Name: Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer hoe u een microfysiologisch systeem bouwt voor borstkankeronderzoek met behulp van primair menselijk borstweefsel. Deze methode behoudt weefsels ex vivo levend voor gedetailleerde studies van tumorinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de Tulane Flow Cytometrie en Cell Sorting Core en de Tulane Histology Core bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant en de National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Alle menselijke weefsels werden verzameld in overeenstemming met protocol #9189 zoals goedgekeurd door het Institutional Review Board Office van LSUHSC.
1. Zaaien van adipose-afgeleide stamcellen (ASC's) voor celbladen
<ol><li>Asc 's kopen uit commerciële bronnen of isoleren van primair menselijk borstweefsel door de vastgestelde protocollen8,9 te volgen. Zaad menselijke borst ASC's bij 70% dichtheid (~80.000 cellen/cm2 oppervlakte) op 6-goed standaard weefselkweekplaten in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum en 1% Penicilline/Streptomycine (BC-MPS Media). Zorg ervoor dat de ASC's die voor de vorming van de celbladen moeten worden gebruikt, kleiner moeten zijn dan passage 10.<ol>
<li>Voor elke put van borstkanker microfysiologisch systeem (BC-MPS) dat zal worden gegenereerd, zaadcellen in 1 standaard weefselkweek goed en 1 put van vergelijkbare grootte op poly (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm) gecoate weefselkweek plastic plaat. Een 6-put plaat van BC-MPS vereist een standaard weefselkweek 6 put plaat (bodem) en een pNIPAAm-gecoate plaat (boven). De pNIPAAm platen kunnen worden gekocht bij commerciële bronnen of kunnen worden gecoat in-lab10,11,12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kweek ASC's in een weefselkweekincubator bij 37 ° C en 5% CO2. Verander de media elke 2-3 dagen in een bioveiligheidskast.</li>
	<li>Kweek de ASC's totdat ze 100% samenvloeien en een dwars doorspannen patroon vormen. Afhankelijk van de samenvloeiing waarbij ze werden gezaaid, duurt dit 7-10 dagen. Confluente celbladen zijn nodig om het drijvende vetborstweefsel te verankeren.</li>
</ol>2. Voorbereiding van de voor BC-MPS benodigde voorraden
<ol><li>Om gelatine te bereiden voor 6-put platen maak een 12% gelatineoplossing in gedestilleerde H2O. Meng 19 g gelatine type B (gelsterkte van ~225 Bloom) en 125 ml H2O in een glazen mediafles van 250 ml. Voeg 1,6 ml 1 M NaOH toe aan de oplossing om de pH te neutraliseren.</li>
	<li>Autoclaaf de oplossing gedurende 25 minuten onder een vloeistofcyclus om de oplossing te steriliseren.</li>
	<li>Laat de oplossing afkoelen tot 37 °C. Voeg in een steriele bioveiligheidskast 16 ml steriele 10x Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) toe aan de oplossing om een eindvolume van 160 ml te verkrijgen. OPMERKING: De gelatineoplossing kan direct worden gebruikt of op kamertemperatuur worden bewaard voor later gebruik. De bereide gelatine is 1 maand stabiel bij kamertemperatuur. Als er slechts enkele plunjers nodig zijn, kan een oplossing van 10 ml worden gemaakt en steriel worden gefilterd op dezelfde dag als het maken van BC-MPS zoals eerder beschreven7.<ol>
<li>Om gelatineoplossing te bereiden door filtersterilisatie, verdun 1 ml 10x HBSS met 9 ml H2O om een 1x HBSS-oplossing te maken in een conische buis van 15 ml. Voeg 100 μL 1 M NaOH toe aan elke buis van 10 ml en voeg vervolgens 0,7 g gelatine toe aan de oplossing. Meng de oplossing krachtig om de gelatine op te lossen.</li>
		<li>Incubeer de buis in een waterbad van 75 °C gedurende 20 minuten schudden om de 5 minuten. Gebruik een spuit van 10 ml en een spuitfilter van 0,22 μm om de gelatineoplossing te filteren. Filtreer de gelatineoplossing rechtstreeks op de plunjers in een bioveiligheidskast.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D-printen of gebruik eenvoudig acryl om de plunjers te maken die worden gebruikt voor het overbrengen van de celbladen. Zorg ervoor dat de plunjers losjes in de gewenste maat goed passen. Een standaard 3D-geprinte plunjer is weergegeven in figuur 1. De plunjers kunnen worden ontworpen met behulp van standaard computerondersteunde ontwerpsoftware zoals TinkerCad en worden afgedrukt met filament 3D-printers die compatibel zijn met polylactic acid (PLA)13,14.</li>
	<li>Om een rek voor te bereiden voor het vasthouden van de plunjers plaatst u een buizenrek van 15 ml in een bioveiligheidskast. Plaats plunjers ondersteboven in het rek, zodat de onderkant van de plunjers naar boven is gericht. Plaats een plastic doos met deksel voor het transport van BC-MPS in de bioveiligheidskast. Het wordt aanbevolen om de doos minstens 35,5 cm lengte x 28 cm breedte x 8,25 cm hoogte te hebben voor 4 platen BC-MPS. Haal het deksel uit de doos en spuit het rek, de plunjers en de doos met 70% EtOH.</li>
	<li>Bereid steriele scheermesjes en tangen door ze te autoclaafen of door ze in een bioveiligheidskast te plaatsen en te wassen met 70% EtOH.</li>
	<li>Besproei de plunjers en doos met 70% EtOH en zet het UV-licht in de bioveiligheidskast minstens 30 minuten aan om de benodigdheden te steriliseren.</li>
</ol>3. Bereid gelatine plunjers en breng aan op de bovenste celbladen
<ol><li>Als de gelatineoplossing eerder is bereid, verwarmt u deze in een waterbad van 37 ° C om het te smelten.</li>
	<li>Pipet de gelatineoplossing op de plunjers in de bioveiligheidskast met behulp van een serologische pipet van 5 of 10 ml. Een plunjer voor 1 put van een 6-put plaat vereist ~ 2,5 ml gelatine.</li>
	<li>Zodra de gelatine op de plunjers is gestold (~ 30-45 min) verplaatst u de pNIPAAm-gecoate ASC-platen naar de bioveiligheidskast. Plaats de plunjers voorzichtig in de putten van de met pNIPAAm gecoate ASC-platen, zodat de gelatine in contact komt met de ASC's. Plaats een metalen ring (~7,5 g) op de zuiger om de zuiger te verzwawegen, zodat gelatine in direct contact komt met de ASC-celplaat. Laat de zuigers 30 minuten op kamertemperatuur op de ASC-celbladen staan.</li>
	<li>Verplaats de plaat voorzichtig met de plunjers in de steriele doos in de bioveiligheidskast en plaats het deksel erop. Zet de doos 30 minuten in een koelkast van 4 °C. Als er geen koelkast van 4 °C beschikbaar is, plaatst u de plaat op ijs in een ijsemmer in de bioveiligheidskast gedurende 30 minuten.</li>
</ol>4. Voorbereiding van kankercellijnen
<ol><li>Zaai de kankercellijnen in een standaard T75 weefselkweekschaal en bewaar ze in cultuur zodat ze ~80% samenvloeien op de dag dat BC-MPS wordt verwerkt. (~200.000 kankercellen zijn nodig per BC-MPS). Laat de kankercellen groeien in normale media. OPMERKING: Om de kankercellen te identificeren en te isoleren, wordt aanbevolen dat de cellen worden getransfecteerd met een fluorescerend eiwit om ze te onderscheiden van de ASC's en borstweefsel. Het aantal kankercellen dat nodig is per BC-MPS is geoptimaliseerd voor MCF7- en MDA-MB-231-cellen. Andere cellijnen moeten mogelijk verder worden geoptimaliseerd.</li>
	<li>Op de dag dat de BC-MPS wordt voorbereid, verplaatst u de kolf met de kankercellen naar de bioveiligheidskast. Aspireer de media uit de kolf. Was de kolf met 5 ml PBS.</li>
	<li>Voeg 1 ml celloslatingsoplossing toe aan de kolf met de kankercellen en incubeer de kolf vervolgens in een incubator van 37 °C totdat de cellen zijn losgeraakt (~2-5 min).</li>
	<li>Voeg in de bioveiligheidskast 9 ml PBS toe aan de kolf, breng de cellen in PBS over in een conische buis van 15 ml en tel het celnummer met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugeer de kankercellen 5 min op kamertemperatuur op 500 x g.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in BC-MPS media zodat er 2 x 106 cellen/ml zijn.</li>
	<li>Plaats de kankercellen in een waterbad van 37 °C totdat ze klaar zijn om aan het menselijk weefsel te worden toegevoegd.</li>
</ol>5. Verwerking van menselijk borstweefsel
<ol><li>Was in een bioveiligheidskast het menselijk borstweefsel (HBT) 3x met 10 ml steriel PBS.</li>
	<li>Gebruik steriele tang en een scheermesje om de BC-MPS grof te gehakt en probeer zoveel mogelijk fascia en bindweefsel te verwijderen. Het niet verwijderen van het bindweefsel kan ertoe leiden dat de ASC-bovenlaag de HBT niet goed verankert. OPMERKING: De fascia en het bindweefsel zijn te herkennen aan het witte of heldere uiterlijk in vergelijking met de gele kleur van het vetweefsel.</li>
	<li>Zodra het bindweefsel is verwijderd, gebruikt u een steriel scheermesje om het weefsel fijn te gehakt totdat het een homogene vloeistofconsistentie heeft. Het weefsel wordt fijngehakt wanneer het gemakkelijk kan worden gepijpt met behulp van een serologische tip van 25 ml.</li>
	<li>Gebruik een steriel scheermesje om de punt van een p1000 pipetpunt af te snijden om te helpen bij het pipetten van de gehakte HBT.</li>
	<li>Meng in een buis van 1,5 ml het gehakte HBT, de kankercellijnen en de BC-MPS-media (voor 1 put van een plaat met 6 putjes is 200 μL gehakte HBT, 100 μL BC-MPS-media en 100 μL kankercellen nodig).</li>
	<li>Verplaats de ASC-plaat die voor het onderste celblad wordt gebruikt van de incubator naar de bioveiligheidskast. Aspireer de media van de onderste ASC-plaat. Pipetteer het mengsel op het midden van de put van de onderste ASC-plaat met behulp van een p1000 pipetpunt met het distale uiteinde afgesneden van stap 5.4</li>
	<li>Verplaats de doos met de bovenste ASC-plaat met de plunjers erop naar de bioveiligheidskast. Verwijder voorzichtig de gelatine plunjers van de met pNIPAAm beklede plaat en leg deze bovenop het HBT-mengsel. Voeg BC-MPS-media toe aan de put (voeg voor 1 put van een 6-putplaat 2 ml media toe). Verplaats de onderste ASC-platen met het BC-MPS-mengsel en de plunjers voorzichtig naar de steriele plastic doos en plaats het deksel van de doos erop voor transport. OPMERKING: Het 6-put plaatdeksel past niet terug op de ASC-plaat terwijl de plunjers aan staan. Er moet voor worden gezorgd dat de cultuur niet wordt besmet.</li>
	<li>Incubeer de onderste plaat in de doos in een incubator op 37 ° C totdat de gelatine is gesmolten en de bovenste ASC-laag zich begint te hechten aan de onderste laag (~ 30 min).</li>
	<li>Verplaats de doos met de platen naar de bioveiligheidskast. Verwijder de plunjers voorzichtig van de onderste platen. Het weefsel met de kankercellen wordt verankerd aan de bodem van de put.</li>
	<li>Plaats het deksel van de 6-put plaat terug op de bodemplaat en incubeer op 37 °C om de gelatine volledig te smelten en laat de bovenste laag volledig verankeren aan de onderste laag (~ 30-60 min).</li>
	<li>Verplaats de platen voorzichtig naar een bioveiligheidskast en aspireer de media met een serologische pipet van 10 ml. Voeg 2 ml verse media toe aan elke put. Aspireer vanaf de rand van de put en pipet op de rand van de put om te voorkomen dat het weefsel loskomt.</li>
	<li>Houd de BC-MPS op 37 °C en 5% CO2 gedurende de gewenste tijdsduur en verander elke 2-3 dagen van medium.</li>
</ol>6. Vertering van BC-MPS voor analyse
<ol><li>Wanneer de BC-MPS klaar is om te worden geanalyseerd, verplaatst u de plaat naar de bioveiligheidskast. Verwijder media met een serologische pipet om te voorkomen dat weefsel per ongeluk loskomt.</li>
	<li>Voeg 1 volume PBS toe aan elke put.</li>
	<li>Verwijder de PBS met een serologische pipet.</li>
	<li>Voeg 1 ml celdisassociatieoplossing toe aan elke put. Verplaats de plaat terug naar de incubator en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C om de cellen los te laten. Gebruik in een bioveiligheidskast een celschraper om de cellen en het weefsel volledig los te maken van de kweekplaat.</li>
	<li>Breng de oplossing met het weefsel over naar een conische buis van 15 ml met behulp van een serologische pipet. Voeg 2 ml PBS toe aan elke put om de resterende cellen te verzamelen en breng deze oplossing over naar de conische buis. Als de cellen fluorescerend zijn, wikkelt u de buis in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen.</li>
	<li>Incubeer de buis bij 37 °C onder constante agitatie in een orbitale shaker op 1 x g gedurende 10-20 minuten om cellen volledig van het weefsel te scheiden.</li>
	<li>Gebruik in een bioveiligheidskast een serologische pipet om eventuele resterende klonten cellen in de buis te verstoren en filter het monster door een weefselzeef van 250 μm in een nieuwe buis van 15 ml. Pipetteer de oplossing langzaam door de zeef zodat deze niet overloopt.</li>
	<li>Spoel de zeef af met 1 ml PBS om eventuele cellen die nog in de zeef zitten te verzamelen.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten op 500 x g bij kamertemperatuur. Na centrifugeren drijven de adipocyten op de bovenste laag van de oplossing, terwijl de kankercellen en ASC's worden gemengd in een pellet aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Om de adipocyten te isoleren giet je de toplaag voorzichtig in een nieuwe buis of snijd je de punt van een p1000 pipetpunt af en breng je de toplaag over naar een nieuwe buis. Centrifugeer het monster opnieuw op 500 x g gedurende 5 minuten en gebruik een spuit en naald om de oplossing onder de adipocyten vandaan te verwijderen, zodat alleen de adipocyten overblijven. De adipocyten zijn nu klaar voor analyse</li>
	<li>Nadat de adipocyten uit de oplossing zijn verwijderd, scheidt u de ASC's en kankercellen van elkaar voor analyse als de kankercellen eerder zijn getransfecteerd met een fluorescerend eiwit. Aspireer de resterende oplossing uit de buis met de ASC's en kankercellen zonder de celkorrel te verstoren. Resuspend de pellet in PBS of BC-MPS media en gebruik flow cytometrie om de cellen te sorteren op basis van de fluorescentie.</li>
</ol>

<ol><li>DeSantis, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Breast cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).</li>
<li>NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx">https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx</a> (2020).</li>
<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Biostatistics%22%5BJournal%5D)">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).</li>
<li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institutes+of+Health+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1(2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+tumors+educate+the+proteome+of+stromal+tissue+in+an+individualized+but+coordinated+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner.</a> Science Signaling. 10 (491), (2017).</li>
<li>Lau, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwiched+white+adipose+tissue%3A+A+microphysiological+system+of+primary+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).</li>
<li>Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microphysiologic+platform+for+human+fat%3A+sandwiched+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909(2018).</li>
<li>Yu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adipose-Derived+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells.</a> Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).</li>
<li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+Isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+%27smart%27+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Physics+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).</li>
<li>Lin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+onto+microtextured+poly%28dimethylsiloxane%29+for+aligned+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li>
<li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+Construction+of+a+multicellular+3D+scaffold+for+the+delivery+of+layered+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).</li>
<li>Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tinkercad%22">Tinkercad</a>. , (2020).</li>
<li>Halfter, K., Mayer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+3D+tumor+models+to+the+clinic+-+predictive+value+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine.</a> Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+adipocytes+stimulate+breast+cancer+invasion+through+metabolic+remodeling+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+insight%22%5BJournal%5D)">Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells.</a> JCI insight. 2 (4), 87489(2017).</li>
<li>Qiu, B., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY+493%2F503+staining+of+neutral+lipid+droplets+for+microscopy+and+quantification+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry.</a> Bio-Protocols. 6 (17), 1912(2016).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy%2C+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration.</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion%2Fdetachment+control%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li>
<li>Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Belgodere, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+breast+cancer+microenvironments+and+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+and+lipid+metabolism+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).</li>
<li>Dirat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+exhibit+an+activated+phenotype+and+contribute+to+breast+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion.</a> Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).</li>
<li>Druso, J. E., Fischbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+of+extracellular+matrix%3A+Linking+obesity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).</li>
<li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts%3A+A+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li>
<li>Chandler, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+adipose+progenitor+cells+as+physicochemical+regulators+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).</li>
<li>Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+components+in+breast+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis.</a> The Breast. 22, 66-72 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+1A1+%28COL1A1%29+promotes+metastasis+of+breast+cancer+and+is+a+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target.</a> Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).</li>
<li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li>
<li>Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+use+of+differentiated+adipose-derived+stem+cells+and+mature+adipocytes+to+model+adipose+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).</li>
<li>Zimta, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+links+between+central+obesity+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular links between central obesity and breast cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364(2019).</li>
<li>Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+promotes+the+expansion+of+metastasis-initiating+cells+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 104(2018).</li>
<li>Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-adipose+tissue+crosstalk%3A+fuelling+tumour+metastasis+by+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485(2018).</li>
<li>Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).</li>
<li>Sabol, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+produced+by+obesity-altered+adipose+stem+cells+promotes+metastasis+but+not+tumorigenesis+of+triple-negative+breast+cancer+in+orthotopic+xenograft+and+patient-derived+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models.</a> Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67(2019).</li>
<li>Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human adipose tissues.</a> Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).</li>
<li>Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-on-a-chip+and+body-on-a-chip+systems+for+drug+screening+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling.</a> Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).</li>
<li>Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+microphysiological+tissue+systems+of+cancer+metastasis+to+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Nieuwe systemen voor het modelleren van menselijke borstkanker zijn nodig om een beter begrip van de ziekte te ontwikkelen. De ontwikkeling van menselijke microfysiologische systemen om ziekte-instellingen te modelleren die inheemse ECM- en stromale cellen omvatten, zal de voorspellende kracht van preklinische studies vergroten. Het HIER gepresenteerde BC-MPS-model is een nieuw ontwikkeld systeem dat de beperkingen van eerdere modellen overwint, waardoor BC in zijn oorspronkelijke HBT-omgeving kan worden geëvalueerd. Dit...

Elk jaar sterven meer dan 40.000 Amerikaanse vrouwen aan borstkanker (BC)1. Ondanks meer dan $ 700 miljoen geïnvesteerd in BC onderzoek jaarlijks, 97% van de kandidaat BC drugs falen klinische proeven2,3. Nieuwe modellen zijn nodig om de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en ons begrip van BC te verbeteren. Het NIH Microphysiological (MPS) Programma beschrijft de functies die nodig zijn voor baanbrekende modellen voor het verbeteren van de vertaling van basiswetenschap naar klinisch succes4. Deze omvatten het gebruik van primaire menselijke cellen of weefsels, stabiel in cultuur gedurende 4 weken, en opname van inheemse weefselarchitectuur en fysiologische respons.
Huidige in vitro BC-modellen, zoals tweedimensionale cultuur van BC-cellijnen, membraaninzetcocultuur en driedimensionale sferoïden en organoïden, voldoen niet aan de MPS-criteria van de NIH omdat geen van deze de inheemse borstweefselarchitectuur samenvatten. Wanneer extracellulaire matrix (ECM) aan deze systemen wordt toegevoegd, wordt borst-ECM niet gebruikt; in plaats daarvan worden collageengels en keldermembraanmatrices gebruikt.
Huidige in vivo systemen, zoals patiënt afgeleide xenografts (PDX), voldoen ook niet aan de MPS-criteria van de NIH omdat muriene borstweefsels enorm verschillen van menselijke borsten. Bovendien worden interacties tussen het immuunsysteem en BC steeds meer erkend als de sleutel in de ontwikkeling van tumoren, maar de immunocompromitteerde muriene modellen die worden gebruikt voor het genereren van PDX-tumoren missen volwassen T-cellen, B-cellen en natuurlijke killercellen. Bovendien, terwijl PDX het mogelijk maakt om primaire borsttumoren te behouden en uit te breiden, worden de resulterende PDX-tumoren geïnfiltreerd met primaire muriene stromale cellen en ECM5.
Om deze uitdagingen te overwinnen, hebben we een nieuwe, ex vivo, driedimensionale menselijke borst MPS ontwikkeld die voldoet aan de NIH MPS-criteria. De basis van onze borst MPS wordt gemaakt door sandwiching primaire menselijke borstweefsel (HBT) tussen twee vellen vet-afgeleide stamcellen (ASC's), ook geïsoleerd van HBT (Figuur 1). Plunjers voor het overbrengen van de celbladen naar sandwich de HBT kan 3D-geprint of gemaakt van eenvoudige acryl kunststoffen(figuur 1H,I). Deze techniek past onze eerder beschreven aanpak aan voor het cultiveren van primair menselijk wit adipocytweefsel6,7. De borst MPS kan vervolgens worden gezaaid door een BC-model naar keuze, variërend van standaard BC-cellijnen tot primaire menselijke borsttumoren. Hier laten we zien dat deze BC-MPS meerdere weken stabiel in cultuur zijn (Figuur 2); omvatten inheemse elementen van HBT zoals melkklieradipocyten, ECM, endotheel, immuuncellen (figuur 3); en vat de fysiologische interacties tussen BC en HBT zoals metabole overspraak (figuur 4) samen. Ten slotte laten we zien dat BC-MPS de studie van amoebe beweging van BC-cellen in HBT mogelijk maakt (Figuur 5).

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>1333</td><td>Cell disassoication solution voor de scheiding van BC-MPS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>Cell detachment solution voor het passeren van cellen</td></tr><tr><td>BioStor Container 16oz</td><td>National Scientific Supply Co</td><td>MPCE-T016</td><td>Voor het transport van sterieel weefsel</td></tr><tr><td>Cell Culture 75 cm kolven</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Voor het kweken van ASCs</td></tr><tr><td>Conische buisjes 15mL</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincetten</td><td>ThermoScientific</td><td>1631T5</td><td>Voor het manoeuvreren van weefsel tijdens het sneden</td></tr><tr><td>DMEM met lage glucose, met Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td>Voor het kweken van ASCs en BC-MPS</td></tr><tr><td>FBS gekwalificeerd</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Nunc UpCell 6 welplaten</td><td>ThermoScientific</td><td>174901</td><td>Top ASC celblad</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep 5,000U</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal 150 cm</td><td>FisherBrand</td><td>FB0875714</td><td>Voor het vasthouden van weefsel tijdens het sneden</td></tr><tr><td> Scheermessen</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>Enkelbladig voor het snijden van weefsel</td></tr><tr><td>Zeven 250um</td><td>ThermoScientific</td><td>87791</td><td>Voor de scheiding van BC-MPS</td></tr><tr><td>Weefsel Cultuur 6 welplaten</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Onderste ASC celblad</td></tr><tr><td>Gewichten/Wasmachines</td><td>BCP Fasteners</td><td>BCP672</td><td>Voor het wegen van plunjer 1/2" binnendiameter</td></tr></tbody></table>

borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Borstkanker (BC) blijft een belangrijke doodsoorzaak voor vrouwen. Ondanks meer dan $ 700 miljoen geïnvesteerd in BC onderzoek jaarlijks, 97% van de kandidaat BC drugs falen klinische proeven. Daarom zijn nieuwe modellen nodig om ons begrip van de ziekte te verbeteren. Het NIH Microphysiological Systems (MPS) programma is ontwikkeld om de klinische vertaling van fundamentele wetenschappelijke ontdekkingen en veelbelovende nieuwe therapeutische strategieën te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het genereren van MPS voor borstkanker (BC-MPS). Dit model past een eerder beschreven benadering van het cultiveren van primair menselijk wit vetweefsel (WAT) aan door WAT tussen vet-afgeleide stamcelbladen (ASC)s te sandwichen. Nieuwe aspecten van onze BC-MPS zijn het zaaien van BC-cellen in niet-ziek menselijk borstweefsel (HBT) met inheemse extracellulaire matrix, volwassen adipocyten, ingezeten fibroblasten en immuuncellen; en het inklemmen van het BC-HBT-mengsel tussen HBT-afgeleide ASC-vellen. De resulterende BC-MPS is stabiel in cultuur ex vivo gedurende ten minste 14 dagen. Dit modelsysteem bevat meerdere elementen van het micromilieu die BC beïnvloeden, waaronder adipocyten, stromale cellen, immuuncellen en de extracellulaire matrix. Zo kan BC-MPS worden gebruikt om de interacties tussen BC en zijn micromilieu te bestuderen. 
We tonen de voordelen van onze BC-MPS door twee BC-gedragingen te bestuderen waarvan bekend is dat ze de progressie en metastase van kanker beïnvloeden: 1) BC-beweeglijkheid en 2) BC-HBT metabolische overspraak. Hoewel bc-motiliteit eerder is aangetoond met behulp van intravitale beeldvorming, maakt BC-MPS time-lapse-beeldvorming met hoge resolutie mogelijk met behulp van fluorescentiemicroscopie gedurende meerdere dagen. Bovendien, terwijl metabole overspraak eerder werd aangetoond met behulp van BC-cellen en muriene pre-adipocyten gedifferentieerd in onrijpe adipocyten, is ons BC-MPS-model het eerste systeem dat deze overspraak tussen primaire menselijke melkklieradipocyten en BC-cellen in vitro demonstreert.

Stabiliteit in cultuur BC-MPS is een stabiel microfysiologisch systeem dat tot ten minste 14 dagen in vitro kan worden gekweekt. Een brightfield-afbeelding van de ASC-celbladen werd genomen bij 100x vergroting om het dwarsgestreepte patroon van het samenvloeiingsblad weer te geven (figuur 2A). De ASC-celbladen zijn minstens 4 weken stabiel in cultuur. BC-MPS op 14 dagen cultuur in een put van een 6 put plaat werd afgebeeld met een kleurenc...

Dit protocol beschrijft de constructie van een in vitro microfysiologisch systeem voor het bestuderen van borstkanker met behulp van primair menselijk borstweefsel met kant-en-klare materialen.

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Dit is het eerste protocol dat het mogelijk maakt menselijk borstweefsel gedurende langere tijd in leven te houden ex vivo, waardoor de studie van interacties tussen menselijk borstweefsel en menselijke borstkanker mogelijk is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt macroscopische stukjes menselijk borstweefsel, waaronder borstadipocyten, immuuncellen, vasculaire structuren, ductale structuren en extracellulaire matrix, ex vivo in leven te houden. Deze techniek heeft grote implicaties voor verschillende gebieden van borstkankeronderzoek, waaronder gepersonaliseerde geneeskunde, farmaceutische ontwikkeling en de pathofysiologie van tumorinitiatie en langzamere borstkankerprocessen zoals fibrose en extracellulaire matrixremodellering.Aantoont deze procedure zijn Katherine Hebert, een Tulane afgestudeerde student en Rakesh Gurrala een Tulane medische student van mijn lab. Smelt om te beginnen de bereide gelatineoplossing in een waterbad van 37 graden Celsius. Gebruik een serologische pipet van vijf of tien milliliter om 2,5 milliliter van deze oplossing op elke zuiger te doseren voor putten van een plaat met zes putten.Zodra de gelatine is gestold, verplaatst u de pNIPAAm gecodeerde ASC-platen naar de bioveiligheidskast. Plaats de plunjers voorzichtig in de putten van deze platen zodat de gelatine in contact komt met de ASC's. Plaats een metalen ring op de zuiger om deze te verzwawegen, zodat de gelatine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in direct contact staat met de ASC-plaat.Verplaats de plaat voorzichtig met de plunjers in de steriele doos in de bioveiligheidskast en plaats het deksel erop. Verplaats de doos naar een koelkast van vier graden of plaats de plaat gedurende 30 minuten op ijs en een ijsemmer in de bioveiligheidskast. Was in een bioveiligheidskast het menselijk borstweefsel driemaal met 10 milliliter steriel PBS.Gebruik steriele tang en een scheermesje om de BC-MPS grof te gehakt en probeer zoveel mogelijk fascia en bindweefsel te verwijderen. Zodra het bindweefsel is verwijderd, gebruikt u een steriel scheermesje om het weefsel uiteindelijk te gehakt totdat het een homogene vloeistofconsistentie heeft. Snijd de punt van een P1000 pipetpunt om te helpen bij het pipetten van het gehakte weefsel.Combineer in een buis van 1,5 milliliter het gehaktweefsel, de kankercellijnen en bc-mps-media zoals beschreven in het teksthandschrift. Verplaats de ACS-plaat die voor het onderste celblad wordt gebruikt van de incubator naar de bioveiligheidskast en aspireer de media van de plaat. Pipetteer het bereide borstweefselmengsel in het midden van de put van de onderste ACS-plaat met behulp van de gesneden pipettip, verplaats de doos met de bovenste ACS-plaat met plunjers naar de bioveiligheidskast.Verwijder voorzichtig de gelatine plunjers van de pNIPAAm gecoate plaat en leg ze bovenop het weefselmengsel. Voeg BC-MPS-media toe aan de put en verplaats de onderste ACS-platen voorzichtig met het BC-MPS-mengsel en de plunjers naar de steriele plastic doos. Plaats het deksel van de doos op voor transport, zorg ervoor dat besmetting van de cultuur wordt voorkomen.Incubeer de bodemplaat in de doos en de incubator van 37 graden Celsius totdat de gelatine is gesmolten en de bovenste ACS-laag zich begint te hechten aan de onderste laag. Verplaats vervolgens de doos met de platen naar de bioveiligheidskast, verwijder voorzichtig de plunjers van de onderste platen om het weefsel te observeren met de kankercellen verankerd aan de bodem van de put. Plaats het deksel van de zesputplaat terug op de bodemplaat en incubeer op 37 graden om de gelatine volledig te smelten en de bovenste laag te laten verankeren aan de onderste laag.Verplaats de platen voorzichtig naar een bioveiligheidskast en aspireer de media vanaf de rand van de put met een serologische pipet van 10 milliliter. Voeg twee milliliter verse media toe aan de rand van elke put om te voorkomen dat het weefsel loskomt. Houd de BC-MPS op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende de gewenste tijdsduur.De media om de twee tot drie dagen veranderen. Verplaats de plaat naar de bioveiligheidskast wanneer de BC-MPS klaar is om te worden geanalyseerd. Verwijder media met een serologische pipet om te voorkomen dat weefsel per ongeluk loskomt.Voeg één volume PBS toe aan elke put. Verwijder vervolgens de PBS met een serologische pipet. Voeg een milliliter celdissociatieoplossing toe aan elke put en verplaats de plaat vijf minuten terug naar de incubator om deze cellen los te laten.Gebruik na incubatie een celschraper om de cellen en het weefsel volledig los te maken van de kweekplaat in een bioveiligheidskast. Breng de oplossing met het weefsel over in een conische buis van 15 milliliter en verzamel de resterende cellen door twee milliliter PBS toe te voegen. Wikkel de buis in met aluminiumfolie als de cellen fluorescerend zijn.Incubeer de buis op 37 graden onder constante agitatie in een orbitale shaker op een keer G gedurende 10 tot 20 minuten om de cellen volledig van het weefsel te scheiden. Gebruik in een bioveiligheidskast een serologische pipet om eventuele resterende klonten cellen in de buis te verstoren. En filter het monster door een weefselzeef van 250 micrometer in een nieuwe buis van 15 milliliter.Spoel de zeef af met één milliliter PBS om de resterende cellen te verzamelen. Centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten op 500 maal g bij kamertemperatuur om de adipocyten die in de bovenste laag drijven te scheiden van de kankercellen en ASC's die in een pellet met elkaar worden gemengd. Breng de adipocytlaag over in een nieuwe buis met behulp van een stomp gesneden pipetpunt.Centrifugeer het monster opnieuw en gebruik een spuit en een naald om de resterende oplossing onder de adipocyten vandaan te verwijderen. Aspireer de resterende oplossing uit de buis met de ASC's en kankercellen zonder de celkorrel te verstoren. S hang de pellet opnieuw op in PBS- of BC-MPS-media en gebruik flowcytometrie om de cellen te sorteren op basis van fluorescentie.Het stri-aided patroon van het samenvloeiende ASC-blad wordt hier weergegeven. Het drijvende menselijke borstweefsel was nog steeds stabiel verankerd door de ASC-celbladen aan de onderkant van de put na 14 dagen cultuur. Fluorescerende microscopiebeelden tonen de stabiliteit van de BC-MPS met MDA-MB-231 die rfp-cellijnen uitdrukt na 14 dagen en met drievoudige negatieve tumor explant PDX gedurende ten minste zes dagen.BC-MPS met borstweefsel werd gedurende 14 dagen in vitro gekweekt, gekleurd en afgebeeld om de inheemse elementen van het weefsel bij 100X en 20X vergroting te demonstreren. Kleuring van de macrofaagmarkers werd gebruikt om het behoud van primaire macrofagen na drie en zeven dagen in cultuur aan te tonen. Flow cytometrie analyse van Bodipy bevlekte MDA-MB-231 cellen na 14 dagen wijzen op minimale lipide accumulatie in 2D cultuur en uitgebreide lipide accumulatie en BC-MPS.Het aandeel lipidepositieve MDA-MB-231 cellen was 26,2 keer groter in BC-MPS dan 2D-cultuur. Cellen gekweekt in BC-MPS vertoonden verhoogde lipidedruppels in vergelijking met cellen gekweekt in standaard 2D-cultuur. Time-lapse beelden van RFP gelabeld BC-MPS met MDA-MB-231 cellen toonden amoebe beweging van 231 cellen met pseudo pods en hoge beweeglijkheid.Het borstweefsel moet klein genoeg worden gehakt en voldoende worden gescheiden om over de bodem van de put te worden verdeeld. Borstweefsel is erg levendig en als de stukken te groot zijn of te dicht bij elkaar zijn geclusterd, kunnen de ASC-celbladen het borstweefsel niet aan de onderkant van de put verankeren. De resulterende borstweefselkankerconstructies kunnen enzymatische spijsvertering ondergaan om bepaalde celtypen van belang te isoleren.Hierdoor kunnen belangrijke vragen worden beantwoord, zoals hoe kankercellen in borstweefsel anders reageren op chemotherapie in vergelijking met traditionele 2D-cultuur of organoïden.

modeling-breast-cancer-human-breast-tissue-using-microphysiological

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

Bij standaard kweekmethoden cellen uit hun fysiologische omgeving en gekweekt op het plastic oppervlak van een schotel. Om het gedrag van primaire humane beenmergcellen bestuderen we een 3-D kweeksysteem waarbij cellen worden gekweekt onder omstandigheden indient de natieve micro van het weefsel.

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.

Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.

We hebben een nieuwe ex vivo model om de werking van hormonen in de menselijke borst bestuderen ontwikkeld. Het is gebaseerd op microstructuren weefsel geïsoleerd uit chirurgische borstweefsel monsters die weefselarchitectuur, intercellulaire interacties en paracrienen behouden.

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst

Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Ovariële tumorprogressie te bestuderen in een fysiologisch relevante model multicellulaire sferoïden werden gekweekt in een micro-inrichting onder gesimuleerde fluïdumstroming. Deze dynamische 3D-model emuleert de intraperitoneale omgeving met de cellulaire en mechanische componenten, waar eierstokkanker metastase optreedt.

Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

Het doel van dit protocol is om een nieuwe borstkanker modellerings aanpak te beschrijven op basis van de intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in muizen borstklieren. Deze aanpak maakt zowel cel-type-en orgaan-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen op een tijdelijk gecontroleerde manier mogelijk.

Het modelleren van borstkanker via een Intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier

Kruisverwijzing tussen borstepitheelcellen en endotheelcellen draagt belangrijk bij aan de progressie van borstkanker, tumorgroei en metastase. In deze studie zijn sferoïden gemaakt van borstkankercellen samen met vasculaire en / of lymfatische endotheelcellen en tonen hun toepasbaarheid aan als een in vitro systeem voor borstkankeronderzoek.

Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

Dit protocol presenteert een fysiologisch relevant tumor-on-a-chip-model om basis- en translationeel kankeronderzoek bij mensen met een hoge doorvoer uit te voeren, het screenen van geneesmiddelen, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen te bevorderen met een beschrijving van laad-, onderhouds- en evaluatieprocedures.

Opzetten van een fysiologisch menselijk gevasculariseerd microtumormodel voor kankeronderzoek

Dit protocol beschrijft een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode om menselijke borstorganoïden te genereren die belangrijke kenmerken van mammariummorfogenese recapituleren in een gecontroleerd driedimensionaal kweeksysteem.

Een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode voor het genereren van driedimensionale menselijke borstorganoïden die mammaire morfogenese recapituleren

Leer hoe u een microfysiologisch systeem bouwt voor borstkankeronderzoek met behulp van primair menselijk borstweefsel. Deze methode behoudt weefsels ex vivo levend voor gedetailleerde studies van tumorinteracties.

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Meer video's verkennen