Site-Directed φC31-gemedieerde integratie en cassette-uitwisseling in Anopheles Vectors of Malaria

Dit protocol ondersteunt de karakterisering van de rol van muggengenen die betrokken zijn bij een verscheidenheid aan fysiologische routes, waaronder bijvoorbeeld insectenresistentie en de ontwikkeling van malariaparasieten. De methode drijft transgene insertie in enkele vooraf gegekarakteriseerde locaties en maakt het daarom mogelijk om fenotypes die het gevolg zijn van alternatieve transgenen direct te vergelijken, waardoor het probleem van positioneel effect effectief wordt vermeden. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid aan insectensoorten van volksgezondheid en agrarisch belang en de toepassingen ervan strekken zich uit van bacteriën tot zoogdiercellen.

Begin met het ontwerpen van attB-donorplasmiden met de dominante fluorescerende marker, attB-recombinatieplaatsen en de gewenste transgene lading. Gebruik een enkele attB-site voor de integratie van het hele plasmide dat de transgene cassette draagt of twee omgekeerde attB-locaties voor cassette-uitwisseling. Zuiver donor- en helperplasmiden met behulp van een endotoxinevrije zuiveringskit.

Combineer het attB-gelabelde donorplasmide dat het transgen van belang draagt en het helperplasmide dat het integrase draagt om een mix te verkrijgen met een uiteindelijke concentratie van 350 nanogram per microliter van het donorplasmide en 150 nanogram per microliter van het helperplasmide. Precipiteer het DNA door 0,1 volume van drie molaire natriumacetaat en 2,5 volumes ijskoude 100% ethanol toe te voegen, en vervolgens vortex. Een wit neerslag moet onmiddellijk zichtbaar zijn.

Was de pellet en resuspend in injectiebuffer om een totale eindconcentratie van 500 nanogram per microliter te bereiken. Bereid vervolgens aliquots van elk 10-15 microliter en bewaar ze bij negatieve 20 graden Celsius. Bloed voedt vier tot zeven dagen oude muggen van de gewenste dockinglijn en hun wilde tegenhangers 72 uur voorafgaand aan micro-injectie.

Voer Anopheles gambiae embryo micro-injecties uit in 25 millimolair natriumchloride door de achterste pool van het embryo in een hoek van 45 graden te richten. Voer Anopheles stephensi embryo-micro-injecties uit in halocarbon-olie door de achterste pool in een hoek van 30 graden te richten. Breng de eieren onmiddellijk na injectie over in een petrischaal gevuld met steriel gedestilleerd water en breng ze terug naar insectenachtige omstandigheden.

Breng bij het uitkomen de G0-larve dagelijks over in een bak met gezouten gedestilleerd water en breng de poppen terug. Sorteer G0-poppen op geslacht onder een stereoscoop. Laat de mannetjes in aparte kooien in groepen van drie tot vijf tevoorschijn komen en voeg een tienvoudige overmaat aan leeftijdsgematchte wilde type vrouwtjes toe.

Laat de vrouwtjes in aparte kooien tevoorschijn komen in groepen van 10 tot 15 en voeg een gelijk aantal leeftijdsgematchte wilde type mannetjes toe. Laat volwassenen vier tot vijf dagen paren en voorzie vrouwtjes van een bloedmaaltijd. Verzamel de eieren en fok opkomende G1's van de volgende generatie.

Verzamel G1-, L3- en L4-larven in een petrischaaltje bekleed met nat filterpapier of op een microscoopglaasje en screen ze met een fluorescerende stereoscoop op de aanwezigheid van de marker die is geïntroduceerd met de attB-gelabelde lading. Voor enkele attB-ontwerpen, scherm voor de aanwezigheid van de nieuwe en reeds bestaande marker. Voor dubbele attB-ontwerpen voor cassette-uitwisseling, scherm voor de aanwezigheid van de nieuwe marker en het verlies van de reeds bestaande marker.

Sorteer getransformeerde G1-poppen op geslacht en kruis ze massaal met leeftijdsgematchte individuen van het andere geslacht. Laat volwassenen vier tot vijf dagen paren en zorg voor een bloedmaaltijd. Verzamel voor enkelvoudige integratie-experimenten eieren rechtstreeks van het en masse kruis.

Verzamel voor cassette-uitwisselingsexperimenten eieren van enkele vrouwtjes en houd nakomelingen gescheiden totdat de moleculaire beoordeling is voltooid vanwege de mogelijke aanwezigheid van twee alternatieve cassetteoriëntaties. Screen het G2-nageslacht op de aanwezigheid van de fluorescerende marker en zet een subset van G2-positieve individuen opzij voor moleculaire analyse. Breng de rest terug naar volwassenheid.

Voer moleculaire validatie uit van de invoegplaatsen met PCR zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voor enkele integratie moet u ervoor zorgen dat de voorspelde insertieplaats de oorspronkelijke dockingconstructie draagt, plus de hele volgorde van het donorplasmide tussen de twee hybride locaties attL en attR. Zorg er voor cassette-uitwisseling voor dat de voorspelde invoegplaats identiek is aan die van de dockinglijn, waar hybride omgekeerde attL-sites de oorspronkelijke omgekeerde attP-sites vervangen en de uitwisselingssjabloon de cassette vervangt die er oorspronkelijk tussen aanwezig was.

Het protocol werd gebruikt om een stabiele Anopheles transgene lijn te genereren in ongeveer 10 weken. Fenotypische validatie van transformatie werd uitgevoerd door screening op fluorescerende markers gereguleerd door de 3xP3-promotor worden hier getoond. Een nieuwe Anopheles stephensi-lijn werd verkregen door het inbrengen van een DS-rood gemarkeerde cassette in een dockinglijn gemarkeerd met CFP, wat resulteerde in G1-nakomelingen die beide markers uitdrukten zoals aangegeven door de rode en blauwe fluorescentie in de ogen.

Cassette-uitwisselingsontwerpen resulteren in de vervanging van de marker die oorspronkelijk in de dockinglijn is ingebracht door die van het donorplasmide. Deze markeruitwisseling werd gedemonstreerd in een Anopheles gambiae docking lijn waar de CFP marker verloren ging en de YFP marker werd verkregen wat resulteerde in gele oog- en zenuwstrengfluorescentie. Af en toe kan RMCE resulteren in een enkele integratiegebeurtenis in plaats van de uitwisseling van de gewenste transgene cassette waarbij een larve wordt gemarkeerd met zowel het oorspronkelijke GVB als de nieuwe YFP-markers.

Bij het screenen op de aanwezigheid van een fluorescerende marker is het cruciaal om het signaal te onderscheiden van mogelijke autofluorescentie op de achtergrond. Het verhogen van de vergroting en het focussen op de weefsels en organen waar fluorescentie naar verwachting door de promotor zal worden aangedreven, is noodzakelijk om echte CFP-positieve individuen te identificeren. Individuele transformanten werden ook moleculair beoordeeld via PCR om de verwachte insertieplaats te bevestigen.

PCR validatie bij personen uit een exchange Anopheles gambiae lijn wordt hier getoond. Zelfs de juiste micro-injectietechniek, het nauwkeurige ontwerp en de voorbereiding van de donor- en helperplasmiden, evenals het volgen van het juiste muggenteeltschema zijn de sleutel tot het verkrijgen van transgene personen. Deze procedure kan worden gebruikt om elementen in te voegen die genoverexpressie of -uitschakeling veroorzaken, bijvoorbeeld het GAL4 / UAS-systeem, evenals gene drive-elementen en antipathogene moleculen voor genetische controle van muggen.