Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Dit is het eerste protocol dat het mogelijk maakt menselijk borstweefsel gedurende langere tijd in leven te houden ex vivo, waardoor de studie van interacties tussen menselijk borstweefsel en menselijke borstkanker mogelijk is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt macroscopische stukjes menselijk borstweefsel, waaronder borstadipocyten, immuuncellen, vasculaire structuren, ductale structuren en extracellulaire matrix, ex vivo in leven te houden. Deze techniek heeft grote implicaties voor verschillende gebieden van borstkankeronderzoek, waaronder gepersonaliseerde geneeskunde, farmaceutische ontwikkeling en de pathofysiologie van tumorinitiatie en langzamere borstkankerprocessen zoals fibrose en extracellulaire matrixremodellering.

Aantoont deze procedure zijn Katherine Hebert, een Tulane afgestudeerde student en Rakesh Gurrala een Tulane medische student van mijn lab. Smelt om te beginnen de bereide gelatineoplossing in een waterbad van 37 graden Celsius. Gebruik een serologische pipet van vijf of tien milliliter om 2,5 milliliter van deze oplossing op elke zuiger te doseren voor putten van een plaat met zes putten.

Zodra de gelatine is gestold, verplaatst u de pNIPAAm gecodeerde ASC-platen naar de bioveiligheidskast. Plaats de plunjers voorzichtig in de putten van deze platen zodat de gelatine in contact komt met de ASC's. Plaats een metalen ring op de zuiger om deze te verzwawegen, zodat de gelatine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in direct contact staat met de ASC-plaat.

Verplaats de plaat voorzichtig met de plunjers in de steriele doos in de bioveiligheidskast en plaats het deksel erop. Verplaats de doos naar een koelkast van vier graden of plaats de plaat gedurende 30 minuten op ijs en een ijsemmer in de bioveiligheidskast. Was in een bioveiligheidskast het menselijk borstweefsel driemaal met 10 milliliter steriel PBS.

Gebruik steriele tang en een scheermesje om de BC-MPS grof te gehakt en probeer zoveel mogelijk fascia en bindweefsel te verwijderen. Zodra het bindweefsel is verwijderd, gebruikt u een steriel scheermesje om het weefsel uiteindelijk te gehakt totdat het een homogene vloeistofconsistentie heeft. Snijd de punt van een P1000 pipetpunt om te helpen bij het pipetten van het gehakte weefsel.

Combineer in een buis van 1,5 milliliter het gehaktweefsel, de kankercellijnen en bc-mps-media zoals beschreven in het teksthandschrift. Verplaats de ACS-plaat die voor het onderste celblad wordt gebruikt van de incubator naar de bioveiligheidskast en aspireer de media van de plaat. Pipetteer het bereide borstweefselmengsel in het midden van de put van de onderste ACS-plaat met behulp van de gesneden pipettip, verplaats de doos met de bovenste ACS-plaat met plunjers naar de bioveiligheidskast.

Verwijder voorzichtig de gelatine plunjers van de pNIPAAm gecoate plaat en leg ze bovenop het weefselmengsel. Voeg BC-MPS-media toe aan de put en verplaats de onderste ACS-platen voorzichtig met het BC-MPS-mengsel en de plunjers naar de steriele plastic doos. Plaats het deksel van de doos op voor transport, zorg ervoor dat besmetting van de cultuur wordt voorkomen.

Incubeer de bodemplaat in de doos en de incubator van 37 graden Celsius totdat de gelatine is gesmolten en de bovenste ACS-laag zich begint te hechten aan de onderste laag. Verplaats vervolgens de doos met de platen naar de bioveiligheidskast, verwijder voorzichtig de plunjers van de onderste platen om het weefsel te observeren met de kankercellen verankerd aan de bodem van de put. Plaats het deksel van de zesputplaat terug op de bodemplaat en incubeer op 37 graden om de gelatine volledig te smelten en de bovenste laag te laten verankeren aan de onderste laag.

Verplaats de platen voorzichtig naar een bioveiligheidskast en aspireer de media vanaf de rand van de put met een serologische pipet van 10 milliliter. Voeg twee milliliter verse media toe aan de rand van elke put om te voorkomen dat het weefsel loskomt. Houd de BC-MPS op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende de gewenste tijdsduur.

De media om de twee tot drie dagen veranderen. Verplaats de plaat naar de bioveiligheidskast wanneer de BC-MPS klaar is om te worden geanalyseerd. Verwijder media met een serologische pipet om te voorkomen dat weefsel per ongeluk loskomt.

Voeg één volume PBS toe aan elke put. Verwijder vervolgens de PBS met een serologische pipet. Voeg een milliliter celdissociatieoplossing toe aan elke put en verplaats de plaat vijf minuten terug naar de incubator om deze cellen los te laten.

Gebruik na incubatie een celschraper om de cellen en het weefsel volledig los te maken van de kweekplaat in een bioveiligheidskast. Breng de oplossing met het weefsel over in een conische buis van 15 milliliter en verzamel de resterende cellen door twee milliliter PBS toe te voegen. Wikkel de buis in met aluminiumfolie als de cellen fluorescerend zijn.

Incubeer de buis op 37 graden onder constante agitatie in een orbitale shaker op een keer G gedurende 10 tot 20 minuten om de cellen volledig van het weefsel te scheiden. Gebruik in een bioveiligheidskast een serologische pipet om eventuele resterende klonten cellen in de buis te verstoren. En filter het monster door een weefselzeef van 250 micrometer in een nieuwe buis van 15 milliliter.

Spoel de zeef af met één milliliter PBS om de resterende cellen te verzamelen. Centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten op 500 maal g bij kamertemperatuur om de adipocyten die in de bovenste laag drijven te scheiden van de kankercellen en ASC's die in een pellet met elkaar worden gemengd. Breng de adipocytlaag over in een nieuwe buis met behulp van een stomp gesneden pipetpunt.

Centrifugeer het monster opnieuw en gebruik een spuit en een naald om de resterende oplossing onder de adipocyten vandaan te verwijderen. Aspireer de resterende oplossing uit de buis met de ASC's en kankercellen zonder de celkorrel te verstoren. S hang de pellet opnieuw op in PBS- of BC-MPS-media en gebruik flowcytometrie om de cellen te sorteren op basis van fluorescentie.

Het stri-aided patroon van het samenvloeiende ASC-blad wordt hier weergegeven. Het drijvende menselijke borstweefsel was nog steeds stabiel verankerd door de ASC-celbladen aan de onderkant van de put na 14 dagen cultuur. Fluorescerende microscopiebeelden tonen de stabiliteit van de BC-MPS met MDA-MB-231 die rfp-cellijnen uitdrukt na 14 dagen en met drievoudige negatieve tumor explant PDX gedurende ten minste zes dagen.

BC-MPS met borstweefsel werd gedurende 14 dagen in vitro gekweekt, gekleurd en afgebeeld om de inheemse elementen van het weefsel bij 100X en 20X vergroting te demonstreren. Kleuring van de macrofaagmarkers werd gebruikt om het behoud van primaire macrofagen na drie en zeven dagen in cultuur aan te tonen. Flow cytometrie analyse van Bodipy bevlekte MDA-MB-231 cellen na 14 dagen wijzen op minimale lipide accumulatie in 2D cultuur en uitgebreide lipide accumulatie en BC-MPS.

Het aandeel lipidepositieve MDA-MB-231 cellen was 26,2 keer groter in BC-MPS dan 2D-cultuur. Cellen gekweekt in BC-MPS vertoonden verhoogde lipidedruppels in vergelijking met cellen gekweekt in standaard 2D-cultuur. Time-lapse beelden van RFP gelabeld BC-MPS met MDA-MB-231 cellen toonden amoebe beweging van 231 cellen met pseudo pods en hoge beweeglijkheid.

Het borstweefsel moet klein genoeg worden gehakt en voldoende worden gescheiden om over de bodem van de put te worden verdeeld. Borstweefsel is erg levendig en als de stukken te groot zijn of te dicht bij elkaar zijn geclusterd, kunnen de ASC-celbladen het borstweefsel niet aan de onderkant van de put verankeren. De resulterende borstweefselkankerconstructies kunnen enzymatische spijsvertering ondergaan om bepaalde celtypen van belang te isoleren.

Hierdoor kunnen belangrijke vragen worden beantwoord, zoals hoe kankercellen in borstweefsel anders reageren op chemotherapie in vergelijking met traditionele 2D-cultuur of organoïden.