Name: Creatie en onderhoud van een levende biobank - Hoe we het doen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Ontdek hoe je een levende biobank voor colorectale en pancreaskanker opzet en onderhoudt met patiënt-afgeleide modellen zoals PDX en primaire kankercellijnen. Deze methode ondersteunt preklinisch onderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We erkennen Jenny Burmeister, onze grafische assistent, vriendelijk voor het opnemen en bewerken van de video. Verder danken wij onze collega's van de chirurgische en pathologische afdeling voor de jarenlange samenwerking. We willen ook Marcus Müller, productiemanager van het IT- en Mediacentrum van de Universiteit van Rostock, bedanken voor het leveren van de audio-opnameapparatuur en het verfijnen van de geluidskwaliteit.
FINANCIERING: De Duitse Stichting voor Kankerhulp (DKH e.V.), subsidienummer 108446 en subsidienummer TBI-V-1-241-VBW-084 van de deelstaat Mecklenburg-Vorpommern financierden dit onderzoek deels.

<ol><li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Mouradov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+cell+lines+are+representative+models+of+the+main+molecular+subtypes+of+primary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer.</a> Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).</li>
<li>Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bacterial-immunotherapy+with+therapeutic+antibodies%3A+a+novel+therapeutic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept.</a> Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).</li>
<li>DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approval+success+rates+for+investigational+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+pharmacology+and+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Clinical approval success rates for investigational cancer drugs.</a> Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Mullins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Biobanking+and+Tumor+Model+Establishment+of+Human+Colorectal+Carcinoma+Provides+Excellent+Tools+for+Preclinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research.</a> Cancers. 11 (10), (2019).</li>
<li>Kuehn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+HROC69+-+a+Crohn%27s+related+colonic+carcinoma+cell+line+and+its+matched+patient-derived+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft.</a> Scientific reports. 6, 24671(2016).</li>
<li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+colon+cancer+cell+lines+from+fresh+tumors+versus+xenografts%3A+comparison+of+success+rate+and+cell+line+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features.</a> Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).</li>
<li>Gock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Take+Rate+Optimization+for+Colorectal+Carcinoma+Patient-Derived+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+research+international%22%5BJournal%5D)">Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models.</a> BioMed research international. 2016, 11715053(2016).</li>
<li>Collins, A. T., Lang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+the+validity+of+patient+derived+xenograft+%28PDX%29+models%3A+the+implications+for+translational+research+and+personalised+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine.</a> PeerJ. 6, 5981(2018).</li>
<li>Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li>
<li>Moyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+murine+tumors+in+the+development+of+patient-derived+xenografts%3A+a+potential+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall.</a> Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).</li>
<li>Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+carcinoma+tumour+budding+and+podia+formation+in+the+xenograft+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment.</a> PloS one. 12 (10), 0186271(2017).</li>
<li>Guenot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumour+genetic+alterations+and+intra-tumoral+heterogeneity+are+maintained+in+xenografts+of+human+colon+cancers+showing+chromosome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability.</a> The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).</li>
<li>Mattie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+patient-derived+human+pancreatic+tumor+xenograft+models+for+preclinical+and+translational+development+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics.</a> Neoplasia. 15 (10), New York, N.Y. 1138-1150 (2013).</li>
<li>Cho, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+patient-derived+xenografted+tumors+maintain+characteristic+features+of+the+original+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+surgical+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors.</a> The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).</li>
<li>Maletzki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Drug+Response+of+Freshly+Established+Patient-Derived+Tumor+Models+with+CpG+Island+Methylator+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype.</a> PloS one. 10 (11), 0143194(2015).</li>
<li>Katsiampoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+Patient-Derived+Xenografts+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).</li>
<li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+tumor+mice--a+new+model+to+study+and+manipulate+the+immune+response+in+advanced+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy.</a> International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).</li>
<li>Herndler-Brandstetter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+model+supports+development%2C+function%2C+and+tissue+residency+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).</li>
<li>Capasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immune+responses+to+anti-PD-1+mono+and+combination+immunotherapy+in+hematopoietic+humanized+mice+implanted+with+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+immunotherapy+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts.</a> Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37(2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Abe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+phosphoproteomic+analysis+for+phosphosignaling+and+active-kinome+profiling+in+Matrigel-embedded+spheroids+and+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids.</a> Scientific reports. 8 (1), 11401(2018).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
</ol>

De generatie van een levende biobank veronderstelt, afgezien van het voldoen aan de wettelijke voorschriften van privacy, medisch recht en dierenwelzijn, een goede infrastructuur en een goed gecoördineerd team. Het is voordelig gebleken om een deel van het chirurgisch personeel direct te betrekken bij de onderzoeksprocedures, omdat ze heel goed de geschiktheid van de individuele patiënt voor weefseldonatie kunnen beoordelen. Bovendien hebben patiënten de neiging om vaker in te stemmen met biobanking, wanneer hun schriftelijke goedkeuring wordt verkregen in de loop van de chirurgische geïnformeerde toestemmingsdiscussie. Om tijd en middelen te besparen, mogen gevallen die vermoedelijk onvoldoende hoeveelheden tumorweefsel opleveren, niet worden geselecteerd voor biobanking. Als het gaat om specimenverwerving, is de stelregel "communicatie is de sleutel" een eenvoudige, maar vaak over het hoofd geziene waarheid. Er is slechts één ongeïnformeerde theaterverpleegkundige of chirurgische collega nodig om het exemplaar in het begin te ruïneren door gewoon door te gaan en formaldehyde aan het resectiemonster toe te voegen. Daarom is het absoluut cruciaal dat elk lid van het betrokken personeel kennis maakt met de SOP voor biobanking. Chirurgen moeten de dag ervoor en direct aan het begin van de procedure worden opgemerkt over geplande weefselverzameling. Bovendien moeten gevallen die voor biobanking zijn geselecteerd, in het elektronische OR-plan worden benadrukt. Weefseloogst van het chirurgische monster moet worden uitgevoerd door een patholoog. Ten eerste zal dit ervoor zorgen dat de weefseloogst het definitieve pathologische rapport niet verstoort. Ten tweede verhoogt dit de kans op het ontvangen van weefsel met voldoende hoeveelheden levensvatbaar kankerweefsel. Vooral bij alvleesklierkankers met een uitgesproken desmoplastische reactie en frequente necrotische gebieden zijn levensvatbare delen moeilijk macroscopisch te identificeren voor het ongetrainde oog. Als uitzondering op deze regel kunnen weefselblokken van grote lever- of longmetastasen soms door de chirurg "back-table" worden verwijderd, als chirurgische marges macroscopisch kunnen worden gedefinieerd. Rectale kanker die door totale mesorectale excisie (TME) wordt gereseceerd, is mogelijk niet geschikt voor biobanking, omdat weefseloogst uit het gereseceerde monster voorafgaand aan paraffine-inbedding de TME-kwaliteitsbeoordeling kan verstoren. Als alternatief kan weefsel voor biobanking worden verkregen door transanale biopsie van rectale kanker.
De vestigingspercentages voor primaire celculturen afgeleid van de oorspronkelijke tumor zijn over het algemeen laag. PDX-afgeleide, secundaire celculturen kunnen waarschijnlijk met succes worden vastgesteld. We raden aan om voor elk geval verschillende media te testen en antibioticasupplementen te gebruiken voor de eerste passages om besmetting tot een minimum te beperken, omdat het geoogste weefsel zelden steriel is. Na succesvolle vermeerdering moet elke afzonderlijke cellijn worden bevestigd als een kankercellijn door middel van FACS-analyse en regelmatig worden getest op mycoplasmabesmetting. Om kruisbesmetting uit te sluiten, is regelmatige STR-analyse raadzaam. Opgemerkt moet worden dat het vestigingsprotocol voor primaire en secundaire cellijnen voortdurend wordt onderworpen aan optimalisatie. Details over de samenstelling en het succespercentage van de afzonderlijke media vallen duidelijk buiten het toepassingsgebied van dit werk en zullen afzonderlijk worden gepubliceerd.
Voor PDX-engraftment kan tumorweefsel direct na resectie worden geïmplanteerd of cryopreserveerd in foetaal kalverenserum met 10% DMSO of vergelijkbare bevriezingsmedia voor vertraagde implantatie. Implantatie onmiddellijk na het oogsten van tumorweefsel legt een druk op logistiek en laboratoriumpersoneel, en xenografting resultaten na cryopreservatie zijn helemaal niet inferieur 10. Bovendien verhoogt incubatie van het weefsel in Matrigel voorafgaand aan tumorimplantatie de engraftmentsnelheden aanzienlijk12. We raden vertraagde engraftment aan na definitieve pathologische bevinding en onmiddellijke verwijdering van ten onrechte verzamelde weefselmonsters. Omdat het slagingspercentage van primaire engraftment toeneemt met immunodeficiëntie van de ontvangende muis, hebben we de neiging om NSG-muizen te gebruiken voor de allereerste PDX-passage. Na de eerste succesvolle PDX-engraftment kunnen en moeten NMRInu/nu-muizen worden gebruikt voor latere passages en weefseluitbreiding. Deze soort is robuuster, goedkoper en gemakkelijker te kweken in vergelijking met NSG of vergelijkbare immunodeficiënte stammen, maar vertoont nog steeds redelijke engraftmentpercentages. Bovendien vergemakkelijkt de naaktheid implantatie en tumorgroeimonitoring. Om de engraftmentsnelheden in volgende passages te verhogen, raden we directe overdracht van vers geoogste PDX-weefsels aan om muizen waar mogelijk te ontvangen, vooral voor langzaam groeiende PDX en gevallen met een laag primair succespercentage. Collins en Lang hebben onlangs 14 studies van colorectale PDX-vestiging beoordeeld en gerapporteerde engraftmentpercentages variërend van 14 tot 100% met een mediaan PDX-vestigingspercentage van 68%, de laatste is consistent met onze bevindingen13. In overeenstemming met de literatuur, zagen we lagere vestigingspercentages van pancreas in vergelijking met colorectale kanker PDX14. Ongeacht de gastheermuisstam en tumorentiteit vormt de uitgroei van menselijke, Epstein-Barr Virus (EBV)-geassocieerde B-cellymfomen en murinelymfomen aan de implantatiezijde een belangrijke valkuil15,16. Indien niet herkend, kunnen dergelijke tumoren latere passages "besmetten" en zo opeenvolgende resultaten verwarren. Ongebruikelijke snelle PDX-groei en zwelling van cervicale, oksel- en lieslymfeklieren zijn sterke indicatoren voor de groei van murinelymfoom, maar regelmatig histologisch onderzoek van PDX is niettemin raadzaam. Bovendien moet de genetische concordantie tussen PDX en de overeenkomstige donorpatiënt regelmatig worden getest door middel van STR-analyse. Idealiter moet de biobank worden gekoppeld aan een klinische database met patiëntenkenmerken (algemene informatie, overleving, terugvalvrije overleving, therapie, secundaire neoplasie enz.). Vanwege wettelijke voorschriften voor privacybescherming en het ontbreken van een dergelijke geanonimiseerde database, wordt onze klinische dataset regelmatig handmatig beheerd en bijgewerkt door de samenwerkende artsen.
Hoewel conventionele biobanken beperkt zijn tot observatoriumonderzoek, biedt een levende biobank de mogelijkheid voor in vitro en in vivo interventies. Van patiënten afgeleide cellijnen zijn een belangrijk instrument voor fundamenteel onderzoek, geneesmiddelenscreenings met hoge doorvoer en beoordeling van nieuwe farmaceutische agentia4. Overeenkomstige PDX-modellen zijn echter van toenemend belang, omdat ze de histologie van de oorspronkelijke tumor17,18 nauw samenvatten en een hoge genetische stabiliteit vertonen over verschillende passages19,20. Onze PDX biobank heeft zich bewezen als een uitstekend platform voor preklinisch en fundamenteel onderzoek6,21. Aangezien grote PDX-collecties de interpersoonlijke heterogeniteit van de patiëntenpopulatie adequaat weerspiegelen, is de PDX clinical trial (PCT)-benadering (één dier per model per behandeling) van belang geworden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, omdat hiermee de getrouwe voorspelling van de klinische respons op nieuwe geneesmiddelen en het combinatorische regime mogelijk is8. We evalueren momenteel ook nieuwe experimentele geneesmiddelen in kleine PCT-proeven.
Ondanks deze veelbelovende resultaten belemmert de mediane vestigingsduur van 12,2 maand de klinische toepasbaarheid van PDX-modellen als "avatarmuizen" voor het testen van behandelingsopties tegen kanker, althans voor patiënten die onmiddellijke adjuvante of zelfs neoadjuvante behandeling nodig hebben22. Een bijkomend nadeel van standaard PDX-modellen is het gebrek aan bruikbaarheid voor immunotherapietests als gevolg van de immunodeficiëntie van gastheermuizen. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn verschillende "gemensiseerde" muisstammen ontwikkeld. Deze muizen zijn zwaar immuungecompromitteerd, maar kunnen worden gereconstitueerd met verschillende soorten menselijke beenmerg-afgeleide cellen of CD34+ hematopoietische stamcellen na PDX-uitgroei23, waardoor de evaluatie van lymfocytengemedieerde cytotoxiciteit en van therapierespons op immuun checkpoint inhibitor behandeling24,25.
In de afgelopen jaren kwamen patiënt-afgeleide organoïden (BOB) naar voren als belangrijke kankermodellen die concurreren met PDX. Afgeleid van intacte tumorstukken en gekweekt in een extracellulaire matrixsteiger, weerspiegelen deze driedimensionale structuren nauw de histologische en genetische eigenschappen van de oorspronkelijke tumor. De mogelijkheid van langdurige uitbreiding en cryopreservatie maakt BOB een ideaal supplement van een levende biobank26,27. Naast een relatief hoog vestigingspercentage is voor BOB van verschillende tumorentiteiten een betrouwbare voorspelling van de respons op geneesmiddelen gerapporteerd28. Bovendien zijn BOB 's zelfs gegenereerd uit circulerende tumorcellen en is ook de gelijktijdige vaststelling van organoïden uit overeenkomstig gezond weefsel mogelijk , waardoor de therapiegerelateerde toxiciteit op patiënt-individuele basis kan worden beoordeeld29,30. In vergelijking met conventionele 2D-celculturen is organoïde cultuur echter tijdrovend en kunnen kunstmatige extracellulaire matrixverbindingen bepaalde analytische procedures verstoren31. Bovendien zijn kankerorganoïden vatbaar voor overgroei door sneller groeiende, niet-kwaadaardige organoïden afkomstig van gezond epitheel30. Vanwege een gebrek aan stroma, bloedvaten en immuuncellen zijn BOB's meestal niet toepasbaar voor het testen van antiangiogene immunotherapeutische middelen. Toch maken nieuwe cultiveringsmethoden het mogelijk om tumormicromilieu in vitrote modelleren , waardoor BOB 's een echte kanshebber zijn voor PDX-modellen32. In de nabije toekomst zullen patiënt-individuele tumormodellen, gecombineerd met krachtige genetische hulpmiddelen zoals sequencing van de volgende generatie, hopelijk de weg effenen naar echte precisiegeneeskunde en op maat gemaakte behandelingsbenaderingen.

In de afgelopen jaren leidde de opgebouwde kennis van de morfologische, klinische en genetische eigenschappen van kanker tot de conceptie van kanker als een heterogene, individuele ziekte. Bijgevolg heeft mutatiekarakterisering van neoplasmata, naast klinische en pathologische kenmerken, belang gekregen voor klinische besluitvorming en zijn er veel gerichte therapieën ontwikkeld voor verschillende moleculaire veranderingen. De werkzaamheid van cetuximab bij de behandeling van colorectale kanker kan bijvoorbeeld worden voorspeld door de analyse van de KRAS- en PIK3CA-mutatiestatus 1. Precisiegeneeskunde streeft naar een op maat gemaakte aanpak om de hoogste behandelingsrespons bij elke patiënt te bieden en toxiciteit van inefficacious therapieën te voorkomen2. Biobanken bevatten weefsel, bloed en andere biologische materialen van kankerpatiënten, die zijn gekoppeld aan de klinische gegevens, en zijn dus een uitstekend hulpmiddel voor translationeel kankeronderzoek. Vanwege het grote aantal klinische monsters maken biobanken de detectie van zeldzame, maar mogelijk medicijngegeerbare mutaties mogelijk, wat nieuwe behandelingsmogelijkheden biedt voor de individuele patiënt3.
Om een zo breed mogelijk oncologisch onderzoeksspectrum te bestrijken, beperkten we onze activiteit op het oogsten van monsters niet alleen, maar richtten we ons op de oprichting van patiënt-afgeleide kankercellijnen en xenografts (PDX). Traditionele 2D-cellijnen blijven de hoeksteen van in vitro onderzoek en zijn de belangrijkste keuze voor grootschalige geneesmiddelenscreenings4,5. Bovendien is mobiele lijnanalyse vaak eenvoudiger, goedkoper en gemakkelijker beschikbaar. Aangezien patiënt-afgeleide perifere bloedlymfocyten (PBL) beschikbaar zijn, kan ook tumorimmunologie in vitroworden bestudeerd6. De meeste nieuw ontwikkelde geneesmiddelen met veelbelovende preklinische effectiviteit in in vitro of in vivo experimenten op celbasis hebben echter teleurstellende resultaten aangetoond in klinische studies7. Daarentegen hebben preklinische studies op basis van PDX in vivo studies de klinische activiteit van antineoplastische agentia veel getrouwer weerspiegeld8. Aangezien PDX-weefsel de histologische en moleculaire eigenschappen van de donortumor nauw weerspiegelt, zijn PDX-modellen een goede manier om de vaak zeer beperkte hoeveelheden levensvatbaar tumorweefsel te vermeerderen om de integriteit van een biobank te behouden en de uitwisseling van monsters tussen onderzoeksgroepen en instellingen mogelijk te maken. Bovendien kunnen kankercellijnen afgeleid van PDX-weefsel aanzienlijk gemakkelijker worden vastgesteld dan primaire kankercellijnen9. In de afgelopen jaren heeft onze werkgroep een uitgebreide geïntegreerde biobank voor colorectale en pancreaskanker opgericht door stapsgewijs de werkstroom voor alle biologische monsters in kwestie te standaardiseren en te optimaliseren(figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> Figuur 1: Workflow en organisatie van de biobank <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Bacillol&reg; AF; 1L</td><td>Bode, Hartmann</td><td>REF 973380</td><td>desinfectie</td></tr><tr><td>PP centrifugebuis, 15ml; steriele</td><td>Greiner Bio One</td><td>GBO Cat. No.:188271</td><td>centrifugebuis</td></tr><tr><td>PP centrifugebuis, 50ml, steriele</td><td>Sarstedt</td><td>Order number: 62.547.254</td><td>centrifugebuis</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II-sering 20ml</td><td>BD</td><td>REF 300296</td><td>bloedafname</td></tr><tr><td>Serum 7,5ml Sarstedt Monovette</td><td>Sarstedt</td><td>Item number: 01.1601</td><td>bloedafname</td></tr><tr><td>serologische Pipet 10ml</td><td>Sarstedt</td><td>REF 86.1254.001</td><td>vloeistofoverdracht</td></tr><tr><td>Pipetboy ratiolab&reg; accupetta</td><td>Ratiolab</td><td>Item number: RL3200300</td><td>vloeistofoverdracht</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>VWR Cat.No: 613-4438</td><td>vloeistofoverdracht</td></tr><tr><td>DPBS; zonder Ca &amp; Mg</td><td>Pan Biotech</td><td>Cat. No.: P04-36500</td><td>wassen</td></tr><tr><td>Pancoll human</td><td>Pan Biotech</td><td>Cat. No.: P04-60500</td><td>dichtheidsgradientcentrifugatie</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd adelaarsmedium)</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. No.: P04-41500</td><td>celcultivar</td></tr><tr><td>FBS Good Forte (gefilterd runder serum)</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. No.: P40-47500</td><td>celcultivar</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. No.: P04-80100</td><td>celcultivar</td></tr><tr><td>Trypsine / EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. No.: P10-023100</td><td>celcultivar</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl Sulfoxid voor celcultuur)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>VWR Cat.No: A3672.0250</td><td>celvries</td></tr><tr><td>Freezer Medium (FCS met 10% DMSO)</td><td>zelf gemaakt</td><td>---</td><td>celvries</td></tr><tr><td>cryotube- CryoPure 2ml</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>celvries</td></tr><tr><td>6-Well celcultuurplaat; steriele; met deksel</td><td>Greiner bio-one</td><td>Cat.-No.: 657 160</td><td>celcultivar</td></tr><tr><td>Petrischaal 92 x 16 mm, PS, zonder kamers</td><td>Sarstedt</td><td>Cat. No.: 82.1472.001</td><td>weefselvoorbereiding</td></tr><tr><td>steriele chirurgische messen</td><td>B.Braun (Aesculap)</td><td>REF BB510</td><td>weefselvoorbereiding</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II-sering 10ml</td><td>BD</td><td>REF 309110</td><td>weefselvoorbereiding</td></tr><tr><td>cell zeef; geel; 100&micro;m</td><td>Falcon</td><td>REF 352360</td><td>weefselvoorbereiding</td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>biocision</td><td>Item number: 210004</td><td>koelcontainer met -1&deg;C/min</td></tr><tr><td>Dewar&nbsp;transportvat type 27 B, 2 l, 138 mm</td><td>KGW</td><td>Cat. No.: HT39.1</td><td>transportsysteem</td></tr><tr><td>Pipettip 200&micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.760.002</td><td>vloeistofoverdracht</td></tr><tr><td>Filtertip 1000&micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.762.411</td><td>vloeistofoverdracht</td></tr><tr><td>Pipet 200&micro;l, geel</td><td>Eppendorf</td><td>Cat. No.: 3121 000.082</td><td>vloeistofoverdracht</td></tr><tr><td>Pipet 1000&micro;l, blauw</td><td>Eppendorf</td><td>Cat. No.: 3121 000.120</td><td>vloeistofoverdracht</td></tr><tr><td>incubator&nbsp; BB 6220 CU</td><td>Heraeus</td><td>Cat.-No.: 51012839</td><td>celcultivar</td></tr><tr><td>verwarmingsplaat PR&Auml;ZITHERM</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>---</td><td>verwarming</td></tr><tr><td>Microscoop Zeiss Primo Vert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>Serienummer. 3842000839</td><td>beeldvorming celculturen</td></tr><tr><td>Sterile werkbank Safe flow 1.8 nunc</td><td>nunc GmbH &amp; Co. KG</td><td>---</td><td>steriele werkbank</td></tr><tr><td>vriezer -80&deg;C</td><td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td><td>---</td><td>monsteropslag</td></tr><tr><td>Elektronische weegschaal MP-300</td><td>Chyo</td><td>---</td><td>schaal</td></tr><tr><td>BD Micro-fine, U100 insulinesering</td><td>BD</td><td>REF 324826</td><td>injectieanesthesie</td></tr><tr><td>Rompun 2%; 25ml</td><td>Bayer</td><td>goedkeuringsnummer: 6293841.00.00</td><td>anesthesie</td></tr><tr><td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>goedkeuringsnummer: 401650.00.00</td><td>anesthesie</td></tr><tr><td>GES3S-lezer</td><td>Datamars</td><td>niet beschikbaar</td><td>RFID-lezer</td></tr><tr><td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td><td>Peddymark</td><td>---</td><td>RFID-chip</td></tr><tr><td>Cotrim-ratiopharm&reg;&nbsp;Ampullen SF 480&nbsp;mg/5&nbsp;ml</td><td>Ratiopharm</td><td>PZN-03928197</td><td>antibioticum drinkwater</td></tr><tr><td>Verwarmingsplaat #FM-20 42x28cm</td><td>Dragon</td><td>---</td><td>verwarming</td></tr><tr><td>Verwarmingslamp</td><td>Electric Petra, Burgau</td><td>---</td><td>verwarming</td></tr><tr><td>Zalf voor de ogen en neus (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td><td>Bayer</td><td>PZN-01578675</td><td>Oogbescherming</td></tr><tr><td>anatomische pincet</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD21 OR</td><td>chirurgische instrumenten</td></tr><tr><td>chirurgisch pincet</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD50 1 R</td><td>chirurgische instrumenten</td></tr><tr><td>schaar</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BC05 6R</td><td>chirurgische instrumenten</td></tr><tr><td>naald&nbsp;houder</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BH1 1 OR</td><td>chirurgische instrumenten</td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>XN8870.P32</td><td>chirurgisch hechtmateriaal</td></tr><tr><td>Opsite vochtdoorlatende spraypleister</td><td>Smith&amp;Nephew</td><td>REF 66004978, PZN- 02063507</td><td>chirurgisch hechtmateriaal</td></tr><tr><td>Zelfklevende opening drape</td><td>Barrier</td><td>REF 90462

creatie en onderhoud van een levende biobank - hoe we het doen

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

In het licht van de groeiende kennis over de inter-individuele eigenschappen en heterogeniteit van kankers, vereist het opkomende gebied van gepersonaliseerde geneeskunde een platform voor preklinisch onderzoek. In de afgelopen jaren hebben we een biobank van colorectale en pancreaskankers opgericht die bestaat uit primair tumorweefsel, normaal weefsel, sera, geïsoleerde perifere bloedlymfocyten (PBL), van patiënten afgeleide xenografts (PDX), evenals primaire en secundaire kankercellijnen. Aangezien het oorspronkelijke tumorweefsel beperkt is en de totstandbrengingssnelheid van primaire kankercellijnen nog steeds relatief laag is, staat PDX niet alleen het behoud en de uitbreiding van de biobank toe, maar ook de generatie van secundaire kankercellijnen. Bovendien is bewezen dat PDX-modellen het ideale in vivo model zijn voor preklinische geneesmiddelentests. Biobanking vereist echter een zorgvuldige voorbereiding, strikte richtlijnen en een goed afgestemde infrastructuur. Colectomy, duodenopancreatectomie of herverdoemde uitzaaiingen worden onmiddellijk na resectie verzameld en overgebracht naar de pathologieafdeling. Met inachtneming van de prioriteit van een onbevooroordeeld histopathologisch rapport, naar goeddunken van de behandelende patholoog die de dissecties uitvoert, worden kleine tumorstukken en niet-tumorweefsel geoogst. 
Necrotische delen worden weggegooid en het resterende tumorweefsel wordt in kleine, identieke kubussen gesneden en cryopreserveerd voor later gebruik. Bovendien wordt een klein deel van de tumor gehakt en gespannen voor de primaire kankercelcultuur. Bovendien worden bloedmonsters van de patiënt vóór en na de operatie verwerkt om serum en PBL's te verkrijgen. Voor PDX-engraftment worden de cryopreserveerde exemplaren ontdooid en subcutaan in de flanken van immunodeficiënte muizen geïmplanteerd. De resulterende PDX vat de histologie van de "donor"-tumoren nauw samen en kan worden gebruikt voor latere xenografting of cryopreserveerd voor later gebruik. In het volgende werk beschrijven we de individuele stappen van creatie, onderhoud en toediening van een grote biobank van colorectale en alvleesklierkanker. Bovendien benadrukken we de cruciale details en kanttekeningen die gepaard gaan met biobanking.

In onze handen was het vestigingspercentage van primaire celculturen (figuur 2A &amp; B) 12,9% in een grote serie9. De meeste pogingen om uitbreidbare tumorcellen te isoleren van verse chirurgische gereseceerde exemplaren mislukten vanwege een gebrek aan uitgroei of vroege besmetting. De vestiging van de cellijn werd als succesvol beschouwd na 3 passages met een gestage groei onder standaardcultuuromstandigheden (DMEM, 10% FCS, standaard kweekvat) en validatie van epitheeldifferentiatie via FACS-analyse10. Cellijnen afgeleid vanPDX-tumoren ( figuur 2C & D) vertoonden een hoger vestigingspercentage van 23,6% wat ook te wijten is aan de mogelijkheid van herhaalde pogingen in tegenstelling tot primaire gereseceerdetumoren 9. Sommige gemengde culturen (figuur 2E) kunnen echter niet vrij zijn van fibroblastische groei of gaan zelfs verloren als gevolg van fibroblastische overgroei (figuur 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> Figuur 2: Celcultuur. Primaire kankercellijnen, afgeleid van een uitzaaiing van darmkankergeval HROC313, passage 21 (A) en alvleesklierkankergeval HROP88, passage 5 (B). PDX-afgeleide kankercellijnen van colon PDX HROC285 T0 M2 (D) en pancreas PDX HROP10 T5 M2, passage 4 (E). Gemengde cultuur van fibroblasten en kankercellen uit alvleesklierkanker HROP75, passage 8 (C) en fibroblastische overgroei (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Gezien veranderingen in het PDX-generatieprotocol, gebruikte muisstammen en ook experimenten gedurende meerdere jaren, evenals grote verschillen in de hoeveelheid tumorweefsel die beschikbaar is voor engraftment, is het niet triviaal om het algehele slagingspercentage van pdx-generatie te geven. In een zeer recente reeks PDX-generatie-experimenten uitgevoerd door twee onderzoekers (S.M. en F.B.), werden primaire uitgroeisnelheden van 63% voor colorectale PDX (een voorbeeldige histologie kan worden weergegeven uit figuur 3A)en 48% voor pancreas PDX (figuur 3B) waargenomen. De uitgroei van murine of menselijke lymfomen op de implantatieplaats is relatief zeldzaam, maar kan succesvolle PDX-uitgroei nabootsen (figuur 3C). Afgezien van histopathologisch onderzoek werd de concordantie tussen PDX-modellen en hun donorpatiënten regelmatig bevestigd door een korte tandemherhalingsanalyse (STR) (figuur 3D). Tot op de dag van vandaag bestaat de biobank uit >50 primaire en >50 secundaire colorectale, 3 primaire en 6 secundaire alvleesklierkankercellijnen, evenals > 150 colorectale en 19 pancreas PDX-modellen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve histologische vergelijking van colorectaal (A) en pancreas PDX (B). Humaan lymfoom op de implantatieplaats dat PDX-uitgroei (C) nabootst. Genetische identiteitstesten van een PDX-model (HROC430 T1 M2) aan het oorspronkelijke tumorweefsel van de patiënt (HROC430Tu) door korte tandemherhaling (STR) analyse. Vergelijking van de negen STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (FAM-kleurstof) en D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX-kleurstof) met behulp van multiplex PCR met fluorescerende primers na capillaire elektroforese bevestigde genetische concordantie van de PDX en donortumor (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

In het volgende werk beschrijven we de opeenvolgende stappen die nodig zijn voor de oprichting van een grote biobank van colorectale en alvleesklierkanker.

Creatie en onderhoud van een levende biobank - Hoe we het doen

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Creatie en onderhoud van een levende biobank hoe we dat doen. Introductie. Traditionele biobanken bevatten vaak niet-levensvatbare weefsel- en bloedmonsters. Ondanks het adequaat weerspiegelen van de diversiteit van kankerpatiëntenpopulaties en het toestaan van genetische en histologische analyses, zijn ze ongeschikt voor preklinische assays die therapeutische strategieën evalueren.Een biobank die ook patiënt-afgeleide modellen integreert overwint deze beperkingen. Aldus het mogelijk maken van functionele tests voor precisiegeneeskunde. Voorbeeldaanwinst.Voor biobanking van colorectale en alvleesklierkanker, kies gevallen met bewezen diagnose en voldoende tumorgrootte, geïnformeerde concent van de patiënt is verplicht. Vóór het begin van de operatie, trek 20 ml bloed met behulp van een gehepariniseerde spuit en extra 7,5 ml met een serummonovet. Serumverwerking en PBL-isolatie.Na centrifugeren bij 1, 128 RCF gedurende 15 minuten bij vier graden wordt het serum ge aliquoted in een voorgelabelde cryobuis en direct ondergedompeld in vloeibare stikstof. Het gehepariniseerde bloed wordt overgebracht naar een polypropyleen buis en verdund met 15ml PBS. Gebruik een serologische pipet om het mengsel langzaam te ondervloeren met 15ml Pancoll.Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt de ondoorzichtige laag met de mononucleaire cellen opgenomen met een serologische pipet en overgebracht naar een nieuwe PP-buis. Na het wassen met PBS en het pelleteren van de mononucleaire cellen door centrifugeren, gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in vriesmedium en doseer in voorgelabelde cryotubes. Breng de buizen over in een koelcontainer die geschikt is voor langzaam invriezen met één graad per minuut en bewaar ze tijdelijk op 80 graden.Weefselverwerking. Zodra het weefselmonster door de chirurg is gereseceerd, plaatst u het in een geschikte container. Vermijd onder alle omstandigheden dat het weefsel bedekt is met formaline.Transport zo snel mogelijk naar de pathologie voor excisie van tumormateriaal dat niet relevant is voor pathologische evaluatie van de resectiemarges. Het tumorstuk moet zo aseptisch mogelijk worden behandeld. Verkrijg bovendien een monster van gezond weefsel en plaats beide in afzonderlijke buizen die zijn voorgevuld met weefselopslagoplossing op ijs.Keer onmiddellijk terug naar het lab om te beginnen met weefselverwerking onder steriele omstandigheden. Het weefselstuk wordt op een steriele plastic schaal geplaatst gevuld met weefselopslagoplossing om uitdroging te voorkomen. Allereerst, accijns een of meer pinhead-sized stukken voor snap bevriezing, afhankelijk van de grootte van het verkregen weefselmonster.Plaats het inheemse weefsel in voorgelabelde cryotubes en dompel het onmiddellijk onder in vloeibare stikstof. Snijd het resterende weefsel in blokjes van drie bij drie bij drie kubieke millimeter. Houd er rekening mee dat necrotisch weefsel volledig moet worden ontleed, maar niet mag worden weggegooid.Schik de kubussen in viervoeters om het aantal aliquots voor vitale opslag te bepalen. Label een voldoende aantal cryotubes en vul ze voor met elk 1,5 ml vriesmedium. Omdat de DMSO in het vriesmedium cytotoxisch is, voerden de volgende stappen snel en zonder onderbreking uit.Gebruik een scalpelmesje om vier weefselstukken per tube op te scheppen. Zorg ervoor dat alle stukken volledig zijn ondergedompeld in een vriesmedium, idealiter aan de onderkant van de buis en snel buizen bevriezen met behulp van een vriescontainer. Ga op dezelfde manier te werk met het gezonde exemplaar.Bewaar voor langdurige opslag alle aliquotes in een vloeibare stikstoftank. Celcultuur. Maal de resten van de verwerking van tumorweefsel, inclusief de necrotische gedeelten met de scalpelbladen zo klein mogelijk.Plaats een celzeef aan de bovenkant van een steril PP-buis en aspireer de suspensie met een serologische pipet om door de celzeef te gaan. Gebruik de zuiger van een spuit voor eenmalig gebruik om de weefselresten door de celzeef te drukken om een enkele celsuspensie te genereren. Spoel af met PBS en herhaal deze stappen totdat er geen materiaal meer over is.Verwijder de celzeef en centrifugeer de suspensie gedurende zeven minuten op 180 RCF. Bereid ondertussen een collageen voorgecoate zesputplaat met verschillende mediasamenstellingen voor om de kans op tumoruitgroei te vergroten. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in PBS en doseer 500 microliter per put.Plaats de plaat daarna in een standaard incubator. Generatie van patiënt-afgeleide xenograft. Voor de generatie van van patiënten afgeleide xenograften bij immuungecompromitteerde muizen moeten dieren in een specifieke ziekteverwekkervrije omgeving worden gehouden.Draag persoonlijke beschermingsmiddelen bestaande uit scrubs, schort, gezichtsmasker, haarbedekking en handschoenen. Neem na het inrichten van uw werkruimte het wenstumormonster uit de vloeibare stikstofcontainer. Vul een verse PP-buis met 35 ml PBS en was vervolgens het ontdooiproces zorgvuldig en kantel de cryobuis op en neer.Zodra de inhoud slushy wordt, giet in de PBS en spoel de tumorstukken. Gooi het grootste deel van de PBS weg en leeg de blokjes in het deksel. Leg een steriele plastic schaal op een ijspak en voeg een druppel van 100 microliter Matrigel toe.Gebruik een tang om de tumorstukken in de Matrigel te plaatsen en de tumor gedurende 10 minuten te incuberen. Verdoof ondertussen twee muizen. Controleer de diepte van de anesthesie door de voet van het dier te knijpen.Elke beweging duidt op onvoldoende anesthesie en vereist enige wachttijd of extra dosering. Breng oogzalf aan, knijp de muis bij de nek en injecteer een microchip subcutaan. Voer de volgende stappen parallel uit.Desinfecteer de flanken van de muizen en maak een kleine huidincisie met een streep Metzenbaum-schaar en vorm een onderhuidse zak door stompe voorbereiding. Gebruik anatomische tang om de tumorstukken in te brengen. Zorg ervoor dat het stuk aan de achterkant van de huidzak is geplaatst.Aspireer de resterende Matrigel en verdeel gelijk over alle vier de zakken. Wacht op het genezen van de gel en sluit de huid met hechtingen met één knop zonder de tumorstukken met de naald te beschadigen. Snijd de draad zo kort mogelijk boven de knoop en breng spuitverband aan om te voorkomen dat de hechtingen knikken.Scan de microchip en voeg de tumorinformatie toe aan de database voor latere identificatie van het dier. Bereid een kooi voor met vers beddengoed en nestmateriaal, plaats de muizen voor een infraroodlamp en bewaak het dier totdat de anesthesie is verdwenen. Explantatie van PDX.Nadat de PDX-tumor de vereiste grootte heeft bereikt, wordt de muis geëuthanaseerd door CO2-verstikking en daaropvolgende cervicale dislocatie. Ontleed de huid voorzichtig van de tumor en verwijder de PDX volledig. Representatieve resultaten.Plaats een tumor op een steriele plastic schaal en gebruik steriele scalpelbladen voor verdere verwerking. Snijd het gat met de plakjes, plaats ze in een histologiecassette en dompel ze onder in formaline om op een later tijdstip een in paraffine ingebed exemplaar te genereren voor histologische beoordeling. Breng de rest van de tumor over naar weefselopslagoplossing en creëer een nieuw vitaal bewaard en snap bevroren monster voor de biobank.Gebruik bovendien de overblijfselen van de PDX-tumor analoog aan de hoofdstukcelcultuur om secundaire tumorcellijnen vast te stellen. Om verdere PDX te genereren, brengt u twee of meer tumorstukken met Matrigel over naar een nieuwe ontvangermuis zoals eerder getoond. Conclusie. Door middel van het gepresenteerde protocol zijn we er tot nu toe in geslaagd om negen pancreas- en meer dan 100 colorectale patiënt-afgeleide kankercellijnen vast te stellen, evenals 19 pancreas- en meer dan 150 colorectale PDX-modellen.

creation-and-maintenance-of-a-living-biobank-how-we-do-it

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Kutane tumoren worden vaak weggegooid na Mohs micrografische chirurgie. Hier wordt een protocol beschreven dat klinisch ondersteunend personeel effectief kan verwerken en opslaan van huidkanker ( bv. Plaveiselcelcarcinoom, basale celcarcinoom en melanoom) monsters voor stroomafwaartse laboratoriumtoepassingen zonder in te grijpen bij klinische operaties.

Oprichting van een Biorepository op een kliniek

De praktische toepassing en de prestaties van methoden voor generatie van representatieve weefselmonsters van varkens diermodellen voor een breed spectrum van downstream analyses in biobank projecten worden gedemonstreerd, waaronder volumetrie, systematische steekproefsgewijze bemonstering, en differentiële verwerking van weefselmonsters voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses van morfologische en moleculair typen.

Bemonsteringsstrategie en verwerking van Biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen

Deze methode omvat het gebruik van klinische diagnostische gegevens voor patiënten met prostaatkanker om bemonsteringsprocedures te begeleiden, wanneer biobankingen weefsel na radicale prostatectomie. Dit overkomt problemen met eerder gepubliceerde methoden rond efficiëntie en beschikbaarheid van vers weefsel voor een breder scala van downstream toepassingen.

Gebruik van magnetische resonantie beeldvorming en biopsie gegevens te begeleiden bemonstering procedures voor prostaatkanker Biobanking

Dit protocol beschrijft een methode om individuele hersenverouderingstrajecten te volgen via een hersendonatieprogramma en de juiste karakterisering van hersenen. Hersendonoren zijn betrokken bij een langdurige longitudinale studie met inbegrip van seriële multi-dimensionale beoordelingen. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de verwerking van de hersenen en een nauwkeurige diagnostische methodologie.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol voor het verzamelen, verwerken en karakteriseren van veroudering hersenen

Biobanken zijn cruciale bronnen voor biomedisch onderzoek en de Biobank for Translational and Digital Medicine Unit van het European Institute of Oncology is een model op dit gebied. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de standaard operationele procedures van biobanken voor het beheer van verschillende soorten menselijke biologische monsters.

Biobank voor translationele geneeskunde: standaard operationele procedures voor optimaal monsterbeheer

Dit protocol beschrijft een methode om het verzamelen van monsters van radicale prostatectomiemonsters te vergemakkelijken. Het doel is om weefselmonsters van de monsters in kaart te brengen, te karakteriseren en micro-macro te ontleden op basis van anatomopathologische criteria voordat ze in een biobank worden opgeslagen.

Verbetering van de betrouwbaarheid van biobanking van prostaattumoren met verbeterde bemonsteringstechniek en histologische karakterisering

Dit protocol presenteert een geïntegreerd biorepository-platform voor de gestandaardiseerde verzameling, annotatie en biobanking van hoogwaardige menselijke waterige humor en glasvochtbiopten voor moleculaire downstream-analyses, waaronder proteomics, metabolomics en glycomics.

Biobanking van menselijke waterige en glasachtige vloeibare biopsieën voor moleculaire analyses

Dit protocol biedt een systematisch kader voor de oprichting van organoïden van eierstokkanker uit verschillende ziektestadia en pakt de uitdagingen van patiëntspecifieke variabiliteit aan om de opbrengst te verhogen en robuuste uitbreiding op lange termijn mogelijk te maken voor volgende toepassingen. Het bevat gedetailleerde stappen voor weefselverwerking, zaaien, het aanpassen van mediavereisten en immunofluorescentiekleuring.

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het verzamelen van borstkankermonsters, ontworpen om hun bruikbaarheid voor biobankieren, gepersonaliseerde geneeskunde en andere onderzoekstoepassingen te optimaliseren. De workflow voor het verzamelen van monsters, inclusief borstbiopsie en borstamputatieprocedures, wordt in detail beschreven, met de nadruk op het minimaliseren van weefselbeschadiging en het maximaliseren van de monsterkwaliteit.

Optimalisatie van borstbiopsie en borstamputatie Monsterafnameprocedures voor biobankieren, gepersonaliseerde geneeskunde en onderzoekstoepassingen

Hier leggen we een protocol voor het modelleren van de biofysische micro-omgeving waar de verknoping en verhoogde stijfheid van het basaal membraan (BM) geïnduceerd door geavanceerde glycatie eindproducten (AGE's) heeft pathologische relevantie.

Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

Ontdek hoe je een levende biobank voor colorectale en pancreaskanker opzet en onderhoudt met patiënt-afgeleide modellen zoals PDX en primaire kankercellijnen. Deze methode ondersteunt preklinisch onderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde.

Creatie en onderhoud van een levende biobank - Hoe we het doen

Meer video's verkennen