Name: Het programma van maternale mRNA-vertaling definiëren tijdens in vitro rijping met behulp van een enkele oöcytreportertest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Ontdek hoe u een enkele oöcytreportertest gebruikt om mRNA-translatie tijdens in vitro rijping te bestuderen. Deze methode identificeert regelende elementen met behulp van time-lapse microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM097165, GM116926 en Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 aan Marco Conti. Enrico M. Daldello werd ondersteund door een fellowship van de Lalor Foundation en Natasja G. J. Costermans werd ondersteund door een Rubicon fellowship van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO).

De experimentele procedures met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Californië in San Francisco (protocol AN182026).
1. Voorbereiding van media
<ol><li>Voeg alle componenten toe, zoals beschreven in tabel 1,om het basismedium voor het verzamelen van oöcyten en het rijpingsmedium voor oöcyten te maken. Stel voor het basisinzamelingsmedium de pH in op 7,4. Voeg voor zowel het verzamel- als het rijpingsmedium op de dag van gebruik 3 mg/ml runderserumalbumine (BSA) en 1 μM cilostamide toe.</li>
</ol>2. Voorbereiding van mRNA-codering voor Ypet-3' UTR en mCherry
<ol><li>Verkrijg de 3′ UTR-sequenties van de mRNAs van belang. OPMERKING: Voor deze studie werden eerder sequenties verkregen uit muisocyt cDNA.</li>
	<li>Ontwerp primers om de doel 3' UDR's te versterken van oöcyt cDNA en delen van de pcDNA 3.1 vector met een Ypet codeervolgorde, V5-epitoop tag en een T7 promotor.</li>
	<li>Versterk met behulp van een high-fidelity DNA polymerase kit. Voer de polymerasekettingreactie (PCR)-producten uit op een gel om te controleren of de fragmenten de juiste grootte hebben, knip de banden uit en haal het DNA uit de gel met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Smelt de PCR-fragmenten aan een vector met behulp van een PCR-kloonkit. OPMERKING: PCR-fragmenten werden gedurende 4 uur op ijs geïncubeerd om een efficiënter recombinatieproces te vergemakkelijken. Dit is in strijd met de instructies van de fabrikant, die een incubatietijd van slechts 45 minuten aanbevelen.</li>
	<li>Transfecte PCR-fragmenten in competente 5-α Escherichia coli-bacteriën.<ol>
<li>Voeg de mix en plasmide toe aan de bacteriën en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.</li>
		<li>Verwarm de schok van het mengsel en plasmide door het mengsel gedurende 45 s in een waterbad op 42 °C te plaatsen en onmiddellijk gedurende 3 minuten op ijs af te koelen.</li>
		<li>Voeg 500 μL Super Optimal bouillon met Catabolite repression (SOC) medium toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Draai 2 minuten op 7000 × g en verwijder het grootste deel van het supernatant. Resuspend en plaat op een Luria Bouillon (LB) agarplaat met het juiste selectie antibioticum. OPMERKING: Carbenicillin werd gebruikt in deze studie.</li>
		<li>Incubeer 's nachts bij 37 °C. Isoleer de kolonies door lichtjes op een pipetpunt op een van de kolonies te drukken en deze in 3 ml LB-medium te plaatsen met 100 μg/ml carbenicilline. Incubeer gedurende 12-24 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Extraheer het DNA van de plasmiden met behulp van de plasmide DNA-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant en bevestig de sequenties via DNA-sequencing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor Ypet/3' UTR:<ol>
<li>Produceer een lineaire PCR-sjabloon voor in vitro transcriptie. Gebruik een voorwaartse primer stroomopwaarts van de Ypet-sequentie en een omgekeerde primer met 20 extra thymineresten. Zie tabel 2 voor de volgorde van Ypet/IL-7 3' UTR en de sequenties van de voorwaartse en omgekeerde primers. OPMERKING: Deze extra thymineresiduen voegen oligo(A) toe aan het lineaire mRNA na in vitro transcriptie.
</li>
		<li>
In vitro transcriberen van het PCR-product met behulp van een T7 transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Zuiver het resulterende complementaire RNA (cRNA) met behulp van een transcriptieopruimingskit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Elute de gezuiverde cRNA in RNAse-vrij water, meet de concentratie en evalueer de integriteit door agarose elektroforese. Bewaren bij −80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor mCherry:<ol>
<li>Produceer een lineaire PCR-sjabloon voor in-vitrotranscriptie met behulp van een high-fidelity restrictie-enzym; gebruik het restrictie-enzym mfEI-HF als u dit voorbeeld repliceert. Verteren in een spijsverteringsbuffer 's nachts bij 37 °C.</li>
		<li>Voer een gel uit om het monster te zuiveren en extraheer het lineaire DNA met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>
In vitro transcriberen van het PCR-product met behulp van een T7 transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Polyadenylaat de cRNA (150-200 nucleotiden) met behulp van een poly(A) tailing kit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Zuiver het resulterende cRNA met behulp van een transcriptieopruimingskit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Elute de gezuiverde cRNA in RNAse-vrij water, meet mRNA-concentraties en evalueer de berichtintegriteit door gelelektroforese. Bewaren bij −80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Experimentele procedure
OPMERKING: Figuur 1geeft een schematisch overzicht van oöcytmicro-injectie en daaropvolgende time-lapse microscopie .
<ol><li>Dag 1<ol>
<li>Intraperitoneally injecteren 21-daagse muizen met 5 IE van zwangere merrie serum gonadotropine ter bevordering van de follikelgroei naar de antrale fase11.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3<ol><li>Oocyte collectie<ol>
<li>Offer muizen 44-48 uur na het priming om de eierstokken te verzamelen en plaats ze in een plastic petrischaal met basismiddel voor het verzamelen van oöcyten.</li>
			<li>Open de antrale follikels voorzichtig door een kleine snee in de follikelwand te maken met een naald van 26 G. Isoleer intacte cumulus-gesloten oöcyten (COC's) met verschillende lagen cumuluscellen met behulp van een mondbediende glazen pipet.</li>
			<li>Gebruik een kleinere pipet (iets groter dan de diameter van de oöcyt) en denude de COC's mechanisch door herhaaldelijk pipetten. OPMERKING: U kunt ook micro-injectie uitvoeren op intacte COC's.</li>
			<li>Gebruik een grotere pipet, aspireer de gedenudeerde oöcyten en plaats ze in een petrischaal met rijpingsmedium aangevuld met 1 μM van de fosfodiësteraseremmer, cilostamide, om hervatting van de meiotische rijping te voorkomen12. Plaats de schaal gedurende 2 uur in de incubator om de oöcyten te laten herstellen van de stress veroorzaakt door isolatie van de oöcyten uit de follikels.</li>
		</ol></li>
		<li>Oöcyt micro-injectie<ol>
<li>Bereid de injectienaalden voor door een 10 cm lange borosilicaatglas capillaire buis in een mechanische trekker te plaatsen. Voor een optimale injectie buigt u de naaldpunt in een hoek van 45° met behulp van een verwarmd filament.</li>
			<li>Bereid polystyreengerechten met 20 μL druppels basisocytverzamelingsmedium en bedek de druppels met lichte minerale olie.</li>
			<li>Bereid een reportermix voor door 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR en 12,5 μg/μL mCherry toe te voegen. Bereid een groter volume voor en maak aliquots voor toekomstige experimenten om vergelijkbare reporterconcentraties te garanderen. Bewaar deze aliquots bij -80 °C. Bij het ontdooien, centrifugeer eerst de aliquot gedurende 2 minuten op 20.000 x gen breng over op een nieuwe microcentrifugebuis. OPMERKING: Deze centrifugeer zal voorkomen dat de injectienaald verstopt raakt door potentiële aggregaten in de reportermix.</li>
			<li>Laad de injectienaald met capillariteit met ongeveer 0,5 μL reportermix.</li>
			<li>Plaats de houdpipet en de geladen injectienaald in de houders en plaats deze in het druppeltje oöcytopvangmedium. Aspireer een deel van het medium in de holdingpipet.</li>
			<li>Open de injectienaald door deze voorzichtig tegen de pipet te tikken.</li>
			<li>Plaats oöcyten in een druppel basisinzamelingsmedium en injecteer 5-10 pL van de reportermix.</li>
			<li>Incubeer de oöcyten in het rijpingsmedium met 1 μM cilostamide gedurende 16 uur om het mCherry-signaal te laten plateauen.</li>
			<li>Bereid een petrischaaltje dat zal worden gebruikt voor time-lapse microscopie met ten minste twee druppeltjes rijpingsmedium van 20 μL voor elke geïnjecteerde verslaggever: één druppel met 1 μM cilostamide voor controle profase I-arrested oöcyten en één druppel zonder cilostamide voor rijpende oöcyten. Bedek de druppels met lichte minerale olie en plaats ze in de incubator.</li>
		</ol></li>
		<li>Time-lapse microscopie<ol>
<li>Verwijder na de pre-incubatie de geïnjecteerde oöcyten uit de incubator en was ze vier keer in rijpingsmedium zonder cilostamide. Bewaar sommige oöcyt in rijpingsmedium met 1 μM cilostamide als een profase I-arrested oöcyt controlegroep.</li>
			<li>Breng de geïnjecteerde oöcyten over in hun respectieve druppels op de eerder bereide time-lapse microscoopschotel. Cluster de oöcyten met behulp van een gesloten glazen pipet (een gesloten pipet kan worden voorbereid door de punt een paar seconden in een vlam te houden). OPMERKING: Het clusteren van de oöcyten helpt hun beweging tijdens de opname te voorkomen.</li>
			<li>Plaats de schotel onder de microscoop uitgerust met een lichtgevende diodeverlichtingssysteem en een gemotoriseerd podium uitgerust met een milieukamer die op 37 °C en 5% CO2wordt gehouden. Gebruik de volgende parameters om deze studie te repliceren: filterset: dichroïsche spiegel YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP-kanaal (Excitation (Ex): S500/20 × 49057; Emissie (EM): D535/30 m 47281), mCherry kanaal (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).</li>
			<li>Voer de juiste instellingen in voor het time-lapse-experiment (zie Tabel met materialen voor de software die in dit onderzoek wordt gebruikt): Klik op Apps | Multidimensionale acquisitie. Selecteer het eerste tabblad Hoofd en selecteer timelapse, posities in meerdere werkgebiedenen meerdere golflengten.</li>
			<li>Selecteer het tabblad Opslaan om de locatie in te voeren waar het experiment moet worden opgeslagen.</li>
			<li>Selecteer het tabblad Timelapse om het aantal tijdspunten, duur en tijdsinterval in te voeren. OPMERKING: De duur van het time-lapse-experiment hangt af van de onderzochte diersoorten, omdat de timing van de oöcytmeiotische rijping per soort verschilt. In dit experiment met muisoocyten werden oöcyten elke 15 minuten gedurende 16 uur geregistreerd.</li>
			<li>Selecteer het tabblad Werkgebied. Schakel brightfield in en zoek de positie van de oöcyten door een nieuw venster te openen door Acquire | | overnemen Live weergeven. Zodra de oöcyten zich hebben bevonden, schakelt u terug naar het venster Multidimensionale acquisitie en drukt u op + om de locatie van de oöcyten in te stellen.</li>
			<li>Selecteer het tabblad Golflengtenen stel 3 verschillende golflengten in voor brightfield (belichting 15 ms), YFP (belichting 150 ms voor Ypet/IL7 3' UTR) en mCherry (belichting 75 ms voor Ypet/IL7 3' UTR). OPMERKING: Pas de belichting voor elke Ypet/3' UTR-verslaggever aan op basis van het niveau van de accumulatie van de verslaggever en het geïnjecteerde volume. Zorg ervoor dat het YFP-signaal aan het begin van het experiment in het midden van het detectiebereik valt om onderschatting of verzadiging in geval van activering van de vertaling te voorkomen. Pas voor mCherry de blootstelling voor elke partij mCherry aan, omdat het signaal afhankelijk is van het aantal adeninenucleotiden dat tijdens de polyadenylatatieprocedure is toegevoegd. Vanwege de variatie in polyadenylation-efficiëntie, gebruik dezelfde batch mCherry in verschillende experimenten voor een betere vergelijking tussen experimenten.</li>
			<li>Start het timelapse-experiment door te klikken op Acquire. Zie figuur 2 en het aanvullende bestand voor een voorbeeld van een time-lapse-opname in één oöcyt.</li>
		</ol></li>
		<li>Analyse van Ypet-3' UTR vertaling<ol>
<li>Voer voor deze analyse (zie Tabel met materialen voor de software die in deze studie wordt gebruikt) twee regiometingen uit voor elke oöcyt: de oöcyt zelf-klik op ellipsgebied en omringt de oöcyt-en een klein gebied dicht bij de oöcyt om te worden gebruikt voor achtergrondaftrekking-klik op rechthoekig gebied. OPMERKING: Zorg ervoor dat de oöcyten tijdens de timelapse-opname niet uit het geselecteerde gebied bewegen. Besteed speciale aandacht aan de plaatsing van de regiometing rond polaire lichaamsextrusie, omdat dit beweging in de oöcyt veroorzaakt en de opname kan verstoren.</li>
			<li>Exporteer de regiometingsgegevens naar een spreadsheet door eerst op Logboek openen en vervolgens op Logboekgegevens te klikken om de gegevensanalysesoftware te exporteren.</li>
			<li>Trek voor elke afzonderlijke oöcyt en voor alle gemeten tijdpunten de achtergrondgebiedmeting af van de oöcytregiometing. Doe dit voor YFP en mCherry golflengten afzonderlijk.</li>
			<li>Noteer de timing van kiemblaasjesafbraak (GVBD) en polaire lichaamsextrusie (PBE) voor latere referentie. OPMERKING: Sluit rijpende muisoöcyten uit wanneer GVBD meer dan 2 uur bedraagt.</li>
			<li>Plot YFP en mCherry expressie in de loop van de tijd voor elke oöcyt om te controleren op uitschieters. OPMERKING: Dit moet een vloeiende curve zijn, als dit niet het gevolg is, kan dit erop wijzen dat de oöcyt tijdens de opname is verplaatst.</li>
			<li>Bereken voor elke afzonderlijke oöcyt de gemiddelde mCherry-expressie voor de laatste tien tijdpunten van de opname. Deel voor elk tijdspunt de YFP-expressie door de gemiddelde mCherry-expressie om te corrigeren voor geïnjecteerd volume om een YFP/mCherry-verhouding te verkrijgen op elk tijdstip voor elke afzonderlijke oöcyt.</li>
			<li>Bereken de omrekeningssnelheden voor een specifiek tijdsinterval door de helling van de curve aan te passen door lineaire regressie. Beoordeel de verschillen in omrekeningspercentages aan de hand van statistische conclusies.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li>
<li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portrait+of+an+oocyte%3A+our+obscure+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li>
<li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConti%2C+M+%22Posttranscriptional+Mechanisms+in+Endocrine+Regulation%22">Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation</a>. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).</li>
<li>Dai, X. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinational+code+for+mRNA+3%27UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li>
<li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li>
<li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399(2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+%28Dazl%29+at+the+oocyte-to-zygote+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li>
<li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li>
<li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li>
<li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li>
<li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+growth%3A+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li>
<li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li>
<li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333(2018).</li>
<li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development%3A+A+model+for+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li>
<li>Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).</li>
<li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+mRNAs+with+distinct+3%27+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive%2C+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+3%27+uridylation+and+poly%28A%29+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li>
<li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De gepresenteerde methode beschrijft een strategie om activering en onderdrukking van de vertaling van doelmiER bij verschillende overgangen tijdens in vitro oöcytmeiotische rijping te bestuderen. IL-7, een cytokine vrijgegeven door de oöcyt die betrokken kan zijn bij oöcyt-cumulus cel communicatie8,13, werd gekozen voor het beschrijven van deze methode. HET is bekend dat IL-7 steeds vaker wordt vertaald tijdens oöcytrijping8 en m...

Een volgroeide zoogdierocyt ondergaat snelle veranderingen in de voorbereiding op bevruchting en verwerving van totipotentie. Deze veranderingen zijn essentieel om de embryonale ontwikkeling na de bevruchting te ondersteunen. Hoewel de gebeurtenissen die gepaard gaan met nucleaire rijping relatief goed worden beschreven, is er veel minder bekend over de moleculaire processen en paden in het oöcytcytoctoplasma. Tijdens de laatste stadia van de rijping van de oöcyt zijn oöcytcellen transcriptief stil en is de genexpressie volledig afhankelijk van mRNA-vertaling en afbraak1,2. De synthese van eiwitten die van cruciaal belang zijn voor ontwikkelingscompetentie is daarom gebaseerd op een programma van getijde vertaling van langlevende mRNAs die eerder zijn gesynthetiseerd tijdens oöcytgroei1,3. Als onderdeel van een focus op het definiëren van dit programma van maternale mRNA-vertaling uitgevoerd tijdens de meiotische rijping en bij de oöcyt-naar-zygote-overgang, presenteert dit artikel een strategie om de activering en onderdrukking van de vertaling van doel maternale mRNAs in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro meiotische rijping te bestuderen.
Bij deze methode wordt het YPet open leesframe gekloond vóór de 3' UTR van het transcript van belang. Vervolgens worden mRNAs die coderen voor deze reporter micro geïnjecteerd in oöcyten samen met polyadenylated mRNAs die coderen voor mCherry om te controleren op geïnjecteerd volume. Reporter accumulatie wordt gemeten tijdens in vitro oöcyt meiotische rijping met behulp van time-lapse microscopie. De accumulatie van geel fluorescerend eiwit (YFP) en mCherry wordt geregistreerd in individuele oöcyten en YFP-signalen worden gecorrigeerd door het plateauniveau van de co-geïnjecteerde mCherry. Na het verkrijgen van gegevens worden de omrekeningssnelheden berekend voor verschillende tijdsintervallen tijdens de in vitro oöcytmeiotische rijping door de helling van de curve te berekenen die wordt verkregen door curve-fitting.
Deze aanpak biedt een hulpmiddel om veranderingen in de vertaling van geselecteerde endogene mRNAs experimenteel te bevestigen. Bovendien vergemakkelijkt deze methode de karakterisering van regulerende elementen die de vertaling tijdens de oöcytmeiotische rijping regelen door cis-regulerende elementen van de 3' UTR van doelmaRNAs4,5,6temanipuleren . Manipulatie van de poly(A) staartlengte geeft ook inzicht in adenylase/deadenylase activiteit in oöcyten5. Mutagenese van cis-acterende elementen of RNA-immunoprecipitatie kan worden gebruikt om interacties met cognate RNA-bindende eiwitten6,7te bestuderen . Bovendien kan deze methode worden gebruikt om essentiële componenten van het vertaalprogramma te identificeren die van cruciaal belang zijn voor de ontwikkelingscompetentie van oöcyt door doel 3' UTR-vertaling te meten in modellen die verband houden met verminderde oöcytkwaliteit 8,9,10. Dit methodedocument presenteert een representatief experiment waarbij gedenudeerde oöcyten van 21 dagen oude C57/BL6 muizen micro-geïnjecteerd zijn met een Ypet reporter gefuseerd met de 3' UTR van IL-7. De installatie en het protocol voor oöcytinjectie, time-lapse-opname en gegevensanalyse zijn beschreven.

<table><tbody><tr><td>Voorbereiding van media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine Poeder Bioxtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL-A3311</td><td></td></tr><tr><td>Cilostamide</td><td>EMD Millipore</td><td>231085</td><td></td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2645</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine 100x Oplossing, Steriel Gefilterd</td><td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Bicarbonaat&nbsp;</td><td>JT-Baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuur gedistilleerd water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Voorbereiding van mRNA dat codeert voor YFP/3' UTR en mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Biomedical&nbsp;</td><td>20-102QD</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline dinatriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>Choo-Choo Cloning Kit</td><td>McLab</td><td>CCK-20</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladingsdye (6x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Oplossing</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Platen met 100 &micro;g/mL Carbenicilline, Teknova&nbsp;</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium (Capsules)</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-021</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MfeI-HF restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R3589</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcriptie Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer&nbsp;</td><td>Apex Biomedical&nbsp;</td><td>20-193</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuur Ethidium Bromide Oplossing</td><td>Life Technologies</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Oöcyt collectie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirator buisassemblage voor gekalibreerde micropipetten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gekalibreerde micropipetten</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSG- 5000</td><td>Mybiosource</td><td>MBS142665</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Naald 26 G x 1/2</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Spuit 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Oöcyt micro-injectie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Schaaltje | Nr. 0 Dekglas | 20 mm Glas Diameter | Ongecoat</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td>Voor time-lapse microscopie</td></tr><tr><td>Borosilicate glas met filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Olie voor Embryo Cultuur</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Falcon</td><td>351006</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>Weefsel Cultuur Schaal</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Voor oöcyt incubatie</td></tr><tr><td>VacuTip Holding Capillaire</td><td>Eppendorf</td><td>5195000036</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Voorbereiding van Figuur 1S</td></tr><tr><td>MetaMorph, versie 7.8.13.0&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>&nbsp;Voor time-lapse microscopie, analyse van 3' UTR translatie&nbsp;</td></tr></tbody></table>

het programma van maternale mrna-vertaling definiëren tijdens in vitro rijping met behulp van een enkele oöcytreportertest

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Gebeurtenissen in verband met nucleaire rijping van oöcyten zijn goed beschreven. Er is echter veel minder bekend over de moleculaire paden en processen die plaatsvinden in het cytoplasma ter voorbereiding op bevruchting en verwerving van totipotentie. Tijdens de rijping van de oöcyt zijn veranderingen in genexpressie uitsluitend afhankelijk van de vertaling en afbraak van maternal messenger RNAs (mRNAs) in plaats van van transcriptie. De uitvoering van het vertaalprogramma speelt daarom een sleutelrol bij het vaststellen van oöcytontwikkelingscompetentie om de embryoontwikkeling te ondersteunen. Dit artikel maakt deel uit van een focus op het definiëren van het programma van maternale mRNA-vertaling dat plaatsvindt tijdens de meiotische rijping en bij de oöcyt-naar-zygote-overgang. In dit methodedocument wordt een strategie gepresenteerd om de regulering van de vertaling van doelmaBO's tijdens de rijping van in vitro oöcyt te bestuderen. Hier wordt een Ypet-verslaggever gefuseerd met het 3' onvertaalde gebied (UTR) van het interessegen en vervolgens micro-geïnjecteerd in oöcyten samen met polyadenylated mRNA-codering voor mCherry om te controleren op geïnjecteerd volume. Door time-lapse microscopie te gebruiken om de accumulatie van verslaggevers te meten, worden vertaalsnelheden berekend bij verschillende overgangen tijdens de oöcytmeiotische rijping. Hier zijn de protocollen voor oöcytisolatie en injectie, time-lapse-opname en gegevensanalyse beschreven, met behulp van de UTR-verslaggever Ypet/interleukine-7 (IL-7)-3' als voorbeeld.

Gedenudeerde profase I-arrested oöcyten van 21-daagse C57/BL6 muizen werden geïnjecteerd met een reporter mix met mRNA die codeert voor de Ypet reporter versmolten met de 3' UTR van IL-7 en mRNA codering mCherry. YFP en mCherry expressie werd geregistreerd in 39 oöcyten, waarvan 30 gerijpt, en 9 werden gearresteerd in profase I als een negatieve controle. Drie rijpende oöcyten werden uitgesloten voor analyse omdat ze ofwel een vertraagde GVBD (N=2) hadden of tijdens de opname in de schaal bewogen (N=1). <strong class="xf...

Dit protocol beschrijft een reportertest om de regulatie van mRNA-vertaling in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro rijping te bestuderen.

Het programma van maternale mRNA-vertaling definiëren tijdens in vitro rijping met behulp van een enkele oöcytreportertest

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Deze methode kan worden gebruikt om regulerende elementen te identificeren en te karakteriseren die de vertaling tijdens de rijping van de oöcyt regelen. We hebben time-lapse microscopie toegepast om de accumulatie van verslaggevers tijdens de rijping van de in-vitroöcyt te beoordelen. Dit geeft nauwkeurig het tijdstip aan waarop translationele activering of onderdrukking plaatsvindt tijdens de rijping van de oöcyt.Om te beginnen, open voorzichtig de antrale follikels door een kleine snede in de follikelwand te maken met een naald van 26 gauge. Isoleer intacte COC's met verschillende lagen cumuluscellen met behulp van een mondbediende glazen pipet. Gebruik een kleinere pipet en denude de COC's mechanisch door herhaaldelijk pipetten.Aspireer de gedendeerde oöcyten en plaats ze in een petrischaaltje met rijpingsmedium aangevuld met één micromolar cilostamide. Plaats de schaal twee uur in een incubator om de oöcyten te laten herstellen van de stress die wordt veroorzaakt door hun isolatie van de follikels. Plaats een 10 centimeter lange borosilicaat glazen capillaire buis in een mechanische trekker om injectienaalden voor te bereiden.Buig de naaldpunt onder een hoek van 45 graden met behulp van een verwarmd filament voor een optimale injectie. Doe 20 microliterdruppels van basisocyt verzamelmedium in een polystyreenschaal en bedek de druppels met lichte minerale olie. Bereid een groter volume reporter mix door het toevoegen van 12,5 microgram per microliter van Ypet UTR en mCherry elk.Bewaar aliquots hiervan bij min 80 graden Celsius. Bij het ontdooien centrifugeer je de aliquot gedurende twee minuten op 20.000 keer G en breng je het vervolgens over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Laad de injectienaald met ongeveer 0,5 microliter reportermix.Plaats de holdingpipet en de injectienaald in de houders en plaats ze in de druppel van het oöcytopvangmedium. Open de injectienaald door deze voorzichtig tegen de pipet te tikken. Plaats oöcyten in een druppel basisinzamelingsmedium en injecteer vijf tot tien picoliters van de reportermix.Incubeer de oöcyten en het rijpingsmedium gedurende 16 uur met één micromolar cilostamide om het mCherry-signaal te laten plateauen. Voor time-lapse microscopie, bereid een Petrischaal met twee 20 microliter druppels rijpingsmedium voor elke geïnjecteerde verslaggever, een druppel met een micromolar cilostamide voor controle profase I-arrested oöcyten, en een druppel zonder cilostamide voor rijpende oöcyten. Bedek de druppels met lichte minerale olie en plaats ze in de incubator.Verwijder na de pre-incubatie de geïnjecteerde oöcyten uit de incubator en was ze vier keer in rijpingsmedium zonder cilostamide. Bewaar sommige oöcyt in rijpingsmedium met één micromolar cilostamide als profase I oöcytcontrolegroep. Breng de geïnjecteerde oöcyten over in hun respectieve druppels op de eerder bereide time-lapse microscoopschotel.Cluster de oöcyten met een gesloten glazen pipet om hun beweging tijdens de opname te voorkomen. Plaats de schotel onder de microscoop uitgerust met een lichtgevende diode eliminatie systeem en een gemotoriseerde fase uitgerust met een milieukamer onderhouden op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, met behulp van de parameters vermeld in de tekst manuscript. Voer de juiste instellingen voor het timelapse-experiment in door op Apps te klikken en vervolgens op Multidimensionale acquisitie.Selecteer het eerste tabblad Hoofd en selecteer time-lapse, posities in meerdere werkgebieden en meerdere golflengten. Selecteer het tabblad Opslaan om de locatie in te voeren waar het experiment moet worden opgeslagen. Selecteer vervolgens het tabblad Time-Lapse om het aantal tijdspunten, duur en tijdsinterval in te voeren.Selecteer het tabblad Werkgebied, schakel brightfield in en zoek de positie van de oöcyten door een nieuw venster te openen en Acquire, Acquire en Show Live te selecteren. Zodra de oöcyten zich bevinden, schakelt u terug naar het multidimensionale acquisitievenster en drukt u op plus om de locatie van de oöcyten in te stellen. Selecteer het tabblad Golflengten en stel drie verschillende golflengten in voor brightfield, YFP en mCherry.Pas de belichting voor Ypet en mCherry aan en start vervolgens het time-lapse-experiment door op Acquire te klikken. Voor de analyse van Ypet drie priem UTR-vertaling, voert u twee regiometingen uit voor elke oöcyt, de oöcyt zelf door op ellipsgebied te klikken en een klein gebied rond de oöcyt dat moet worden gebruikt voor achtergrondaftrek door op rechthoekig gebied te klikken. Exporteer de regiometingsgegevens naar een spreadsheet door te klikken op Logboek openen en vervolgens op Logboekgegevens.Trek voor elke afzonderlijke oöcyt en voor alle gemeten tijdpunten de achtergrondregiometing afzonderlijk af van de oöcytregiometing voor YFP- en mCherry-golflengten. De expressie van mCherry en YFP in profase I en rijpende oöcyten werd geregistreerd in 39 oöcyten, waarvan er 30 gerijpt waren, en negen werden gearresteerd in profase I als een negatieve controle. Individuele YFP-naar-mCherry-verhoudingen voor signalen van profase-I-arrested en rijpende oöcyten werden gecorrigeerd voor geïnjecteerd volume door het YFP-signaal te delen door het gemiddelde mCherry-signaal van de laatste 10 tijdspunten voor profase I-arrested en rijpende oöcyten.De omrekeningssnelheden van de reporter YFP werden gemeten door middel van een curve die paste bij de YFP-naar-mCherry-verhoudingen in profase I en in rijpende oöcyten gedurende de eerste nul tot twee uur, of acht tot 10 uur na het vrijkomen van cilostamide met behulp van lineaire regressie. De accumulatie van de verslaggever volgt geen lineair patroon, zoals aangegeven door een significant verschil in vertaalsnelheden tussen nul tot twee uur en acht tot 10 uur na het vrijkomen van cilostamide, wat wijst op activering van interleukine 7-vertaling tijdens oöcyt myotische rijping. Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat de belichtingstijd aan het begin van de opname voldoende is.Houd er rekening mee dat het signaal tijdens de tijdscursus kan verzadigen als de vertaling wordt geactiveerd tijdens de hervatting van het oöcytmeiotisch. De stabiliteit van de MRMA kan worden bevestigd door PCR, met behulp van primers voor YFP. Om veranderingen in de vertaling te bevestigen, kunt u Western blotting gebruiken met een antilichaam tegen een V5-technologie.

defining-program-maternal-mrna-translation-during-vitro-maturation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In this video, we demonstrate that in the presence of a phosphodiester inhibitor, the oocyte cell cycle is arrested at prophase-I, during which transcribed mRNAs are stored in the absence of translation. After the release of the inhibitor, oocyte maturation resumes, and the cells enter metaphase. The signal of reporter mRNA fused with the target gene in metaphase-I indicates the activation of translational machinery and protein expression.

The In Vitro Single Oocyte Reporter Assay: A Technique to Study Target mRNA Translation Regulation During In Vitro Oocyte Maturation

We beschrijven methoden om onrijpe eicellen van Xenopus laevis te manipuleren, in vitro rijping van eicellen tot eieren, en intracytoplasmatische sperma-injectie. Dit protocol maakt degradatie van sommige maternale eiwitten en overexpressie van interessante genen bij bevruchting mogelijk, en is daarom waardevol om de rollen van specifieke factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Controle van eiwitsynthese vindt voornamelijk plaats tijdens de initiatiefase van translatie, waarvan tekortkomingen zijn gekoppeld aan verschillende aandoeningen. Om de etiologie beter te begrijpen, beschreven we hier een protocol met Xenopus laevis eicellen dat de translatie van het mos-transcript beoordeelt in aanwezigheid van een mutant van translatie-initiatiefactor eIF4G1.

Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment

Hier presenteren we een protocol specifieke siRNA-gemedieerde mRNA afbraak gevolgd door immunofluorescentie analyse meiotische spileenheid en organisatie evalueren muizen oöcyten. Dit protocol is geschikt voor in vitro depletie van transcripties en functionele beoordeling van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren in oöcyten.

Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing

Een geoptimaliseerd protocol voor de in vitro rijping van oöcyten zebravis gebruikt voor het manipuleren van moederlijke genproducten wordt hier gepresenteerd.

Functionele Manipulatie van Maternal Gene producten met behulp van<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturatie van zebravis

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

Reproducibly het om getallen te tellen van mRNAs in individuele eicellen, enkel molecuul RNA fluorescentie in situ is hybridisatie (RNA-vis) geoptimaliseerd voor niet-aanhanger cellen. Eicellen werden verzameld, gekruist met het transcript specifieke sondes en gekwantificeerd aan de hand van een afbeelding kwantificering software.

Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.

Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten

Dit protocol beschrijft procedures voor in-vitro rijping van muis-oocyten, in-vitrofertilisatie en daaropvolgende embryokweek tot het blastocyststadium.

Muize-oocyt in vitro rijping, bevruchting en kweek van pre-implantatie embryo's

Ontdek hoe u een enkele oöcytreportertest gebruikt om mRNA-translatie tijdens in vitro rijping te bestuderen. Deze methode identificeert regelende elementen met behulp van time-lapse microscopie.

Het programma van maternale mRNA-vertaling definiëren tijdens in vitro rijping met behulp van een enkele oöcytreportertest

Meer video's verkennen