Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten
February 4th, 2021
Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.
Dit protocol kan worden gebruikt om niet-spier myosine dynamiek op eiwitniveau te karakteriseren, die de beweeglijke eigenschappen kan informeren die bijdragen aan hun rol in cellen. Dit is een snelle, reproduceerbare en zeer gecontroleerde methode die kan worden gebruikt om de effecten van verschillende regulerende omstandigheden op de beweeglijkheid van myosine te bestuderen en hun cellulaire gedrag te informeren. Deze technieken kunnen worden gebruikt om te onderzoeken hoe ziekteverwekkende mutaties in niet-spier myosines hun gedrag op het niveau van één molecuul en ensemble beïnvloeden.
De algemene benadering van de methodologie kan worden toegepast op verschillende andere cytoskeletsystemen, zoals de karakterisering van gezuiverde kinesines en dyneins met microtubuli. De veelzijdigheid van dit protocol kan vragen oproepen over welke fluoroforen en chemische omstandigheden het meest geschikt zijn, maar de methode kan relatief snel worden geoptimaliseerd. Het begrijpen hoe de stromingskamers moeten worden opgezet en bekleed, zorgt voor een sterke basis waarop men zich kan aanpassen aan verschillende omstandigheden voor deze experimenten.
Bereid om te beginnen een nitrocelluloseoplossing van één procent in amylacetaat en plaats een cirkelvormig filterpapier met een diameter van 125 millimeter op de bodem van een weefselkweekplaat. Plaats acht vierkante afdekslips op een rek en was ze grondig met ongeveer twee tot vijf milliliter 200-proof ethanol, gevolgd door twee tot vijf milliliter gedestilleerd water. Rijd vervolgens de afdekstrips volledig met behulp van een gefilterde luchtleiding of stikstofleiding.
Pipetteer langzaam 10 microliter nitrocelluloseoplossing van één procent langs één rand van één afdekstrook. Smeer het over de rest van de afdekslip met behulp van de zijkant van een pipetpunt van 200 microliter in één vloeiende beweging. Plaats vervolgens deze afdeklip op de weefselkweekschaal met de nitrocellulosezijde naar boven.
Herhaal dit voor de resterende afdekstrips en laat ze drogen. Veeg een microscoopschuif af met een optisch lenspapier om groot vuil te verwijderen. Snijd twee stukken dubbelzijdige tape, ongeveer twee centimeter lang, en plaats een stuk langs het midden van de lange rand van de microscoopschuif.
Plaats het tweede stuk tape ongeveer twee millimeter onder het eerste stuk tape, zodat de twee parallel lopen en een stromingskamer creëren die ongeveer 10 microliter oplossing kan bevatten. Plak voorzichtig een van de nitrocellulose hoezen op de tape zodat de met nitrocellulose bedekte zijde direct contact maakt met de tape. Druk met behulp van een pipettip voorzichtig op de interface van de schuiftape om ervoor te zorgen dat de afdekstrook goed aan de schuif is vastgespecht.
Snijd vervolgens de overtollige tape die over de rand van de glijbaan hangt met een scheermesje. Bereid de oplossingen voor Myosin 5a voor en houd ze op ijs. Vloei in 10 microliters van de Myosin 5a door de schuifstroomkamer en wacht een minuut.
Vervolgens stroom in 10 microliter van een milligram per milliliter BSA in motiliteit buffer met DTT. Herhaal dit twee keer en wacht een minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten lopen door de hoek van het papier voorzichtig bij de uitgang van de stromingskamer te plaatsen.
Was vervolgens met 10 microliter motiliteitsbuffer met DTT. Pipetteer de zwarte actineoplossing met een spuit van één milliliter en een naald van 27 gauge om de actinefilamenten te scheren voordat u die oplossing in de kamer introduceert. Voeg de zwarte actine toe aan de kamer in aanwezigheid van één millimolar ATP in 50 millimolar MB met één millimolar DTT.
Voer vervolgens 50 microliter motility buffer in met DTT en een millimolar ATP om de kamer van vrije actinefilamenten uit te putten. Was drie keer met 10 microliter motiliteitsbuffer met DTT om de kamer van een ATP uit te putten. Debiet in 10 microliters van 20 nanomolar RH-actineoplossing met motiliteitsbuffer met DTT en wacht een minuut om rigorbinding van actinefilamenten aan de Myosin 5a aan het oppervlak van de afdekslip mogelijk te maken.
Was met 10 microliter 50 millimolar motility buffer met DTT tweemaal om ongebonden RH actine filamenten te verwijderen. Stroom in 30 microliter eindbuffer. Neem beelden op een fluorescentiemicroscoop op met behulp van een excitatiegolflengte van 561 nanometer om de RH-actine te visualiseren.
Bereid de oplossingen voor Myosin 5a omgekeerde motiliteitstest voor en houd ze op ijs. Was ze kamer met 10 microliter motiliteit buffer met DTT. Stroom in 10 microliter van een milligram per milliliter BSA in motiliteit buffer met DTT.
Herhaal dit twee keer en wacht een minuut na de derde wasbeurt. Gebruik tissue- of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten lopen door de hoek van het papier voorzichtig bij de uitgang van de stromingskamer te plaatsen. Was vervolgens de kamer drie keer met 10 microliters motiliteitsbuffer met DTT.
De stroom in 10 microliters van de NeutrAvidin-oplossing in motiliteitsbuffer met DTT en wacht een minuut. Was vervolgens drie keer met 10 microliters van die oplossing. Stroom in 10 microliters BRH actine met motiliteitsbuffer met DTT met behulp van een grote verveelde pipettip.
En wacht even. Was vervolgens drie keer met 10 microliter motiliteitsbuffer met DTT. Stroom in 30 microliter eindbuffer met 10 nanomolar Myosin 5a.
En laad onmiddellijk op de totale interne reflectiefluorescentiemicroscoop. Begin met opnemen zodra de optimale focus voor TIRF-beeldvorming is gevonden. De zuivering van niet-spier Myosine 2b, essentiële lichtketens en regulerende lichtketens, evenals de Myosin 5a en calmodulin werd geëvalueerd door het uitvoeren van SDS-PAGE.
De glijdende actine filament assay toont de kenmerken van een ideale en traceerbare film met vloeiende bewegingen van gelabelde actine filamenten. De zwarte actinewas zorgde ervoor dat de dode myosinekoppen uit het meetveld werden verwijderd, wat verder bijdroeg aan de algehele soepele beweging van de actinefilamenten. Filament tracking output beelden van het fast track programma werden verkregen voor niet-spier Myosin 2b en Myosin 5a.
Een representatief histogram toont aan dat de Actomyosine 2b glijsnelheid 77 nanometer per seconde is. En die van Actomyosin 5a is 515 nanometer per seconde. Bij afwezigheid van methylcellulose blijven de actinefilamenten niet zo nauw verbonden met het met myosine bedekte oppervlak, waardoor het dicht bij het oppervlak van de niet-spier Myosin 2b-gecoate afdekstrips klapt.
Myosinebeweging werd waargenomen bij aan de oppervlakte vastgebonden fluorescerende actinefilamenten met behulp van de omgekeerde motiliteitstest. Het is belangrijk om de ongelabelde actine te scheren voordat u deze in de stroomcel brengt voor de zwarte actinewas, waardoor de translocatie van actine soepel verloopt. Aanvullende experimenten kunnen onderzoeken hoe myosinemotiliteit wordt beïnvloed door myosinemutaties, belastingsinducerende eiwitten, ionische sterkte en regulerende eiwitten.
Verschillende cellulaire aandoeningen kunnen worden gereconstitueerd voor toekomstige studies. Deze methoden maken het mogelijk om biochemisch en biofysisch onderzoek te doen naar hoe verschillende myosine-isovormen variëren in hun beweeglijke en mechanische eigenschappen op het niveau van één molecuul en ensemble.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de expressie en zuivering van myosine 5a, gevolgd door de karakterisering ervan met behulp van in vitro fluorescentiemicroscopie-assays. Het bespreekt ook aanpassingen voor het onderzoek van niet-spiermyosine 2b.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Myosinen spelen een cruciale rol in cellulaire beweeglijkheid.
- Het begrijpen van myosinedynamiek is essentieel voor het ophelderen van hun functies in cellen.
- Niet-spiermyosinen zijn betrokken bij verschillende cellulaire processen.
- Karakteriseringstechnieken kunnen de impact van mutaties op myosinegedrag onthullen.
Doel van het onderzoek
- Om de dynamische eigenschappen van niet-spiermyosine op eiwitniveau te karakteriseren.
- Om informatie te geven over de beweeglijke eigenschappen die bijdragen aan cellulaire rollen.
- Om de effecten van regulatorische condities op myosinebeweeglijkheid te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Ensemble- en enkele molecuulfluorescentiemicroscopie.
- Karakterisering van gezuiverde myosinen.
- Optimalisatie van fluoroforen en chemische condities.
- Installatie en coating van flowkamers voor experimenten.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol is snel, reproduceerbaar en zeer gecontroleerd.
- Het maakt de studie van ziekteverwekkende mutaties in niet-spiermyosinen mogelijk.
- Veelzijdige methodologie toepasbaar op andere cytoskeletalsystemen.
- Snelle optimalisatie voor verschillende experimentele condities.
Conclusies
- Het begrijpen van myosinedynamiek vergroot de kennis van cellulaire gedragingen.
- Deze methode biedt een sterke basis voor toekomstige studies.
- Het roept belangrijke vragen op over myosinefunctie in gezondheid en ziekte.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative characterization of myosin motility at single molecule and ensemble levels, providing mechanistic insights into motor protein function. It supports target validation by linking biochemical properties to cellular phenotypes, informing de-risking of myosin-directed therapeutic strategies. The approach is adaptable to disease-relevant models, facilitating preclinical evaluation of myosin isoform dynamics under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myosin mechanochemistry to clarify functional roles in cellular transport and adhesion.
- Operational Value: Provides reproducible, quantitative readouts of translocation velocity and run length for target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of how regulatory conditions or mutations alter motor protein behavior, aiding in target confidence scoring.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, fluorescence-based motility assays compatible with high-content imaging for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable parameters such as actin translocation velocity and single molecule run length for dose-response analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other cytoskeletal systems (e.g., kinesin/dynein with microtubules), enabling cross-target assay portability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Allows reconstitution of cellular conditions to study disease-causing mutations in non-muscle myosins at the protein level.
- Mechanistic De-risking: Links molecular motility defects to cellular phenotypes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical functional assessment through conserved assay format.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, offering biophysical characterization that informs structure-function relationships in motor proteins.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of myosin isoforms through direct observation of motility dynamics.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating compound effects on motor protein activity under controlled buffer conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of velocity and processivity that allow comparison across isoforms, mutants, or treatment conditions.
- Translational Research: Connects single molecule behavior to ensemble-level outputs relevant to cellular functions like cytokinesis and tension maintenance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse motor proteins across therapeutic areas, reducing assay redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in myosin mechanochemical coupling.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and standardization across laboratories through defined flow chamber preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of motility-altering mutations or regulatory effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of myosin targets based on validated functional domains and motility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence microscopy, and image analysis for motility tracking.
- Depends on access to TIRF or widefield fluorescence microscopy systems and flow chamber fabrication capabilities.
- Necessitates standardization of buffer conditions, ATP concentrations, and fluorophore selection across experimental replicates.
- Involves optimization considerations for different myosin isoforms regarding surface density, ionic strength, and regulatory protein inclusion.
- Limited by the need for purified, functional protein preparations; activity may be affected by tags, degradation, or improper folding.
