Name: Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer myosine-specifieke aanpassingen van fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten voor eiwitdynamica. Deze methode karakteriseert niet-spier myosines en onderzoekt ziekteverwekkende mutaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Dr. Fang Zhang voor technische hulp bij de voorbereiding van de reagentia die worden gebruikt voor het verzamelen van deze gegevens. Dit werk werd ondersteund door de NHLBI/NIH Intramuraal OnderzoekSprogramma fondsen HL001786 aan J.R.S.

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Hier wordt een workflow gepresenteerd voor de zuivering en in vitro karakterisering van myosine 5a en niet-amuscle myosine 2b. Deze reeks experimenten is nuttig voor het kwantificeren van de mechanochemische eigenschappen van gezuiverde myosineconstructies op een snelle en reproduceerbare manier. Hoewel de twee myosines die hier worden getoond slechts twee specifieke voorbeelden zijn van de vele mogelijkheden, kunnen de voorwaarden en technieken, met enige aanpassing, worden toegepast op de meeste myosines en op vele and...

Myosines zijn motoreiwitten die kracht uitoefenen op actinefilamenten met behulp van de energie die wordt afgeleid van adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyse1. Myosines bevatten een hoofd-, nek- en staartdomein. Het hoofddomein bevat het actinebindende gebied en de site van ATP-binding en hydrolyse. De nekdomeinen zijn samengesteld uit IQ-motieven, die zich binden aan lichte ketens, calmodulin of calmodulin-achtige eiwitten2,3. Het staartgebied heeft verschillende functies die specifiek zijn voor elke klasse myosines, waaronder maar niet beperkt tot de verkleining van twee zware ketens, binding van ladingmoleculen en regulering van het myosine via auto-inhibitory interacties met de hoofddomeinen1.
De beweeglijke eigenschappen van myosine variëren sterk tussen klassen. Sommige van deze eigenschappen omvatten de duty ratio (de fractie van de mechanische cyclus van myosine waarin de myosine gebonden is aan actine) en processiviteit (het vermogen van een motor om meerdere stappen op zijn spoor te maken voordat hij wordt losgemaakt)4. De meer dan 40 klassen myosines werden bepaald op basis van sequentieanalyses5,6,7,8. De klasse 2 myosines zijn geclassificeerd als "conventioneel" omdat ze de eerste waren die werden bestudeerd; alle andere klassen myosines worden daarom geclassificeerd als "onconventioneel".
Myosine 5a (M5a) is een klasse 5 myosine en is een processieve motor, wat betekent dat het meerdere stappen langs actine kan nemen voordat het dissocieert. Het heeft een hoge duty ratio , wat aangeeft dat het een groot deel van zijn mechanische cyclus besteedt aan actin9,10,11,12,13,14. Net als andere myosines bevat de zware ketting een N-terminal motordomein dat zowel een actinebinding als een ATP-hydrolyseplaats omvat, gevolgd door een nekgebied dat dient als hefboomarm, met zes IQ-motieven die zich binden aan essentiële lichtketens (ELC) en calmodulin (CaM)15. Het staartgebied bevat α-spiraalvormige coiled-coils, die het molecuul dimmen, gevolgd door een bolvormig staartgebied voor het binden van lading. De kinetiek weerspiegelt zijn betrokkenheid bij het transport van melanosomen in melanocyten en van het endoplasmatisch reticulum in Purkinje neuronen16,17. M5a wordt beschouwd als de prototypische vrachtvervoermotor18.
Klasse 2 myosines, of de conventionele myosines, omvatten de myosines die samentrekking van skelet, hart en gladde spieren aandrijven naast de niet-muscle myosine 2 (NM2) isovormen, NM2a, 2b en 2c19. De NM2-isovormen worden aangetroffen in het cytoplasma van alle cellen en hebben gedeelde rollen in cytokinese, adhesie, weefselmorfogenese en celmigratie19,20,21,22. Dit artikel bespreekt conventionele myosineprotocollen in de context van niet-muscle myosine 2b (NM2b)23. NM2b heeft, in vergelijking met M5a, een lage duty ratio en is enzymatisch langzamer met een Vmax van 0,2 s-123 in vergelijking met M5a's Vmax van ≈18 s-124. Met name afgeknotte NM2b-constructies met twee koppen bewegen niet gemakkelijk procesief op actine; in plaats daarvan resulteert elke ontmoeting met actine in een machtsslag gevolgd door dissociatie van het molecuul25.
NM2b bevat twee myosine zware kettingen, elk met één bolvormig hoofddomein, één hendelarm (met één ELC en één regulerende lichte ketting (RLC)), en een α-spiraalvormige spiraalvormige staaf/staartdomein, ongeveer 1.100 aminozuren lang, dat deze twee zware kettingen verkleint. De enzymatische activiteit en de structurele toestand van NM2b worden gereguleerd door fosforylering van RLC23. Niet-gefosforyleerde NM2b, in aanwezigheid van ATP en fysiologische ionische sterktes (ongeveer 150 mM zout), keurt een compacte conformatie goed waarbij de twee koppen deelnemen aan een asymmetrische interactie en de staart op twee plaatsen terugvouwt over de koppen23. In deze toestand heeft het myosine geen sterke interactie met actine en heeft het een zeer lage enzymatische activiteit. Bij RLC-fosforylering door calmodulin-afhankelijke myosine lichtketenkinase (MLCK) of Rho-geassocieerd eiwitkinase, breidt het molecuul zich uit en associeert het met andere myosines door het staartgebied om bipolaire filamenten te vormen van ongeveer 30 myosinemoleculen23. De bovengenoemde fosforylering van de RLC leidt ook tot een verhoogde actine-geactiveerde ATPase-activiteit van NM2b met ongeveer vier keer26,27,28. Deze bipolaire filamentopstelling, met veel myosinemotoren aan elk uiteinde, is geoptimaliseerd voor rollen in contractie- en spanningsonderhoud, waarbij actinefilamenten met tegengestelde polariteiten ten opzichte van elkaar kunnen worden verplaatst23,29. Het is dan ook aangetoond dat NM2b als een ensemble van motoren fungeert bij interactie met actine. Het grote aantal motoren binnen deze gloeidraad laat NM2b-filamenten in staat om processief te bewegen op actinefilamenten, waardoor in vitro filamentprocesiviteit mogelijk is om29te karakteriseren .
Hoewel er vooruitgang is geboekt bij het begrijpen van de rol van myosines in de cel, is er een behoefte om hun individuele kenmerken op eiwitniveau te begrijpen. Om actomyosine-interacties op een eenvoudig eiwit-eiwitinteractieniveau te begrijpen, in plaats van in een cel, kunnen we recombinante myosines uitdrukken en zuiveren voor gebruik in in vitro studies. De resultaten van dergelijke studies informeren mechanobiologen vervolgens over de biofysische eigenschappen van specifieke myosines die uiteindelijk complexe cellulaire processen aansturen12,13,14,25,29. Meestal wordt dit bereikt door een affiniteitstag toe te voegen aan een volledige of afgeknotte myosineconstructie en te zuiveren via affiniteitschromatografie29,30,31. Bovendien kan de constructie worden ontworpen om een genetisch encodable fluorofoor of een label voor eiwitetikettering met een synthetische fluorofoor op te nemen. Door zo'n fluorescerend label toe te voegen, kunnen beeldvormingsstudies met één molecuul worden uitgevoerd om myosinemechanica en kinetiek te observeren.
Na zuivering kan de myosine op verschillende manieren worden gekarakteriseerd. ATPase-activiteit kan worden gemeten met colorimetrische methoden, die inzicht geven in het totale energieverbruik en de affiniteit van de motor onder verschillende omstandigheden in werking stellen32. Om meer te weten te komen over de mechanochemie van de beweeglijkheid ervan, zijn verdere experimenten nodig. Dit artikel beschrijft twee in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methoden die kunnen worden gebruikt om de beweeglijke eigenschappen van een gezuiverd myosine-eiwit te karakteriseren.
De eerste van deze methoden is de glijdende actinegloeidraadtest, die kan worden gebruikt om de ensemble-eigenschappen van myosinemotoren kwantitatief te bestuderen, evenals de kwaliteit van een partij gezuiverd eiwit kwalitatief te bestuderen33. Hoewel dit artikel het gebruik van tirf-microscopie (Total Internal Reflection Fluorescence) voor deze test bespreekt, kunnen deze experimenten effectief worden uitgevoerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop in het breed veld die is uitgerust met een digitale camera, die vaak in veel laboratoria wordt aangetroffen34. In deze test wordt een verzadigende laag myosinemotoren bevestigd aan een coverslip. Dit kan worden bereikt met behulp van nitrocellulose, antilichamen, membranen, SiO2-gederivatiseerde oppervlakken (zoals trimethylchlorosilane), onder andere29,33,35,36,37,38. Fluorescerend gelabelde actinefilamenten worden door de afdeklipkamer gepasseerd, waarop de actine zich bindt aan de myosine die aan het oppervlak is bevestigd. Na toevoeging van ATP (en kinases in de studie van NM2) wordt de kamer afgebeeld om de translocatie van actinefilamenten door de oppervlaktegebonden myosines te observeren. Tracking software kan worden gebruikt om de snelheid en lengte van elke glijdende actine filament correleren. Analysesoftware kan ook een maat bieden voor het aantal bewegende en stationaire actinefilamenten, wat nuttig kan zijn om de kwaliteit van een bepaald myosinepreparaat te bepalen. Het aandeel vastgelopen filamenten kan ook opzettelijk worden gemoduleerd door oppervlaktegebonden actine aan andere eiwitten en gemeten om de belastingsafhankelijkheid van het myosine39te bepalen . Omdat elk actinefilament kan worden aangedreven door een groot aantal beschikbare motoren, is deze test zeer reproduceerbaar, waarbij de uiteindelijke gemeten snelheid robuust is voor verstoringen zoals veranderingen in de start myosineconcentratie of de aanwezigheid van extra factoren in de oplossing. Dit betekent dat het gemakkelijk kan worden aangepast om myosine-activiteit te bestuderen onder verschillende omstandigheden, zoals gewijzigde fosforylering, temperatuur, ionische sterkte, viscositeit van de oplossing en de effecten van belasting veroorzaakt door oppervlaktetethers. Hoewel factoren zoals sterk bindende myosine "dode hoofden" die niet in staat zijn tot ATP-hydrolyse vastgelopen actinefilamenten kunnen veroorzaken, bestaan er meerdere methoden om dergelijke problemen te verminderen en nauwkeurige metingen mogelijk te maken. De kinetische eigenschappen van myosine variëren sterk tussen de klassen en, afhankelijk van de specifieke myosine die wordt gebruikt, kan de snelheid van actinefilament glijden in deze test variëren van minder dan 20 nm/s (myosine 9)40,41en tot 60.000 nm/s(Characean myosine 11)42.
De tweede test keert de geometrie van de glijdende actinegloeidraadtestom 12. Hier worden de actinefilamenten aan het afdeklipoppervlak bevestigd en wordt de beweging van enkele moleculen van M5a of van individuele bipolaire filamenten van NM2b gevisualiseerd. Deze test kan worden gebruikt om de looplengtes en snelheden van enkele myosinemoleculen of filamenten op actine te kwantificeren. Een coverlip is bedekt met een chemische verbinding die niet-specifieke binding blokkeert en tegelijkertijd het oppervlak functionaliseert, zoals biotine-polyethyleenglycol (biotine-PEG). De toevoeging van gemodificeerde avidinderivaten priemt vervolgens het oppervlak en biotinylated actine wordt door de kamer gepasseerd, wat resulteert in een laag F-actine die stabiel aan de onderkant van de kamer is gebonden. Ten slotte wordt geactiveerd en fluorescerend gelabeld myosine (meestal 1-100 nM) door de kamer gestroomd, die vervolgens wordt afgebeeld om myosinebeweging over de stationaire actinefilamenten te observeren.
Deze modaliteiten vertegenwoordigen snelle en reproduceerbare methoden die kunnen worden gebruikt om de dynamiek van zowel niet-amuskel- als spier myosines te onderzoeken. Dit verslag schetst de procedures om zowel M5a als NM2b te zuiveren en te karakteriseren, die respectievelijk onconventionele en conventionele myosines vertegenwoordigen. Dit wordt gevolgd door een bespreking van enkele myosine-specifieke aanpassingen, die kunnen worden uitgevoerd om een succesvolle vastlegging van beweging in de twee soorten van de test te bereiken.
Expressie en moleculaire biologie Het cDNA voor het myosine van belang moet worden gekloond op een gemodificeerde pFastBac1-vector die codeert voor een C-terminal FLAG-tag (DYKDDDDK) als M5a-HMM wordt uitdrukt, of een N-terminal FLAG-tag als het molecuul van NM2b23,43,44,45,46wordt uitdrukt . C-terminal FLAG-tags op NM2b resulteert in een verzwakte affiniteit van het eiwit voor de KOLOM FLAG-affiniteit. Daarentegen bindt het N-terminaal MET VLAG gelabelde eiwit zich meestal goed aan de KOLOM FLAG-affiniteit23. Het N-terminaal gelabelde eiwit behoudt enzymatische activiteit, mechanische activiteit en fosforyleringsafhankelijke regulatie23.
In dit artikel werd een afgeknotte muis M5a heavy meromyosine (HMM)-achtige constructie gebruikt met een GFP tussen de FLAG-tag en het C-terminus van de myosine zware ketting. Merk op dat in tegenstelling tot NM2b M5a-HMM met succes kan worden getagd en gezuiverd met N- of C-terminal FLAG-tags en in beide gevallen zal de resulterende constructie actief zijn. De M5a zware keten werd afgekapt op aminozuur 1090 en bevat een drie aminozuur linker (GCG) tussen de GFP en het coiled-coil gebied van de M5a47. Er is geen extra linker toegevoegd tussen de GFP en FLAG-tag. M5a-HMM werd samen met calmodulin uitgedrukt. De volledige menselijke NM2b-constructie werd samen met ELC en RLC tot uitdrukking gebracht. De N-termini van de RLC werd gefuseerd met een GFP via een linker van vijf aminozuren (SGLRS). Direct gekoppeld aan de FLAG-tag was een HaloTag. Tussen de HaloTag en het N-eindpunt van de myosine zware keten was een linker gemaakt van twee aminozuren (AS).
Beide myosinepreparaten werden gezuiverd uit één liter Sf9-celkweek die besmet was met baculovirus met een dichtheid van ongeveer 2 x 106 cellen/ml. De volumes van het baculovirus voor elke subeenheid waren afhankelijk van de veelheid van infectie van het virus, zoals bepaald door de instructies van de fabrikant. In het geval van M5a werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met twee verschillende baculovirussen- één voor calmodulin en één voor M5a zware keten. In het geval van de NM2b werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met drie verschillende virussen- één voor ELC, één voor RLC en één voor NM2b zware keten. Voor laboratoria die werken met een diversiteit aan myosines (of andere multicomplexe eiwitten), is deze aanpak efficiënt omdat het veel combinaties van zware en lichte ketens mogelijk maakt en veelgebruikte lichte ketens zoals calmodulin kunnen worden gecotransfecteerd met veel verschillende myosine zware ketens. Al het celwerk werd voltooid in een bioveiligheidskast met de juiste steriele techniek om besmetting te voorkomen.
Voor de expressie van zowel M5a als NM2b werden de Sf9-cellen die de recombinante myosines produceren 2-3 dagen na infectie verzameld, via centrifugeren, en opgeslagen bij -80 °C. Celkorrels werden verkregen door de met co-geïnfecteerde Sf9-cellen gedurende 30 minuten bij 2.800 x g bij 4 °C te centrifugeren. Het eiwitzuiveringsproces wordt hieronder beschreven.

<table><tbody><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2 M CaCl2 Solution</td><td>VWR</td><td>10128-558</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2 Solution</td><td>VWR</td><td>10128-298</td><td></td></tr><tr><td>27 Gauge Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl Solution</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3270</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>984303</td><td></td></tr><tr><td>Amyl Acetate</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2220</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated G-Actin</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Millipore Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>bPEG-silane</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin</td><td></td><td>PMID: 2985564</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Millipore Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496015</td><td>http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf</td></tr><tr><td>Circular Filter Paper - Gliding Assay</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td>Circular Filter Paper - Inverted Assay</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001090</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets</td><td>Millipore Sigma</td><td>5056489001</td><td>Dit moet worden bewaard bij 4 &deg;C. De tabletten kunnen direct worden gebruikt of kunnen worden gereconstitueerd als een 25x stamoplossing door 1 tablet op te lossen in 2 mL gedistilleerd water. De resulterende oplossing kan worden bewaard bij 4 &deg;C gedurende 1-2 weken of ten minste 12 weken bij -20 &deg;C. </td></tr><tr><td>Concentrating Tubes (100,000 MWCO)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>UFC910024</td><td>De MWCO van de buis is niet noodzakelijkerwijs 'één maat past voor allen', zolang de MWCO minder is dan het totale molecuulgewicht van het gezuiverde eiwit. De NM2b hierin werd geconcentreerd met een buis van 100.000 MWCO en de M5a werd geconcentreerd met een buis van 30.000 MWCO.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip Rack</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z688568-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips: Gliding Acting Filament Assay</td><td>VWR International</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips: Inverted Motility Assay</td><td>Azer Scientific</td><td>ES0107052</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-670-5A</td><td>De diameter van de dialysebuis kan variëren, maar de MWCO moet hetzelfde zijn. De NM2b die hierin werd gebruikt, werd gedialyseerd in een dialysebuis van 18 mm. De buizen kunnen worden bewaard in 20% alcoholoplossing bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Double-Sided Tape</td><td>Office Depot</td><td>909955</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK Peptide</td><td>GenScript</td><td>RP10586</td><td>Dit kan worden opgelost in een buffer met 0,1 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3 en 10 mM MOPS (pH 7,2) tot een eindconcentratie van 50 mg/mL. Dit kan worden bewaard bij -20 &deg;C als 300 µL aliquots. </td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Elution Column</td><td>Bio-Rad</td><td>761-1550</td><td>Deze kunnen worden hergebruikt. Om te reinigen, spoelt u de kolom met 2-3 kolomvolumes PBS en gedistilleerd water. Koel de kolom voor gebruik op 4&deg; C.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>G-actin</td><td></td><td>PMID: 4254541</td><td>G-actin stock kan worden bewaard bij 200 μM in vloeibare N2.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Oxidase</td><td>Millipore Sigma</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-295018</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag</td><td>Promega</td><td>G100A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fischer Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Large-Orifice Pipet Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Protease Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78435</td><td></td></tr><tr><td>Mark12 Unstained Standard Ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5677</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>MX0482</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Millipore

myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosine-eiwitten binden en interageren met filamenteuze actine (F-actine) en worden aangetroffen in organismen in de fylogenetische boom. Hun structuur en enzymatische eigenschappen zijn aangepast voor de specifieke functie die ze in cellen uitvoeren. Myosine 5a loopt processief op F-actine om melanosomen en blaasjes in cellen te transporteren. Omgekeerd werkt niet-amuscle myosine 2b als een bipolair filament dat ongeveer 30 moleculen bevat. Het beweegt F-actine van tegenovergestelde polariteit naar het midden van de gloeidraad, waar de myosinemoleculen asynchroon werken om actine te binden, een krachtslag te geven en te ontkoppelen voordat de cyclus wordt herhaald. Nonmuscle myosine 2b, samen met zijn andere nonmuscle myosine 2 isovormen, heeft rollen die celadhesie, cytokinese en spanningsonderhoud omvatten. De mechanochemie van myosines kan worden bestudeerd door in vitro motiliteitstesten uit te voeren met behulp van gezuiverde eiwitten. In de gliding actine filament assay, de myosines zijn gebonden aan een microscoop coverslip oppervlak en translocate fluorescerend gelabeld F-actine, die kan worden gevolgd. In de single molecule/ensemble motility assay is F-actine echter gebonden aan een coverslip en wordt de beweging van fluorescerend gelabelde myosinemoleculen op de F-actine waargenomen. In dit rapport wordt de zuivering van recombinant myosine 5a uit Sf9-cellen met behulp van affiniteitschromatografie beschreven. Hierna schetsen we twee fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays: de gliding actine filament assay en de omgekeerde motility assay. Uit deze test kunnen parameters zoals actinetranslocatiesnelheden en looplengtes en snelheden van één molecuul worden geëxtraheerd met behulp van de beeldanalysesoftware. Deze technieken kunnen ook worden toegepast om de beweging van enkelvoudige filamenten van de niet-muscle myosine 2 isovormen te bestuderen, die hierin worden besproken in de context van niet-amuscle myosine 2b. Deze workflow vertegenwoordigt een protocol en een reeks kwantitatieve tools die kunnen worden gebruikt om de enkele molecuul- en ensembledynamiek van niet-muscle myosines te bestuderen.

De zuivering van myosine kan worden geëvalueerd door het verminderen van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide (SDS-PAGE) gel-elektroforese zoals weergegeven in figuur 2. Terwijl dit cijfer de definitieve, post-dialysed myosine vertegenwoordigt, kan SDS-PAGE op aliquots van de verschillende stadia van de zuiveringsprocedure worden uitgevoerd om om het even welke producten te identificeren die aan supernatant verloren gaan. Myosin 5a HMM heeft een band in het 120-130 kDa bereik en de full-leng...

Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Dit protocol kan worden gebruikt om niet-spier myosine dynamiek op eiwitniveau te karakteriseren, die de beweeglijke eigenschappen kan informeren die bijdragen aan hun rol in cellen. Dit is een snelle, reproduceerbare en zeer gecontroleerde methode die kan worden gebruikt om de effecten van verschillende regulerende omstandigheden op de beweeglijkheid van myosine te bestuderen en hun cellulaire gedrag te informeren. Deze technieken kunnen worden gebruikt om te onderzoeken hoe ziekteverwekkende mutaties in niet-spier myosines hun gedrag op het niveau van één molecuul en ensemble beïnvloeden.De algemene benadering van de methodologie kan worden toegepast op verschillende andere cytoskeletsystemen, zoals de karakterisering van gezuiverde kinesines en dyneins met microtubuli. De veelzijdigheid van dit protocol kan vragen oproepen over welke fluoroforen en chemische omstandigheden het meest geschikt zijn, maar de methode kan relatief snel worden geoptimaliseerd. Het begrijpen hoe de stromingskamers moeten worden opgezet en bekleed, zorgt voor een sterke basis waarop men zich kan aanpassen aan verschillende omstandigheden voor deze experimenten.Bereid om te beginnen een nitrocelluloseopl

myosin-specific-adaptations-vitro-fluorescence-microscopy-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we perform an in vitro motility assay to analyze the actin-myosin interactions. The gliding movement of actin filaments on immobilized myosin molecules is visualized using fluorescence microscopy.

The Gliding Actin Filament Assay: An In Vitro Motility Assay to Study Translocation of Actin Filaments on Immobilized Myosins

Inverted Motility Assay: An In Vitro Technique to Visualize Myosin Movement on Immobilized Actin Filaments

Recente bevindingen suggereren dat bacteriële flagellaire motoren een verscheidenheid aan omgevingssignalen detecteren en als reactie hierop veranderen. De hier besproken bead-assays zullen naar verwachting helpen bij het verklaren van de rol van verandering in cellulaire aanpassing aan omgevingsstressors.

Biofysische karakterisering van flagellaire Motor Functies

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

Vorming van actomyosinebundels in vitro en het meten van myosine ensemblekrachtgeneratie met behulp van een optisch pincet wordt gepresenteerd en besproken.

Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.

Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

Dit protocol beschrijft de procedures voor het recombinant produceren van het humaan myosine-7a holo-enzym met behulp van het MultiBac Baculovirus-systeem en voor het bestuderen van de beweeglijkheid ervan met behulp van een op maat gemaakte in vitro filament glijdende test.

MultiBac-systeemgebaseerde zuivering en biofysische karakterisering van humaan myosine-7a

Hier presenteren we methoden voor het bereiden van quasi-tweedimensionale (2D) verstrengelde, verknoopte en vloeibare kristalactine-assemblages van gezuiverde eiwitten.

Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Leer myosine-specifieke aanpassingen van fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten voor eiwitdynamica. Deze methode karakteriseert niet-spier myosines en onderzoekt ziekteverwekkende mutaties.

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Meer video's verkennen