Name: Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer sarcomer verkorting meten in pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met fluorescent-gelabelde sarcomere eiwitten. Deze methode visualiseert sarcomerfunctie in vitro voor cardiomyopathie onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag alle lableden van de afdeling Regeneratieve Geneeskunde van de Jichi Medical University erkennen voor de nuttige discussie en technische bijstand. Deze studie werd ondersteund door de subsidies van het Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 en JP20bm0804018), de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), en de Japanese Circulation Society (de Grant for Basic Research) aan H.U.

<ol><li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li>
<li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li>
<li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%3A+Progress%2C+Promises+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30(2020).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense-mediated+exon+skipping%3A+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li>
<li>Cho, G. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li>
<li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li>
<li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li>
<li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li>
<li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511%2F521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).</li>
<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
<li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+%28ES%29+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).</li>
<li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).</li>
<li>Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV%3A+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).</li>
<li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).</li>
<li>Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnzai%2C+T+%22Methods+of+Molecular+Biology%22">Methods of Molecular Biology</a>. Yoshida, Y., et al. , (2020).</li>
<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization%2C+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).</li>
<li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li>
</ol>

H.U. heeft een patent aangevraagd met betrekking tot dit manuscript.

PSC-CMs hebben een groot potentieel om te worden gebruikt als een in vitro platform om hartaandoeningen te modelleren en de effecten van geneesmiddelen te testen. Niettemin moet eerst een nauwkeurige, uniforme methode worden vastgesteld om de functies van PSC-CMs te beoordelen. De meeste functionele tests werken met PSC-CMs, bijvoorbeeld elektrofysiologie, calcium transiënt en metabolisme26, en een van de eerste patiënt-afgeleide PSC-CM studies ging over long-QT syndroom...

Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste oorzaak vanmortaliteit 1 en cardiomyopathie is de derde oorzaak van hartgerelateerde sterfgevallen2. Cardiomyopathie is een collectieve groep ziekten die hartspieren aantasten. De recente ontwikkelingen van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) en de gerichte differentiatie van iPS-cellen naar cardiomyocyten (PSC-CMs) hebben de deur geopend voor het bestuderen van cardiomyocyten met het genoom van de patiënt als een in vitro model van cardiomyopathie. Deze cellen kunnen worden gebruikt om de pathofysiologie van hartziekten te begrijpen, om hun moleculaire mechanismen op te helderen en om verschillende therapeutische kandidaten te testen3. Er is een enorme hoeveelheid interesse, dus patiënt-afgeleide iPS-cellen zijn gegenereerd (bijv. hypertrofische cardiomyopathie [HCM]4,5,aritmogene rechterventrikel cardiomyopathie [ARVC]6, verwijde cardiomyopathie [DCM]7, en mitochondriale-gerelateerde cardiomyopathieën8,9). Omdat een van de kenmerken van cardiomyopathie de disfunctie en verstoring van sarcomen is, is een geldig hulpmiddel nodig dat de sarcomerefunctie uniform meet.
Sarcomere verkorting is de meest gebruikte techniek om de sarcomerefunctie en de contractiliteit van volwassen cardiomyocyten afgeleid van diermodellen en mensen te beoordelen. Om sarcomere verkorting uit te voeren, zijn goed ontwikkelde sarcomen nodig die zichtbaar zijn onder fasecontrast. Psc-CMs gekweekt in vitro display onderontwikkelde en ongeorganiseerde sarcomen en, daarom, zijn niet in staat om te worden gebruikt om goed te meten sarcomere verkorting10. Deze moeilijkheid om de contractiliteit van PSC-CMs goed te beoordelen, belemmert het gebruik ervan als platform om cardiale functies in vitrote beoordelen . Om de contractiliteit van PSC-CMs indirect te beoordelen, zijn atoomkrachtmicroscopie, micro-postarrays, tractiekrachtmicroscopie en impedantiemetingen gebruikt om de effecten van de beweging die door deze cellen op hun omgeving wordt uitgeoefend te meten11,12,13. Meer geavanceerde en minder invasieve videomicroscopie-opnamen van daadwerkelijke cellulaire beweging (bijv. SI8000 van SONY) kunnen worden gebruikt om hun contractiliteit als alternatief te beoordelen, maar deze methode meet niet direct sarcomerebeweging of krachtgeneratiekinetiek14.
Om de beweging van sarcomen in PSC-CMs direct te meten, ontstaan nieuwe benaderingen, zoals fluorescerende tagging voor sarcomere-eiwitten. Lifeact wordt bijvoorbeeld gebruikt om filamenteuze actine (F-actine) te labelen om sarcomerebeweging15,16te meten . Genetisch gemodificeerde iPS-cellen zijn een andere optie voor het taggen van sarcomere-eiwitten (bijv. α-actinine [ACTN2] en Myomesin-2 [MYOM2]) door fluorescerend eiwit17,18,19.
In dit artikel beschrijven we hoe u time-lapse beeldvorming kunt uitvoeren voor het meten van sarcomere verkorting met behulp van Myom2-TagRFP (muis embryonale stam [ES] cellen) en ACTN2-mCherry (menselijke iPS-cellen). We laten ook zien dat een patrooncultuur de uitlijning van sarcomere vergemakkelijkt. Daarnaast beschrijven we een alternatieve methode van sarcomere-etikettering, met behulp van adeno-geassocieerde virussen (AAV's), die op grote schaal kunnen worden toegepast op iPS-cellen die van de patiënt zijn afgeleid.

<table><tbody><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,</td><td>NOF Corp.</td><td>LIPIDURE-CM5206</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>35-mm imaging dish met een polymer coverslip (&micro;-Dish 35 mm, hoog)</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectoren; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td><td>Takara</td><td>6651</td><td></td></tr><tr><td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td><td>N.V.</td><td></td><td>We hebben IRES-puromycine-resistente cassette ingebracht in 3' UTR van TNNT2-locus en mCherry rond het stopcodon van ACTN2 in 610B1 hiPSC-lijn, volgens een methode die elders wordt beschreven (Anzai, Methods Mol Biol, in druk)</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serumvrij</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, minus insulin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50X), minus Vitamin A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase (25 U/&micro;L)</td><td>Merck Millipore</td><td>70746</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Fujifilm wako</td><td>029-18701</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4, Human, Recombinant,</td><td>R&amp;D Systems, Inc.</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-100g</td><td></td></tr><tr><td>C59, Wnt Antagonist (WntC59)</td><td>abcam</td><td>ab142216</td><td></td></tr><tr><td>CAD-tekeningsoftware,</td><td>Robert McNeel and Associates, WA, VS</td><td>Rhinoceros 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeer ultrafiltratie-eenheid (100k MWCO), Vivaspin-20</td><td>Sartorius</td><td>VS2042</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Chromium etchant</td><td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan</td><td>N14B</td><td></td></tr><tr><td>Chromium masker bedekt met AZP1350</td><td>Clean Surface Technology Co., Japan</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitatie Carrier (20mg/mL Glycogeen, 3 M Natriumacetaat (pH 5,2))</td><td>Takara</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium (DMEM) - hoge glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium (DMEM) - hoge glucose, zonder natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99,5)</td><td>Fujifilm wako</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Moregate</td><td>59301104</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10, Human, Recombinant,</td><td>R&amp;D Systems, Inc.</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor(basis), humaan, recombinant</td><td>Fujifilm wako</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine van varkenshuidpoeder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100g</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154-500</td><td></td></tr><tr><td>GLASBODEM kweekplaten</td><td>MatTek</td><td>P24G-1.5-13-F/H</td><td></td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-062</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-061</td><td></td></tr><tr><td>L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Ascorbinezuur natriumzout</td><td>Fujifilm wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-511 E8-fragment (LN511-E8, iMatrix-511)</td><td>Nippi</td><td>892012</td><td></td></tr><tr><td>Masker aligner</td><td>Union Optical Co., Ltd., Japan</td><td>PEM-800</td><td></td></tr><tr><td>Maskloos litografie-instrument</td><td>NanoSystem Solutions, Inc., Japan</td><td>D-Light DL-1000</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Spuitfiltereenheid, 0,45 &micro;m, PVDF (0,45-&micro;m filter)</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Myom2-RFP (SMM18)</td><td>N.V.</td><td></td><td>Ontwikkeld in ons vorige artikel (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 digitale CMOS-camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Sansei medical co. Ltd</td><td>01-004</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1)</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer</td><td>Dow Corning Corp., MI, VS</td><td>SILPOT 184</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleeniminee MAX (MW. 40.000)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>Positieve fotoresistontwikkelaar</td><td>Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan</td><td>NMD-3</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9034</td><td></td></tr><tr><td>Puromycine dihydrochloride</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-23153</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A-eiwit</td><td>R&amp;D Systems, Inc.</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant trypsine-achtig protease (rTrypsi

sarcomere verkorting van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met behulp van fluorescerende-tagged sarcomere eiwitten.

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (PSC-CMs) kunnen worden geproduceerd uit zowel embryonale als geïnduceerde pluripotente stamcellen (ES/iPS). Deze cellen bieden veelbelovende bronnen voor het modelleren van hartaandoeningen. Voor cardiomyopathieën is sarcomere verkorting een van de standaard fysiologische beoordelingen die worden gebruikt met volwassen cardiomyocyten om hun ziektefenotypes te onderzoeken. De beschikbare methoden zijn echter niet geschikt om de contractiliteit van PSC-CMs te beoordelen, aangezien deze cellen onderontwikkelde sarcomen hebben die onzichtbaar zijn onder fasecontrastmicroscopie. Om dit probleem aan te pakken en sarcomere verkorting uit te voeren met PSC-CMs, werden fluorescerende sarcomere-eiwitten en fluorescerende live-imaging gebruikt. Dunne Z-lijnen en een M-lijn bevinden zich aan beide uiteinden en het midden van een sarcomere, respectievelijk. Z-line eiwitten — α-Actinine (ACTN2), Telethonine (TCAP) en actine-geassocieerd LIM eiwit (PDLIM3) — en één M-lijn eiwit — Myomesin-2 (Myom2) — werden getagd met fluorescerende eiwitten. Deze gelabelde eiwitten kunnen worden uitgedrukt uit endogene allelen als knock-ins of uit adeno-geassocieerde virussen (AAV's). Hier introduceren we de methoden om muis- en menselijke pluripotente stamcellen te differentiëren in cardiomyocyten, om AAV's te produceren en om live-imaging uit te voeren en te analyseren. We beschrijven ook de methoden voor het produceren van polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels voor een patrooncultuur van PSC-CMs, wat de analyse van sarcomere verkorting met fluorescerende eiwitten vergemakkelijkt. Om de verkorting van sarcomen te beoordelen, werden time-lapse beelden van de kloppende cellen geregistreerd bij een hoge framerate (50-100 frames per seconde) onder elektrische stimulatie (0,5-1 Hz). Om de lengte van sarcomen in de loop van de celcontractie te analyseren, werden de opgenomen time-lapse-beelden onderworpen aan SarcOptiM, een plug-in voor ImageJ / Fiji. Onze strategie biedt een eenvoudig platform voor het onderzoeken van fenotypes van hartaandoeningen in PSC-CMs.

Het meten van sarcomere verkorting met behulp van knock-in PSC-CMs reporter lijnen. Psc-CMs met sarcomere-label werden gebruikt om de verkorting van sarcomen te meten. De lijnen drukken Myom2-RFP en ACTN2-mCherry uit van endogene loci. TagRFP werd ingevoegd in Myom2, codeert M-eiwitten die lokaliseren naar de M-lijn, terwijl mCherry werd ingeslagen in ACTN2, codering α-Actinine, die lokaliseert naar de Z-lijn18,<sup cl...

Deze methode kan worden gebruikt om sarcomere verkorting te onderzoeken met behulp van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met fluorescerende sarcomere-eiwitten.

Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Het is moeilijk om de sarcomerefunctie in de pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten te beoordelen vanwege hun onderontwikkelde en ongeorganiseerde sarcomere. Met fluorescerende sarcomere-eiwitten hebben we nu toegang tot sarcomere verkorting. We kunnen sarcomen visualiseren en hun functie in vitro beoordelen met behulp van stamcel-afgeleide cardiomyocyten en fluorescerende sarcomere-eiwitten.Met behulp van AAV-gebaseerde transductie kunnen we de methode uitbreiden naar alle door de patiënt afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze methode kan worden uitgebreid tot de ontwikkeling van cardiomyopathietherapie, omdat deze kan worden gebruikt om ziektegerelateerde sarcomeredisfunctie in vitro direct te beoordelen. Deze methode is nuttig op het gebied van cardiologie, inclusief pediatrische cardiologiestudie.Het kan echter ook worden toegepast op de studie van skeletspierdisfunctie, zoals myopathie. Op dag minus vier differentiatie-inductie, bedek een zesputplaat met 0,5 microgram per vierkante centimeter lag-511 E8 verdund in PBS voor een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Tegen het einde van de incubatie, behandel de door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met recombinante trypsine gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius.Wanneer de cellen zijn losgeraakt, oogst cellen tot gemiddeld aangevuld met 10% FBS om te tellen, en resuspend de cellen op een 1,25 keer 10 tot de vijfde cellen per twee milliliter AK02N medium aangevuld met lag-511 E8 en ROCK-remmer na centrifugeren. Aspireer vervolgens de coatingoplossing uit elke put van de zes-putplaat en zaai twee milliliter cellen in elke put. Breng de plaat terug naar de celkweek incubator.Na vier dagen bereiken de cellen tot 80% samenvloeiing. Vervang het supernatant in elke put door twee milliliter RPMI plus B27 zonder insulinemedium aangevuld met GSK-3-remmer per put om de differentiatie te induceren. Vervang na twee dagen differentiatie het medium voorzichtig door twee milliliter RPMI plus B27 zonder insulinemedium aangevuld met stekelvarkenremmer per put.De cellen moeten 100% samenvloeiing hebben bereikt. Vervang op dag vier van differentiatie de supernatanten voorzichtig door twee milliliter RPMI plus B27 zonder insuline per put. De cellen moeten op een hoge dichtheid blijven, en sommige kunnen zijn begonnen te zweven.Vervang op dag zeven en negen van differentiatie het supernatant in elke put door twee milliliter RPMI plus B27 door insuline aangevuld met puromycine voor selectieve pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytencultuur. Op dit punt moeten kloppende cellen in de culturen worden waargenomen. Om een pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytcultuur met patroon op te zetten, gebruikt u eerst hersteltape om stof van het oppervlak van een op maat gemaakte PDMS-stempel te verwijderen en dompelt u de stempel kort onder in 70% ethanol.Gebruik een luchtdoek om de ethanol van het stempeloppervlak te verwijderen en behandel het oppervlak met vijf tot 10 microliter 0,5% MPC polymeer en ethanol. Wanneer het polymeer volledig is opgedroogd, plaatst u de stempel op een polymeerafdekkingslip in een beeldvormingsschaal van 35 millimeter en plaatst u een gewicht op de stempel. Gebruik na 10 minuten een lichtmicroscoop om te bevestigen dat het patroon op de afdeklip is overgebracht en was de schaal en de afdeklip twee keer met PBS.Bedek na de tweede wasbeurt de afdeklip met 0,5 tot 1 microgram per vierkante centimeter lag-511 E8 verdund in 0,1% gelatine voor een incubatie van twee tot vier uur bij kamertemperatuur. Was de cellen op dag 10 van differentiatie twee keer met PBS, gevolgd door behandeling met één milliliter recombinante trypsine per put gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Na het tellen, resuspend de cellen bij een 2,5 tot vijf keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter RPMI plus B27 met insuline aangevuld met puromycine concentratie, en zaad een milliliter cellen op de plaat voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius.Vervang de volgende ochtend het supernatant door verse RPMI plus B27 door insuline aangevuld met puromycine en breng de cellen terug naar de celkweek-incubator, waarbij het medium twee tot drie keer per week wordt vernieuwd tot dag 21 tot 28 voor beeldvorming. Voor time-lapse beeldvorming van de sarcomere verkorting in de PCCSM-culturen, breng olie aan op de 100 keer objectieve lens van een fluorescerende confocale microscoop en selecteer live beeldvormingsomstandigheden in de bijbehorende software. Als u goede representatieve gegevens wilt verkrijgen, selecteert u de hoogste framesnelheid, stelt u de sluiter in op openen en past u een binning van vier bij vier toe in een uitsnede van het verwervingsgebied om de kortste intervallen tussen afbeeldingen te bereiken tijdens de time-lapse-beeldvorming.Als de slagsnelheid van de cellen laag is, roep de cellen dan op door elektrische veldstimulatie en start de time-lapse-opname, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het afgebeelde veld scherp blijft tijdens de beeldvorming. Sla aan het einde van de beeldperiode de timelapse-afbeeldingen op in een geschikte map. Om de time-lapse beelden te analyseren, opent u een reeks time-lapse beelden in ImageJ en past u de helderheid en het contrast van de beelden aan totdat het sarcomere patroon duidelijk kan worden waargenomen.Selecteer in het menu Meer gereedschappen SarcOptiM en druk op Control Shift P en de knop van één micron op de werkbalk om de instructies te gebruiken om het programma te kalibreren. Teken vervolgens een lijn over het gebied van de sarcomere die moet worden gebruikt om de sarcomereverkorting te meten en klik op Single Cell AVI om de sarcomere verkortingsanalyse te starten. Time-lapse beeldvorming van sarcomere-gelabelde, gemodelleerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten kan worden gebruikt om sarcomere verkorting op verschillende tijdstippen te meten.Om de sarcomere-desorganisatie te overwinnen die meestal wordt waargenomen in pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenculturen met patronen, kunnen specifieke PDMS-stempels worden gebruikt om pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met een patroon te gekweekt in een streeppatroon, wat een langwerpige celvorm en een meer georganiseerd sarcomerepatroon bevordert in vergelijking met cellen die in een niet-patroongebied zijn gekweekt. Patroonculturen bevorderen ook een betere celcontractie en bieden een glad sarcoomlengteprofiel in vergelijking met niet-patroon gekweekte cellen. AAV-getransduceerde patroon pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten drukken sarctische GFP-signalen uit langs de gemodelleerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten al drie dagen na transductie en kunnen ook worden gebruikt om sarcerecontractieprofielen te meten.Verder kan de toevoeging van blasticidin-resistent gen tijdens transductie ook worden gebruikt om de selectie van pluripotente stamcellen met patronen te vergemakkelijken tot een zuiverheid van meer dan 90%Om een gemakkelijkere en hoogwaardigere beeldanalyse mogelijk te maken, is het essentieel om een gebied te identificeren met sarcomen die lineair bewegen en om afbeeldingen te verkrijgen met de hoogste framesnelheid. Met behulp van deze methode kunnen we de rol van rijping in sarcoomeiwitten beoordelen om sarcomeredisfunctie in lab cardiomyocyten te bestuderen die zijn afgeleid van ziektespecifieke, patiënt-afgeleide iPS-cellen.

sarcomere-shortening-pluripotent-stem-cell-derived-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

Mutaties die leiden tot aangeboren hartafwijkingen profiteren van in vivo onderzoek van de hartstructuur tijdens de ontwikkeling, maar hoogwaardige structurele studies in het embryonale muishart zijn technisch uitdagend. Hier presenteren we een robuuste immunofluorescentie- en beeldanalysemethode om cardiomyocyt-specifieke structuren in het zich ontwikkelende muishart te beoordelen.

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Recycling van intracellulair calcium speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes. Hier beschrijven we een protocol om te evalueren van sarcoplasmic reticulum Ca2 + reserve en diastolische calcium functie voor het verwijderen in cardiomyocytes door een calcium imaging systeem.

Beoordeling van Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve en intracellulaire diastolische Calcium verwijdering in geïsoleerde ventriculaire Cardiomyocytes

Hier presenteren we een methode om optisch beeld actie potentieel, specifiek in ventriculaire-achtige geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige cardiomyocytes. De methode is gebaseerd op de promotor-gedreven uitdrukking van een spanning-gevoelige fluorescent proteïne.

Subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire Cardiomyocytes

De vorming van een goed sarcomerenetwerk is belangrijk voor de rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een super resolutie-gebaseerde aanpak die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve evaluatie van de structurele rijping van stamcel afgeleide cardiomyocyten, ter verbetering van de cultuuromstandigheden ter bevordering van de ontwikkeling van het hart.

Analyseren van de α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocyten Using Single Molecule Localization Microscopy

Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Hier wordt een gevestigde methode beschreven om contractiliteits- en calciummetingen uit te voeren in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met behulp van een op optica gebaseerd platform. Dit platform stelt onderzoekers in staat om het effect van mutaties en de reactie op verschillende stimuli op een snelle en reproduceerbare manier te bestuderen.

Real-time metingen van calcium- en contractiliteitsparameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Leer sarcomer verkorting meten in pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met fluorescent-gelabelde sarcomere eiwitten. Deze methode visualiseert sarcomerfunctie in vitro voor cardiomyopathie onderzoek.

Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.

Meer video's verkennen