Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten
4 februari 2021
Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.
Dit protocol kan worden gebruikt om niet-spier myosine dynamiek op eiwitniveau te karakteriseren, die de beweeglijke eigenschappen kan informeren die bijdragen aan hun rol in cellen. Dit is een snelle, reproduceerbare en zeer gecontroleerde methode die kan worden gebruikt om de effecten van verschillende regulerende omstandigheden op de beweeglijkheid van myosine te bestuderen en hun cellulaire gedrag te informeren. Deze technieken kunnen worden gebruikt om te onderzoeken hoe ziekteverwekkende mutaties in niet-spier myosines hun gedrag op het niveau van één molecuul en ensemble beïnvloeden.
De algemene benadering van de methodologie kan worden toegepast op verschillende andere cytoskeletsystemen, zoals de karakterisering van gezuiverde kinesines en dyneins met microtubuli. De veelzijdigheid van dit protocol kan vragen oproepen over welke fluoroforen en chemische omstandigheden het meest geschikt zijn, maar de methode kan relatief snel worden geoptimaliseerd. Het begrijpen hoe de stromingskamers moeten worden opgezet en bekleed, zorgt voor een sterke basis waarop men zich kan aanpassen aan verschillende omstandigheden voor deze experimenten.
Bereid om te beginnen een nitrocelluloseoplossing van één procent in amylacetaat en plaats een cirkelvormig filterpapier met een diameter van 125 millimeter op de bodem van een weefselkweekplaat. Plaats acht vierkante afdekslips op een rek en was ze grondig met ongeveer twee tot vijf milliliter 200-proof ethanol, gevolgd door twee tot vijf milliliter gedestilleerd water. Rijd vervolgens de afdekstrips volledig met behulp van een gefilterde luchtleiding of stikstofleiding.
Pipetteer langzaam 10 microliter nitrocelluloseoplossing van één procent langs één rand van één afdekstrook. Smeer het over de rest van de afdekslip met behulp van de zijkant van een pipetpunt van 200 microliter in één vloeiende beweging. Plaats vervolgens deze afdeklip op de weefselkweekschaal met de nitrocellulosezijde naar boven.
Herhaal dit voor de resterende afdekstrips en laat ze drogen. Veeg een microscoopschuif af met een optisch lenspapier om groot vuil te verwijderen. Snijd twee stukken dubbelzijdige tape, ongeveer twee centimeter lang, en plaats een stuk langs het midden van de lange rand van de microscoopschuif.
Plaats het tweede stuk tape ongeveer twee millimeter onder het eerste stuk tape, zodat de twee parallel lopen en een stromingskamer creëren die ongeveer 10 microliter oplossing kan bevatten. Plak voorzichtig een van de nitrocellulose hoezen op de tape zodat de met nitrocellulose bedekte zijde direct contact maakt met de tape. Druk met behulp van een pipettip voorzichtig op de interface van de schuiftape om ervoor te zorgen dat de afdekstrook goed aan de schuif is vastgespecht.
Snijd vervolgens de overtollige tape die over de rand van de glijbaan hangt met een scheermesje. Bereid de oplossingen voor Myosin 5a voor en houd ze op ijs. Vloei in 10 microliters van de Myosin 5a door de schuifstroomkamer en wacht een minuut.
Vervolgens stroom in 10 microliter van een milligram per milliliter BSA in motiliteit buffer met DTT. Herhaal dit twee keer en wacht een minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten lopen door de hoek van het papier voorzichtig bij de uitgang van de stromingskamer te plaatsen.
Was vervolgens met 10 microliter motiliteitsbuffer met DTT. Pipetteer de zwarte actineoplossing met een spuit van één milliliter en een naald van 27 gauge om de actinefilamenten te scheren voordat u die oplossing in de kamer introduceert. Voeg de zwarte actine toe aan de kamer in aanwezigheid van één millimolar ATP in 50 millimolar MB met één millimolar DTT.
Voer vervolgens 50 microliter motility buffer in met DTT en een millimolar ATP om de kamer van vrije actinefilamenten uit te putten. Was drie keer met 10 microliter motiliteitsbuffer met DTT om de kamer van een ATP uit te putten. Debiet in 10 microliters van 20 nanomolar RH-actineoplossing met motiliteitsbuffer met DTT en wacht een minuut om rigorbinding van actinefilamenten aan de Myosin 5a aan het oppervlak van de afdekslip mogelijk te maken.
Was met 10 microliter 50 millimolar motility buffer met DTT tweemaal om ongebonden RH actine filamenten te verwijderen. Stroom in 30 microliter eindbuffer. Neem beelden op een fluorescentiemicroscoop op met behulp van een excitatiegolflengte van 561 nanometer om de RH-actine te visualiseren.
Bereid de oplossingen voor Myosin 5a omgekeerde motiliteitstest voor en houd ze op ijs. Was ze kamer met 10 microliter motiliteit buffer met DTT. Stroom in 10 microliter van een milligram per milliliter BSA in motiliteit buffer met DTT.
Herhaal dit twee keer en wacht een minuut na de derde wasbeurt. Gebruik tissue- of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten lopen door de hoek van het papier voorzichtig bij de uitgang van de stromingskamer te plaatsen. Was vervolgens de kamer drie keer met 10 microliters motiliteitsbuffer met DTT.
De stroom in 10 microliters van de NeutrAvidin-oplossing in motiliteitsbuffer met DTT en wacht een minuut. Was vervolgens drie keer met 10 microliters van die oplossing. Stroom in 10 microliters BRH actine met motiliteitsbuffer met DTT met behulp van een grote verveelde pipettip.
En wacht even. Was vervolgens drie keer met 10 microliter motiliteitsbuffer met DTT. Stroom in 30 microliter eindbuffer met 10 nanomolar Myosin 5a.
En laad onmiddellijk op de totale interne reflectiefluorescentiemicroscoop. Begin met opnemen zodra de optimale focus voor TIRF-beeldvorming is gevonden. De zuivering van niet-spier Myosine 2b, essentiële lichtketens en regulerende lichtketens, evenals de Myosin 5a en calmodulin werd geëvalueerd door het uitvoeren van SDS-PAGE.
De glijdende actine filament assay toont de kenmerken van een ideale en traceerbare film met vloeiende bewegingen van gelabelde actine filamenten. De zwarte actinewas zorgde ervoor dat de dode myosinekoppen uit het meetveld werden verwijderd, wat verder bijdroeg aan de algehele soepele beweging van de actinefilamenten. Filament tracking output beelden van het fast track programma werden verkregen voor niet-spier Myosin 2b en Myosin 5a.
Een representatief histogram toont aan dat de Actomyosine 2b glijsnelheid 77 nanometer per seconde is. En die van Actomyosin 5a is 515 nanometer per seconde. Bij afwezigheid van methylcellulose blijven de actinefilamenten niet zo nauw verbonden met het met myosine bedekte oppervlak, waardoor het dicht bij het oppervlak van de niet-spier Myosin 2b-gecoate afdekstrips klapt.
Myosinebeweging werd waargenomen bij aan de oppervlakte vastgebonden fluorescerende actinefilamenten met behulp van de omgekeerde motiliteitstest. Het is belangrijk om de ongelabelde actine te scheren voordat u deze in de stroomcel brengt voor de zwarte actinewas, waardoor de translocatie van actine soepel verloopt. Aanvullende experimenten kunnen onderzoeken hoe myosinemotiliteit wordt beïnvloed door myosinemutaties, belastingsinducerende eiwitten, ionische sterkte en regulerende eiwitten.
Verschillende cellulaire aandoeningen kunnen worden gereconstitueerd voor toekomstige studies. Deze methoden maken het mogelijk om biochemisch en biofysisch onderzoek te doen naar hoe verschillende myosine-isovormen variëren in hun beweeglijke en mechanische eigenschappen op het niveau van één molecuul en ensemble.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft in detail de expressie en zuivering van myosin 5a, gevolgd door de karakterisering ervan met behulp van in vitro fluorescentiemicroscopie-assays. Daarnaast worden aanpassingen besproken voor het bestuderen van niet-spier myosin 2b.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Myosines spelen een cruciale rol bij de cellulaire motiliteit.
- Het begrijpen van de dynamiek van myosine is essentieel voor het verduidelijken van hun functies in cellen.
- Niet-spiermyosines zijn betrokken bij diverse cellulaire processen.
- Karakteriseringstechnieken kunnen de impact van mutaties op het gedrag van myosine onthullen.
Doel van de studie
- Om de dynamiek van niet-spiermyosine op eiwitniveau te karakteriseren.
- Om inzicht te verschaffen in de beweeglijkheidseigenschappen die bijdragen aan cellulaire functies.
- Om de effecten van regulerende condities op de myosinemobiliteit te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Ensemble- en single-molecule fluorescentiemicroscopie.
- Karakterisering van gezuiverde myosines.
- Optimalisatie van fluoroforen en chemische condities.
- Opstelling en coating van flowkamers voor experimenten.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol is snel, reproduceerbaar en zeer gecontroleerd.
- Het maakt de studie van ziekteverwekkende mutaties in niet-spiermyosines mogelijk.
- Veelzijdige methodologie die toepasbaar is op andere cytoskeletsystemen.
- Snelle optimalisatie voor diverse experimentele condities.
Conclusies
- Het begrijpen van myosine-dynamiek vergroot de kennis over cellulaire processen.
- Deze methode biedt een solide basis voor toekomstige studies.
- Het roept belangrijke vragen op met betrekking tot de functie van myosine bij gezondheid en ziekte.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt een kwantitatieve karakterisering van de myosinemobiliteit mogelijk op het niveau van individuele moleculen en ensembles, wat mechanistische inzichten verschaft in de functie van motorproteïnen. Het ondersteunt doelwitvalidatie door biochemische eigenschappen te koppelen aan cellulaire fenotypen, wat bijdraagt aan het verminderen van risico's bij therapeutische strategieën gericht op myosine. De aanpak is aanpasbaar aan ziekte-relevante modellen, wat de preklinische evaluatie van de dynamiek van myosine-isoformen onder gecontroleerde omstandigheden faciliteert.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de mechanochemie van myosine te onderzoeken om functionele rollen in cellulair transport en adhesie te verhelderen.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve resultaten van translocatiesnelheid en loopafstand voor de beoordeling van target-engagement.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt hypothesetesten over hoe regulatoire omstandigheden of mutaties het gedrag van motorproteïnen veranderen, wat helpt bij de betrouwbaarheidsscore van het target.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, op fluorescentie gebaseerde mobiliteitsassays die compatibel zijn met high-content imaging voor compound screening.
- Kwantitatieve output: Levert meetbare parameters zoals de translocatiesnelheid van actine en de run length van individuele moleculen voor dosis-responsanalyse.
- Herbruikbaarheid van het platform: Aanpasbaar aan andere cytoskeletsystemen (bijv. kinesine/dyneïne met microtubuli), wat de overdraagbaarheid van assays tussen verschillende targets mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziektemodellering: Maakt de reconstitutie van cellulaire condities mogelijk om ziekteveroorzakende mutaties in niet-spier-myosines op proteïneniveau te bestuderen.
- Mechanistische risicoreductie: Verbindt defecten in de moleculaire mobiliteit met cellulaire fenotypen, wat de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Preklinische continuïteit: Slaat een brug tussen targetvalidatie in de ontdekkingsfase en preklinische functionele beoordeling via een geconserveerd assayformaat.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van doelwitvalidatie tot lead-optimalisatie en biedt biofysische karakterisering die inzicht geeft in structuur-functie-relaties in motorproteïnen.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en functionele validatie van myosine-isovormen via directe observatie van motiliteitsdynamiek.
- Screening: Maakt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays mogelijk voor het evalueren van compound-effecten op de activiteit van motorproteïnen onder gecontroleerde buffercondities.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van snelheid en processiviteit die vergelijkingen tussen isovormen, mutanten of behandelcondities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt het gedrag van enkelvoudige moleculen met output op ensemble-niveau die relevant is voor cellulaire functies zoals cytokinese en spanningsbehoud.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van diverse motorproteïnen over verschillende therapeutische gebieden, waardoor de inspanning voor de herontwikkeling van assays wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door ambiguïteit in de mechanochemische koppeling van myosine te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays tussen laboratoria door gedefinieerde protocollen voor de voorbereiding van de stroomkamer en beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie van motiliteitsveranderende mutaties of regulatoire effecten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van myosine-targets op basis van gevalideerde functionele domeinen en motiliteitsprofielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitzuivering, fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse voor het volgen van motiliteit.
- Afhankelijk van toegang tot TIRF- of widefield-fluorescentiemicroscopiesystemen en mogelijkheden voor de fabricage van flowkamers.
- Vereist standaardisatie van buffercondities, ATP-concentraties en de selectie van fluoroforen over experimentele replica's.
- Omvat optimalisatieoverwegingen voor verschillende myosine-isovormen met betrekking tot oppervlaktedichtheid, ionsterkte en de inclusie van regulatoire eiwitten.
- Beperkt door de noodzaak van gezuiverde, functionele eiwitpreparaten; de activiteit kan worden beïnvloed door tags, degradatie of onjuiste vouwing.
