Single-molecule dwell-time analyse van restrictie endonuclease-gemedieerde DNA-splitsing

Met dit protocol kunnen we direct plaatsspecifieke DNA-splitsing waarnemen door restrictie-endonucleasen op het niveau van één molecuul. Onze gemultiplexte aanpak stelt ons in staat om de tijd te meten die honderden individuele REases nodig hebben om de katalytische cyclus te voltooien. Multiplexing stelt ons in staat om goed bevolkte verblijftijd tot splitsingsverdelingen te genereren die we kunnen aanpassen aan de gamma-waarschijnlijkheidsverdeling om inzicht te krijgen in het mechanisme van DNA-splitsing.

Begin met het bereiden van een vers buisje voor elke geresuspendeerde oligonucleotide op 50 microliter van de oligonucleotide en 50 microliter vers bereide DTT-oplossing in elke buis, pipet op en neer om te mengen en 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Pipeteer het volledige volume van elk monstermengsel voorzichtig op een voorbereide kolom en centrifugeer gedurende twee minuten bij 750G. Bewaar na het centrifugeren alle monsters die niet onmiddellijk worden gebruikt bij 20 graden Celsius om oxidatie van de thiolgroepen en de vorming van disulfidebindingen te voorkomen.

Pipetteer een aliquot van 50 microliter van de quantum dot-voorraad in een dialyseapparaat voor elke te maken constructie, en zorg ervoor dat u het membraan niet aanraakt met de pipetpunt. Dialyseer tegen een volume CHES-buffer dat ten minste 1.000 keer het monstervolume is met roeren bij 100 RPM gedurende 15 minuten. Haal met behulp van een pipetter de zwevende quantum dots voorzichtig uit het dialyseapparaat en breng ze over in een verse buis met een gelijk volume vers bereide Sulfo-SMCC-oplossing, pipetteren op en neer om te mengen.

Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 1.000 RPM om de Sulfo-SMCC te laten reageren met de primaire aminen op de kwantumdots. Gebruik vervolgens een pipetter om elk monster voorzichtig over te brengen in een nieuw dialyseapparaat. Om overtollig sulfo-SMCC te verwijderen, dialyseert u gedurende 15 minuten tegen een volume CHES-buffer dat ten minste 1.000 keer het volume in het dialyseapparaat is.

Vervang de buffer twee keer en voer in totaal drie keer dialyse uit met een verse CHES-buffer, zodat de dialyse na elke bufferwisseling 15 minuten kan doorgaan. Herhaal dan de dialyse met PBS. Haal met behulp van een pipetter voorzichtig de oplossing met de kwantumdots uit het dialyseapparaat en breng elk monster over in een vers buisje met een equimolaire hoeveelheid gedilateerd oligonucleotide verdund in PBS.

Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 1.000 RPM. Voeg BSA toe aan elk monster voor een eindconcentratie van 0,5 milligram per milliliter. Gebruik vervolgens een pipetter om elk monster voorzichtig over te brengen in een nieuw dialyseapparaat en dialyseer tegen de opslagbuffer.

Herstel na de dialyse voorzichtig elk monster en plaats het in een verse buis. Bewaar de monsters bij 4 graden Celsius. Combineer een monster van quantum dot-gelabelde oligonucleotiden met een tienvoudige molaire overmaat aan gebiotinyleerd oligonucleotide.

Verwarm het mengsel in een warmteblok tot 75 graden Celsius en houd het 5 minuten op die temperatuur. Zet vervolgens het warmteblok uit en laat het mengsel langzaam afkoelen. Bewaar de voltooide constructie bij 4 graden Celsius Boor met behulp van een draagbare roterende multitool die is uitgerust met een taps toelopende diamantpuntschijf twee gaten in tegenoverliggende hoeken van de kwartsschuif om als in- en uitlaat te dienen.

Zorg ervoor dat de slede op zijn plaats blijft zitten, smeer het bit en glijd constant met water tijdens het boren. Herstel na elk experiment het voorbereide kwartsglaasje door het gebruikte apparaat in aceton te weken om de lijm en epoxy op te lossen. Gooi de resterende onderdelen weg.

Combineer 25 microliter streptavidine-oplossing met 80 microliter PBS en 20 microliter blokkeerbuffer. Smeer een met PEG behandelde dekstrook in met dit mengsel en incubeer gedurende 30 minuten in een vochtige omgeving. Bereid tijdens de incubatie van de afdekstrook de beeldafstandhouder voor om een stroomkanaal te creëren.

Snijd een vierkant stuk beeldvormingsafstandsmateriaal van 1 inch en markeer vervolgens een 2 millimeter breed kanaal dat is uitgelijnd met de uiteinden van de gaten die in het kwartsglaasje zijn geboord. Snijd het kanaal met een scalpel uit het afstandsmateriaal. Reinig het kwartsglaasje grondig met aceton om eventuele lijmresten van eerdere experimenten te verwijderen.

Trek één kant van de achterkant van de afstandhouder en plaats deze voorzichtig op de kwartsgeleider, zorg ervoor dat u de inlaat- en uitlaatgaten niet bedekt. Was het afdekglaasje met water en droog het af met perslucht. Verwijder de andere kant van de achterkant van het afstandsstuk voor beeldvorming en klem deze met een plastic pincet tussen het kwartsglaasje en het functionele streptavidine-gecoate afdekglaasje om het geheel samen te drukken en luchtbellen van de lijm te verwijderen.

Snijd het uiteinde van de slang schuin af om een vrije doorstroming van de oplossing te garanderen. Steek vervolgens een 30 centimeter lange polyethyleen slang in elk gat in het kwartsglaasje. Houd de buizen op hun plaats met een buizenrek en gebruik vervolgens epoxy om de buizen op hun plaats en de randen van het gemonteerde apparaat af te dichten.

Zodra de epoxy is uitgehard, steekt u de stompe naald op een lege spuit in de uitlaatslang van het apparaat en dompelt u het uiteinde van de inlaatbuis onder in een bak gevuld met de blokkeerbuffer. Trek de zuiger van de spuit naar achteren om het apparaat te vullen met een blokkeerbuffer. Laat het apparaat vervolgens ten minste 30 minuten incuberen voordat u het gebruikt.

Bevestig het microfluïdische apparaat met tape aan de plaat van de microscooptafel. Breng het objectief in contact met de onderkant van het apparaat en plaats het objectief zo dat het gezichtsveld zich binnen het microfluïdische kanaal bevindt. Nadat u de uitlaatslang op de spuitpomp hebt aangesloten, spoelt u het microfluïdische kanaal door met een verse blokkeerbuffer door de zuiger van de spuit terug te trekken.

Controleer of er geen luchtbellen in de slang of in het kanaal vastzitten. Verdun 1 microliter van het bereide DNA-substraat tot 1 milliliter blokkeerbuffer. Plaats de inlaatbuis in het verdunde DNA-substraat en laat 800 microliter van de substraatoplossing door het kanaal stromen met een snelheid van 200 microliter per minuut.

Laat de DNA-oplossing 15 minuten in het kanaal incuberen nadat de stroom is gestopt. Na de incubatie stroomt u ten minste 800 microliter blokkeerbuffer door het kanaal met een snelheid van 200 microliter per minuut om het ongebonden DNA uit het kanaal te spoelen. Pas de focus van de microscoop aan zodat de aan het oppervlak gebonden quantum dots duidelijk zichtbaar zijn.

Spoel het microfluïdische apparaat met 800 microliter experimentele buffer zonder magnesium met een stroomsnelheid van 200 microliter per minuut. Voeg de REase toe aan een aliquot experimentele buffer zonder magnesium en meng voorzichtig door te pipetteren. Laat 800 microliter van 400 eenheden per milliliter EcoRV door het kanaal stromen met een debiet van 200 microliter per minuut.

Start het experiment door de experimentele buffer met magnesium en fluoresceïne te laten stromen met een stroomsnelheid van 200 microliter per minuut. Begin direct na het starten van de spuitpomp met het vastleggen van gegevens. Stop de gegevensverzameling na het stromen van 800 microliter buffer.

Na het introduceren van het DNA-substraat in de stroomcel en het wegspoelen van overtollig DNA en kwantumdots, zijn er meestal duizenden individuele kwantumpunten in een gezichtsveld. Ze zijn stabiel bevestigd aan het glasoppervlak en ondergaan tijdens het experiment geen merkbare dimming of significante bleking. Wanneer het REase door het kanaal is gestroomd in afwezigheid van magnesium, is ten minste 95% van de kwantumdots die aan het begin van het experiment aanwezig waren, nog steeds te zien aan het einde van de observatieperiode.

Wanneer de magnesiumhoudende buffer echter onmiddellijk na de REase wordt gestroomd, verdwijnt tot de helft van de kwantumdots aan het einde van de observatieperiode, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen wanneer REase en magnesium samen door het kanaal worden gestroomd. Het verdwijnen van de kwantumdot gebeurt snel en resulteert in een scherpe afname van het intensiteitstraject, wat een duidelijke indicatie geeft van het tijdstip waarop een bepaald DNA-molecuul wordt gesplitst. Dit experiment werd uitgevoerd met het goed bestudeerde type II P REase EcoRV.

Zowel de niet-lineaire kleinste kwadratencurve-aanpassing als de schatting van de maximale waarschijnlijkheidsparameter werden gebruikt om de waarden van n en bèta uit de gegevens te extraheren. De twee methoden voor het schatten van parameters waren in overeenstemming. Met behulp van de niet-lineaire kleinste kwadraten fit, was n 3,52 en bèta 5,78 seconden.

Met behulp van de maximale waarschijnlijkheidsschatting was n 3,41 en bèta 6,06 seconden. Deze test kan bewijs leveren voor de aanwezigheid van tussenstappen langs het splitsingspad. Het uitvoeren van deze test onder veranderende reactieomstandigheden kan helpen bij het vaststellen van de aard van reactietussenproducten die niet direct kunnen worden waargenomen.