4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Ons begrip van oogmorfogenese komt van eerdere onderzoeken naar vast weefsel. Deze studies misten echter cel- en weefseldynamiek. Met behulp van time-lapse imaging kunnen we dit hele proces vastleggen voor visualisatie en analyse.

Onze methode die profiteert van de externe ontwikkeling in optische helderheid van zebravisembryo's, die live beeldvorming vergemakkelijken, en maakt gebruik van laserscanning confocale microscopie die gemakkelijk beschikbaar is op de meeste onderzoekscampussen. Onderzoekers die nieuw zijn in deze methode moeten wat vallen en opstaan verwachten voordat ze een bruikbare dataset verkrijgen. Veel stappen, vooral de injecties en inbedding, moeten goed gaan om succes te behalen, dus heb geduld.

Zodra de zebravis begint te broeden, terwijl hij 15 tot 20 minuten wacht om ervoor te zorgen dat de eieren bevrucht worden, gebruik dan een P10 pipet en P10 microlitertips om een getrokken glazen capillaire micro-injectienaald met 2,5 tot 5 microliter van de RNA-verdunning van belang te laden. Wanneer de eieren klaar zijn, gebruik dan een transferpipet en een ontleedmicroscoop om de eieren voorzichtig in de spuitgietmatrijs te laden, met behulp van een tang om de embryo's zo te rollen dat de enkele cel zo nodig zichtbaar is. Injecteer vervolgens alle embryo's in het stadium van één cel, gericht op de cel en niet op de dooier om een uniforme etikettering van het zich ontwikkelende embryo te garanderen.

Plaats na ongeveer 11 uur na de bevruchting een aliquot van één tot vijf milliliter van 1,6% lage smeltagarose in E3-medium in een hitteblok van 42 graden Celsius en gebruik een fluorescentiemicroscoop om te screenen op met succes geïnjecteerde embryo's met een algehele helderheid van florescentie. Tel de somieten om de embryo's goed in scène te zet. Na 11 uur na de bevruchting moeten drie somieten worden waargenomen.

Een ideaal monster zal sterke EGFP- en mCherry-signalen hebben en zich in de juiste ontwikkelingsfase bevinden. Plaats de embryo's vóór de montage in een met agar beklede schaal en gebruik een tang om het koraal uit elk embryo te verwijderen. Wanneer alle embryo's zijn ontnauwd, gebruikt u een glazen rolpipet om één embryo te aspireren.

Gooi zoveel mogelijk E3 uit zodat het embryo aan de punt van de glazen Pasteur pipet zit en laat het embryo uit het hitteblok in de buis van agarose vallen. Laat de embryo's een paar seconden in de agarose zinken voordat ze samen met het embryo een klein volume agarose aspireren, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het embryo aan de punt van de pipet blijft. Gooi het embryo en de agarose uit in een agarosedruppel in een glazen bodemschaal en gebruik snel maar voorzichtig een tang om de dorsale kant van het embryo naar beneden te oriënteren voordat de agarosedruppel uithardt.

Voeg na het monteren van 10 tot 12 embryo's op dezelfde manier voldoende agarose toe om de bodem van de schaal volledig te bedekken en alle druppels in één agaroseschijf te omhullen. Wanneer de agarose is uitgehard, laag E3 over de agarose om de monsters gehydrateerd te houden. Nadat u de confocale microscoop voor het scannen van de laser hebt ingesteld op de juiste parameters voor timelapse-beeldvorming, bedekt u de onderkant van de glazen bodemschaal royaal met een onderdompelingsmedium dat overeenkomt met de brekingsindex van water, waarbij u ervoor zorgt dat luchtbellen worden vermeden en een kleine druppel dompelmedium op het 40X-waterdoel wordt toegepast.

Zet de glazen bodemschaal vast in de stage insert en voeg extra E3 medium toe om de embryo's 's nachts vochtig te houden. Gebruik modelleerklei om het plastic deksel over de schaal af te dichten en het doel te verhogen om contact te maken met de schaal. Klik onder de positiekop van de microscoopsoftware op toevoegen om de XYZ-informatie van het eerste monster op te slaan en selecteer een monster met een sterke fluorescentie en optimale montage.

Zoek onder het tabblad Zoeken naar het volgende voorbeeld en klik op positie en voeg toe om het voorbeeld te selecteren zoals gedemonstreerd. Wanneer alle voorbeelden zijn geselecteerd, markeert u de eerste positie en klikt u op verplaatsen naar. Terwijl u continu scant, lijnt u het optische blaasje in het frame op, waardoor er voldoende ruimte overblijft in de voorste en distale regio's ten opzichte van het optische blaasje en de hersenen.

Als u de eerste en laatste Z-slices wilt toewijzen, selecteert u eerst instellen en als laatste instellen terwijl u door de Z-richting beweegt met de fijne scherpstelknop, waarbij een totaal segmentaantal van ongeveer 63 wordt gehandhaafd om de groei van de optische beker op te vangen. Voeg extra ruimte toe aan de ventrale kant van het optische blaasje om ruimte te maken voor groei. Zodra de eerste en laatste Z-segmenten zijn ingesteld, klikt u op C om naar het midden van de Z-stack te gaan en past u het laservermogen en de versterking voor beide lasers aan.

Wanneer de laservoeding en -versterking zijn ingesteld, stopt u het scannen en klikt u op bijwerken om de positiegegevens bij te werken. Als u naar de volgende positie wilt gaan, klikt u op positie twee. Zodra zowel de eerste als de laatste Z-segmenten zijn gedefinieerd zoals gedemonstreerd, opent u de tijdreekskop en stelt u het aantal cycli in op 300 en het tijdsinterval op 2,5 minuten.

Nadat u de instellingen hebt gecontroleerd om ervoor te zorgen dat alles is voltooid, klikt u op start om de time-lapse te starten en te bevestigen dat de eerste beeldronde correct is vastgelegd voordat de time-lapse 's nachts wordt uitgevoerd. Directe injectie in de enkele cel is noodzakelijk voor een uniforme etikettering en een robuuste fluorescentie. Bij hun onderdompeling in agarose moeten de embryo's gelijkmatig door het gerecht worden verdeeld.

Als de embryo's correct, voldoende fluorescerend en adequaat zijn gemonteerd, blijven ze tijdens de time-lapse in het beeldvormingskader, waardoor het hele orgaan kan worden afgebeeld. Monsters die niet langs de dorsale as zijn gericht, zoals monsters die horizontaal of diagonaal zijn, zullen uit het beeldvormingskader groeien naarmate de time-lapse vordert en kunnen niet worden gebruikt voor verdere analyse. Een embryo dat te veel gedraaid is, zal resulteren in een meer posterieure time-lapse.

Een embryo dat ondergedraaid is, maakt het mogelijk om alleen het meest voorste weefsel waar te nemen. Bovendien hebben monsters die zijn gemonteerd met betrekking tot de oriëntatie van het frame meer kans op een succesvolle time-lapse. Deze bias naar de ventrale kant biedt extra ruimte voor weefselgroei in de ventrale richting wat resulteert in een optimale time-lapse.

Wanneer niet aan deze criteria wordt voldaan, zal de time-lapse niet langer het volledige 3D-volume van het weefsel opvangen terwijl het zich ontwikkelt en kan het niet worden gebruikt voor verdere analyse. Deze informatierijke datasets kunnen op vele manieren worden geanalyseerd, waaronder 4D-celtracking met celsnelheid en trajectkwantificeringen, cel- en weefselvolumemetingen en 3- en 4D-visualisaties.