Semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neurondichtheid in de substantia Nigra van knaagdiermodellen met behulp van geautomatiseerde beeldanalyse
2 februari 2021
Hier presenteren we een geautomatiseerde methode voor semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neuron nummer in de rat substantia nigra pars compacta.
Schatting van dopaminerge neuron nummer in de substantia nigra is een belangrijke uitkomstmaat in de ziekte van Parkinson onderzoek. Dit protocol verkort de werklast die nodig is om het neuronnummer te schatten aanzienlijk. Deze methode biedt een tijdsefficiënt en nauwkeurig proces voor het detecteren van veranderingen in het aantal dopaminerge neuronen en is geschikt voor het bepalen van het effect van interventies op de celoverleving.
Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om nauwkeurige tellingen van neuronen in verschillende hersengebieden te bieden, terwijl de kosten- en tijdvoordelen ten opzichte van traditionele stereologische methoden behouden blijven. Om IHC-beelden vast te leggen, gebruikt u de software die is gekoppeld aan een confocale microscoop met een vergroting van 10x. Open het pingat tot 1,5 gebiedseenheden om een breed vlak van in totaal 1,5 micrometer vast te leggen en de focus op de geïnjecteerde kant van de hersenen te leggen.
Controleer op het tabblad acquisitie de optie tegelscanweergave en stel de afmetingen in op 10 bij 4. Stel onder het paneel acquisitiemodus de zoom in op 1.1 om stiksporen tussen de tegelscanafbeeldingen te voorkomen. Stel de framegrootte in op 1024 bij 1024 pixels en de gemiddelde op twee om een hoge beeldkwaliteit te garanderen.
Stel in het kanaalpaneel track één in op Alexa 488 en track twee op Alexa 555. Plaats de dia op het podium en kies een sectie met een sterke TH-kleuring. Klik live op het acquisitiepaneel.
Stel in het kanaalpaneel de lasersterkte en versterking in op niveaus die het signaal maximaliseren en het achtergrondgeluid beperken. Gebruik de bereikindicator om ervoor te zorgen dat de signalen niet overbelicht zijn. Herhaal dit met meerdere dia's.
Schakel op het tabblad Acquisitie het vakje Posities in. Om te beginnen met beeldvorming, gebruikt u het oogstuk en kiest u het eerste gedeelte met positieve TH-kleuring. Stel vervolgens de focus op het punt van belang en verplaats het podium naar de middellijn van de sectie.
Hiermee wordt de positie in de X-, Y- en Z-assen opgeslagen en wordt een tegelscan weergegeven die de hele sectie vastlegt. Herhaal dit voor alle andere dia's, inclusief een niet-geïnjecteerde site. Scheid afbeeldingsbestanden met behulp van de juiste software en importeer ze in geautomatiseerde beeldanalysesoftware.
Definieer een interessegebied door het gereedschap penannotatie te selecteren om een annotatie rond de substantia nigra pars compacta te tekenen. Ga naar het tabblad analyse en selecteer realtime afstemming in het vervolgkeuzemenu voor analyse. Dit opent een apart venster op de sectieafbeelding, zodat analyseparameters in realtime kunnen worden gewijzigd.
Selecteer onder de sectie analysevergroting de juiste beeldzoom. Selecteer onder de celdetectiesectie kernkleurstof als de kleurstof die wordt gebruikt voor TH-kleuring. Pas de nucleaire contrastdrempel, minimale nucleaire intensiteit, nucleaire segmentatieagressiviteit en nucleaire grootte-instellingen aan terwijl u het tijdafstemmingsvenster zorgvuldig bekijkt.
Herhaal dit proces met meerdere voorbeelden. Zodra een passend aantal afbeeldingen is gesampled en real-time tuning dienovereenkomstig is aangepast, slaat u de analyse-instellingen op in het vervolgkeuzemenu instellingenacties. Selecteer alle te analyseren afbeeldingen en klik op analyseren.
Kies de analyse-instelling die zojuist is opgeslagen en vink in het analysevenster het vakje annotatielagen aan, vink laag één aan en klik op analyseren. Zodra u de samenvattingsanalysegegevens voor alle secties hebt geëxporteerd, selecteert u de optie om objectanalysegegevens te exporteren. Deze dataset kan worden gebruikt om veranderingen in celgrootte te onderzoeken als reactie op een toxine of therapeutisch middel.
Zes weken na adeno geassocieerd virus of AAV injecties, stereotactische injectie van AAV uitdrukken mutant A53T alfa synucleïne in de substantia nigra in de rat hersenen resulteerde in een significante vermindering van de dichtheid van dopaminerge neuronen. Het gemiddelde aantal TH-positieve neuronen per millimeter in het kwadraat in de substantia nigra van ratten geïnjecteerd met AAV-A35T was aanzienlijk verminderd in vergelijking met dat van ratten geïnjecteerd met de AAV lege vector. Soortgelijke waarnemingen werden gedaan met behulp van onbevooroordede stereologie.
Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat de software slechts zo nuttig is als ze is opgeleid. Daarom moet er tijd en zorg worden genomen om ervoor te zorgen dat een enkele cel als één cel wordt geïdentificeerd. De software kan worden aangepast om een fluorescentie-intensiteit van andere eiwitten van belang te meten, zoals alfa-synucleïne om te bepalen of behandelingen eiwitniveaus kunnen moduleren.
Deze techniek heeft gezorgd voor een grotere efficiëntie bij het testen van het effect van meerdere potentiële therapeutische stoffen op dopaminerge neurondichtheid.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een geautomatiseerde methode voor de semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neuronnummers in de substantia nigra pars compacta van de rat. Het protocol vermindert de werklast aanzienlijk en verbetert de nauwkeurigheid bij het schatten van neurontellingen, wat cruciaal is in Parkinson's ziekteonderzoek.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Psychiatrie
- Celbiologie
Achtergrond
- Schattingen van dopaminerge neuronnummers zijn van vitaal belang voor Parkinson's ziekteonderzoek.
- Traditionele methoden kunnen tijdrovend en minder nauwkeurig zijn.
- Geautomatiseerde methoden kunnen tijdbesparing en kostenvoordelen bieden.
- Kwantitatieve veranderingen in neuronnummers kunnen therapeutische effecten evalueren.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te presenteren voor efficiënte en nauwkeurige detectie van dopaminerge neuronnummers.
- Om onderzoekers in staat te stellen veranderingen in neurontellingen te analyseren als gevolg van verschillende interventies.
- Om het beeldvormings- en gegevensanalyseproces voor dopaminerge neuronen te vereenvoudigen.
Gebruikte methoden
- Geautomatiseerde beeldvormingsmethode met behulp van confocale microscopie.
- Focus op de substantia nigra pars compacta in een ratmodel.
- Het protocol omvat het vastleggen van IHC-beelden bij 10X vergroting met specifieke beeldinstellingen.
- Real-time afstemming en analyse van neuronale beelden via geautomatiseerde software.
- Inclusief gegevensanalyse voor veranderingen in neurondichtheid na interventie.
Belangrijkste resultaten
- Deze methode vertoonde significante verminderingen in TH-positieve neurondichtheid na AAV-injecties die mutant A53T alfa-synucleïne tot expressie brengen.
- Resultaten wezen op een afname van dopaminerge neurontellingen vergeleken met controlegroepen.
- Onbevooroordeelde stereologie werd gebruikt om bevindingen te valideren.
- Maakt detectie van morfologische veranderingen in reactie op therapeutische interventies mogelijk.
Conclusies
- De studie valideert een efficiënte methode voor het kwantificeren van dopaminerge neuronen.
- Deze techniek verbetert het begrip van neuronverlies in Parkinson's ziektemodellen.
- De gepresenteerde methoden kunnen de exploratie van therapeutische effecten op neurondichtheid vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
