Het programma van maternale mRNA-vertaling definiëren tijdens in vitro rijping met behulp van een enkele oöcytreportertest

Deze methode kan worden gebruikt om regulerende elementen te identificeren en te karakteriseren die de vertaling tijdens de rijping van de oöcyt regelen. We hebben time-lapse microscopie toegepast om de accumulatie van verslaggevers tijdens de rijping van de in-vitroöcyt te beoordelen. Dit geeft nauwkeurig het tijdstip aan waarop translationele activering of onderdrukking plaatsvindt tijdens de rijping van de oöcyt.

Om te beginnen, open voorzichtig de antrale follikels door een kleine snede in de follikelwand te maken met een naald van 26 gauge. Isoleer intacte COC's met verschillende lagen cumuluscellen met behulp van een mondbediende glazen pipet. Gebruik een kleinere pipet en denude de COC's mechanisch door herhaaldelijk pipetten.

Aspireer de gedendeerde oöcyten en plaats ze in een petrischaaltje met rijpingsmedium aangevuld met één micromolar cilostamide. Plaats de schaal twee uur in een incubator om de oöcyten te laten herstellen van de stress die wordt veroorzaakt door hun isolatie van de follikels. Plaats een 10 centimeter lange borosilicaat glazen capillaire buis in een mechanische trekker om injectienaalden voor te bereiden.

Buig de naaldpunt onder een hoek van 45 graden met behulp van een verwarmd filament voor een optimale injectie. Doe 20 microliterdruppels van basisocyt verzamelmedium in een polystyreenschaal en bedek de druppels met lichte minerale olie. Bereid een groter volume reporter mix door het toevoegen van 12,5 microgram per microliter van Ypet UTR en mCherry elk.

Bewaar aliquots hiervan bij min 80 graden Celsius. Bij het ontdooien centrifugeer je de aliquot gedurende twee minuten op 20.000 keer G en breng je het vervolgens over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Laad de injectienaald met ongeveer 0,5 microliter reportermix.

Plaats de holdingpipet en de injectienaald in de houders en plaats ze in de druppel van het oöcytopvangmedium. Open de injectienaald door deze voorzichtig tegen de pipet te tikken. Plaats oöcyten in een druppel basisinzamelingsmedium en injecteer vijf tot tien picoliters van de reportermix.

Incubeer de oöcyten en het rijpingsmedium gedurende 16 uur met één micromolar cilostamide om het mCherry-signaal te laten plateauen. Voor time-lapse microscopie, bereid een Petrischaal met twee 20 microliter druppels rijpingsmedium voor elke geïnjecteerde verslaggever, een druppel met een micromolar cilostamide voor controle profase I-arrested oöcyten, en een druppel zonder cilostamide voor rijpende oöcyten. Bedek de druppels met lichte minerale olie en plaats ze in de incubator.

Verwijder na de pre-incubatie de geïnjecteerde oöcyten uit de incubator en was ze vier keer in rijpingsmedium zonder cilostamide. Bewaar sommige oöcyt in rijpingsmedium met één micromolar cilostamide als profase I oöcytcontrolegroep. Breng de geïnjecteerde oöcyten over in hun respectieve druppels op de eerder bereide time-lapse microscoopschotel.

Cluster de oöcyten met een gesloten glazen pipet om hun beweging tijdens de opname te voorkomen. Plaats de schotel onder de microscoop uitgerust met een lichtgevende diode eliminatie systeem en een gemotoriseerde fase uitgerust met een milieukamer onderhouden op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, met behulp van de parameters vermeld in de tekst manuscript. Voer de juiste instellingen voor het timelapse-experiment in door op Apps te klikken en vervolgens op Multidimensionale acquisitie.

Selecteer het eerste tabblad Hoofd en selecteer time-lapse, posities in meerdere werkgebieden en meerdere golflengten. Selecteer het tabblad Opslaan om de locatie in te voeren waar het experiment moet worden opgeslagen. Selecteer vervolgens het tabblad Time-Lapse om het aantal tijdspunten, duur en tijdsinterval in te voeren.

Selecteer het tabblad Werkgebied, schakel brightfield in en zoek de positie van de oöcyten door een nieuw venster te openen en Acquire, Acquire en Show Live te selecteren. Zodra de oöcyten zich bevinden, schakelt u terug naar het multidimensionale acquisitievenster en drukt u op plus om de locatie van de oöcyten in te stellen. Selecteer het tabblad Golflengten en stel drie verschillende golflengten in voor brightfield, YFP en mCherry.

Pas de belichting voor Ypet en mCherry aan en start vervolgens het time-lapse-experiment door op Acquire te klikken. Voor de analyse van Ypet drie priem UTR-vertaling, voert u twee regiometingen uit voor elke oöcyt, de oöcyt zelf door op ellipsgebied te klikken en een klein gebied rond de oöcyt dat moet worden gebruikt voor achtergrondaftrek door op rechthoekig gebied te klikken. Exporteer de regiometingsgegevens naar een spreadsheet door te klikken op Logboek openen en vervolgens op Logboekgegevens.

Trek voor elke afzonderlijke oöcyt en voor alle gemeten tijdpunten de achtergrondregiometing afzonderlijk af van de oöcytregiometing voor YFP- en mCherry-golflengten. De expressie van mCherry en YFP in profase I en rijpende oöcyten werd geregistreerd in 39 oöcyten, waarvan er 30 gerijpt waren, en negen werden gearresteerd in profase I als een negatieve controle. Individuele YFP-naar-mCherry-verhoudingen voor signalen van profase-I-arrested en rijpende oöcyten werden gecorrigeerd voor geïnjecteerd volume door het YFP-signaal te delen door het gemiddelde mCherry-signaal van de laatste 10 tijdspunten voor profase I-arrested en rijpende oöcyten.

De omrekeningssnelheden van de reporter YFP werden gemeten door middel van een curve die paste bij de YFP-naar-mCherry-verhoudingen in profase I en in rijpende oöcyten gedurende de eerste nul tot twee uur, of acht tot 10 uur na het vrijkomen van cilostamide met behulp van lineaire regressie. De accumulatie van de verslaggever volgt geen lineair patroon, zoals aangegeven door een significant verschil in vertaalsnelheden tussen nul tot twee uur en acht tot 10 uur na het vrijkomen van cilostamide, wat wijst op activering van interleukine 7-vertaling tijdens oöcyt myotische rijping. Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat de belichtingstijd aan het begin van de opname voldoende is.

Houd er rekening mee dat het signaal tijdens de tijdscursus kan verzadigen als de vertaling wordt geactiveerd tijdens de hervatting van het oöcytmeiotisch. De stabiliteit van de MRMA kan worden bevestigd door PCR, met behulp van primers voor YFP. Om veranderingen in de vertaling te bevestigen, kunt u Western blotting gebruiken met een antilichaam tegen een V5-technologie.