedurende meer dan 500 dagen. Zoals waargenomen in deze representatieve westerse bloedanalyse van celkweekmedium van in serieel uitgevoerde transfecties, wordt een universeel hogere van pigmentepitheel afgeleide factorsecretiesnelheid waargenomen op 21 dagen na transfectie. In een nagestreefde cultuur duurt langdurige verhoogde PEDF-secretie minstens 165 dagen.

Bovendien onthult elisa-gebaseerde kwantificering een 20-voudige toename van totale pigmentepitheel afgeleide factorsecretie in getransfecteerde primaire menselijke RPE-cellen in vergelijking met respectieve niet-getransfecteerde controlecellen. Deze toename werd ook bevestigd op het genexpressieniveau waarop de totale PEDF-expressie meer dan 30 keer werd verhoogd. Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om pigmentepitheelcellen te gebruiken waarvan de morfologie overeenkomt met de In Vivo-status.

Vergeet ook niet om de celoplossing in de transfectiepunt op te zuigen zonder luchtbellen. De stabiel getransfecteerde cellen kunnen worden gebruikt in verschillende Ex Vivo- of In vivo-modellen om de functionaliteit van deze op cellen gebaseerde gentoevoegingstherapie te verifiëren.