Gebruik van het GAL4-UAS-systeem voor functionele genetica in Anopheles gambiae

Het bipartiete GAL4-UAS systeem is een veelzijdig hulpmiddel voor functionele genetische analyse in Anopheles gambiae door genetische modificatie van genexpressie op een spatiotemporale gecontroleerde manier. Het binaire systeem maakt flexibiliteit mogelijk in experimentele benaderingen voor fenotypische karakterisering van transgenexpressie, zelfs als ernstige fitnesskosten worden geïnduceerd. Dit systeem kan worden gebruikt voor fenotypische karakterisering van genen die mogelijk betrokken zijn bij insecticideresistentie, overdracht van pathogenen of genen die worden gebruikt in genetische controlemethoden.

Fraser Coleman, een onderzoekstechnicus, zal helpen deze procedure te demonstreren Begin met het verzamelen van poppen met behulp van een plastic Pasteur-pipet van drie milliliter met het uiteinde afgesneden op een heldere platte schotel die geschikt is voor gebruik met een stereomicroscoop. Verwijder voorzichtig het grootste deel van het water rond de poppen. Zet de tl-lamp aan en laat deze opwarmen.

Overweeg de kleurspatiotemporale patronen van een expressie en verhouding van verschillende fenotypen die worden verwacht bij het screenen op fluorescerende marker. Selecteer het gewenste filter op de fluorescentieseeroscoop en controleer of er een gekleurde lichtstraal zichtbaar is die op het midden van de podiumplaat is gericht. Centreer de poppen onder wit licht in het gezichtsveld en breng ze in beeld.

Schakel het witte licht uit en gebruik de fijne focus om het gebied van de poppen met het fenotype van belang met een zichtbaar fluorescerend patroon in beeld te brengen. Gebruik een fijne detailleringskwast om de poppen voorzichtig te draaien en de anale peddels te bewegen, zodat de uitwendige genitaliën kunnen worden geïdentificeerd. Afzonderlijke poppen op basis van onderscheidende uitwendige genitaliën.

Mannetjes hebben een lange buis die uit het laatste dorsale segment ongeveer de helft van de lengte van de anale peddels extrudeert. De uitwendige genitaliën van vrouwelijke poppen zijn aanzienlijk korter en splitsen zich. Scheid de gesekste poppen in groepen van 10 of minder in heldere buizen van 20 milliliter met water en sluit de buizen af met een bolletje watten.

Zuig het gewenste aantal mannelijke en vrouwelijke volwassenen uit de buizen in een kooi of kleine emmer, zorg ervoor dat de volwassenen tijdens deze overdracht niet worden beschadigd. Houd het kruis vijf tot zeven dagen vast voordat het bloed wordt gevoed. De volgende dag kunnen eieren worden verzameld om de ontwikkeling van het embryo te bestuderen.

Monteer de ovipositiekamer en introduceer er voorzichtig 10 tot 15 bloedgevoede vrouwtjes in. Bedek de ovipositiekamer en laat 20 minuten staan. Maak de polypropyleenbuis van 50 milliliter voorzichtig los van de ovipositiepot en zorg ervoor dat de muggen niet vrijkomen.

Bedek de pot en laat eieren rijpen tot het ontwikkelingsstadium van belang. Pak eieren uit de pot met een fijne detailleringskwast en leg ze op water in een uitgegraven glazen blok van 40 vierkante millimeter. Verwijder voorzichtig het water uit het glazen blok met een micropipette en dek de eieren af met 500 microliter FAA.

Oscilleer zachtjes op orbitale shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Spoel de eieren 15 keer grondig met gedestilleerd water om alle sporen van FAA-oplossing te verwijderen. Gebruik een micropipette van 1000 microliter en verwijder vervolgens één milliliter gedestilleerd water per keer en zorg ervoor dat de eieren daarbij niet worden beschadigd.

Bedek de vaste eieren met één milliliter Trpis-oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Eieren zullen na vijf minuten incubatie bleke vlekken beginnen te ontwikkelen en uiteindelijk een melkwitte kleur bereiken zodra ze zijn opgeruimd. Spoel de eieren 15 keer grondig met gedestilleerd water om alle sporen van Trpis-oplossing te verwijderen.

De expressie van fluorescerende markers aangedreven door de 3xP3 promotor wordt waargenomen in de ogen en ventrale ganglia van Anopheles gambiae poppen. Het gebruik van verschillende gekleurde fluorescerende markers maakt de selectie en screening van gemodificeerde personen met verschillende GAL4- en UAS-componenten mogelijk. Bij het werken met een bipartiet GAL4-UAS-systeem is het noodzakelijk om mannetjes en vrouwtjes van verschillende stammen te kruisen om nakomelingen te verwerven die zowel de GAL4- als de UAS-componenten dragen.

De differentiële morfologie waargenomen bij mannelijke en vrouwelijke uitwendige genitaliën van poppen wordt gebruikt voor seksing. Een voorbeeld van een niet-identificeerbare pop wordt hier uitgelicht. Verwijdering van al het water uit poppen, zoals rechts wordt getoond, verhoogt de seksingsmoeilijkheden omdat anale peddels de visualisatie van genitaliën verduisteren.

Het bipartiete GAL4-UAS-systeem maakt modificatie van genexpressie op een gecontroleerde spatiotemporele manier mogelijk. Dit kan worden gevisualiseerd door de eicel en alomtegenwoordige GAL4 vier uitdrukkende driverlijnen te kruisen met de responderlijn UAS-mCherry. Een belangrijk voordeel van het gebruik van een bipartiet GAL4-UAS-systeem is het gemak van het bestuderen van dodelijke fenotypen, zelfs in het embryonale stadium.

Om dit te doen, is het noodzakelijk om de interne morfologie van de embryo's te visualiseren. De normale morfologische kenmerken waargenomen in verschillende stadia van embryonale ontwikkeling op 12, 24 en 36 uur na het leggen kunnen worden gezien na voltooiing van het embryo-clearingprotocol. Het is van vitaal belang tijdens deze procedure dat poppen en eieren niet mogen uitdrogen.

Daarom is het belangrijk om snel te werken bij het verwijderen van vloeistoffen. De GAL4-UAS-methode heeft ons in staat gesteld om genen die betrokken zijn bij insecticideresistentie en die met potentiële toepassingen in gene drive control-methoden functioneel te karakteriseren.