Name: Luchtinflatie van muizenlongen met vasculaire perfusie-fixatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer een kosteneffectieve methode voor luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie in muizenlongen. Deze techniek behoudt celmorfologie en ruimtelijke locatie voor histologische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door de National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) subsidies HL140039 en HL130938. De auteurs willen Shannon Hott en Jazalle McClendon bedanken voor hun technische expertise.

Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van National Jewish Health.
OPMERKING: Het protocol is georganiseerd in drie componenten. Het eerste onderdeel beschrijft de constructie van de luchtinflatie met perfusie-/fixatieapparatuur. In een tweede sectie wordt beschreven hoe u de apparatuur voor een experiment instelt. In het laatste gedeelte wordt beschreven hoe het dier moet worden voorbereid en het experiment moet worden uitgevoerd.
1. Constructie van het waterkolomapparaat (figuur 1B)
<ol><li>Verwijder de zuiger uit een spuit met slippunt van 60 ml.</li>
	<li>Bevestig tape rond de spuit op de 30 ml markering. Stel de hoogte van de spuit in op deze markering voor de initiële bandenspanning van 25 cmH2O. Dit is ook waar het waterniveau in de kolom gedurende de hele procedure moet zijn. Label de tape als "25 cm" (zoals afgebeeld in figuur 1A)of "inflatie". OPMERKING: Een bandenspanning van 25 cmH2O wordt gebruikt om de rekrutering van ingestorte luchtruimen te garanderen. Zodra longblaasjes zijn gerekruteerd, wordt de druk verlaagd tot 20 cmH2O om ervoor te zorgen dat de luchtruimen niet opzwollen.</li>
	<li>Meet 5 cm van de tape naar het uiteinde van de zuiger en bevestig nog een stuk tape aan de spuit. Beweeg de spuit naar beneden naar deze markering om de bandenspanning te verlagen tot 20 cmH2O tijdens de fixatie. Label de tape als "20 cm" (zoals afgebeeld in figuur 1A)of "fixatie".</li>
	<li>Bevestig 180 polyvinylchloride (PVC) buizen aan het uiteinde van de spuit. De lengte van de slang is afhankelijk van de afstand tussen de spuit en de luchtinflatiekamer (ongeveer 25-30 cm).</li>
	<li>Plaats een mannelijk Luer (2) draadstijl T-stuk (1,219 inch lang, 0,904 inch hoog, 0,0904 inch binnendiameter) in het andere uiteinde van de buis. Deze mannelijke Luer zal verbinding maken met de stopkraan van de luchtinflatiekamer (stap 2.4).</li>
</ol>2. Constructie van de luchtinflatiekamer (figuur 1C)
<ol><li>Boor twee gaten (ongeveer 4 mm in diameter) in een plastic container van 500 ml met een schroefdop. De gaten moeten dezelfde grootte hebben als de vrouwelijke Luers (1.224 inch lengte, 0.312 inch hoogte, 0.098 inch binnendiameter). OPMERKING: Lege media of buffercontainers kunnen worden gebruikt voor de luchtinflatiekamer.</li>
	<li>Bedek draden van vrouwelijke Luers met siliconen pakkingmaker en plaats de kleinere kant in de voorgeboorde gaten van de container.</li>
	<li>Voeg siliconen pakkingmaker toe rond de vrouwelijke Luers waar ze de container binnenkomen om een luchtdichte afdichting te garanderen.</li>
	<li>Schroef een eenrichtingsstopkraan op de onderste vrouwelijke Luer op de luchtinflatiekamer.</li>
	<li>Knip buizen tot de lengte van ongeveer 25 cm en bevestig mannelijke Luers aan de vrije uiteinden van de buis. Verbind de mannelijke Luer aan het ene uiteinde van de buis met de vrije vrouwelijke Luer op de luchtinflatiekamer. De andere mannelijke Luer zal verbinding maken met de dierverwerkende container.</li>
</ol>3. Constructie van de dierverwerkingscontainer (figuur 1D)
<ol><li>Boor een gat (ongeveer 4 mm diameter) in de zijkant van een grote plastic container. Het gat moet de diameter van de vrouwelijke Luer hebben. De plastic container is nodig om overtollige fixatie-oplossing op te vangen. OPMERKING: Een plastic opslagcontainer van 30 cm x 22 cm, 3,8 L werd gebruikt.</li>
	<li>Bedek draden van een vrouwelijke Luer met een siliconen pakkingmaker en plaats de kleinere kant in het voorgedrillde gat van de container.</li>
	<li>Voeg siliconen pakkingmaker toe rond de vrouwelijke Luer waar deze de container in en uit gaat om een luchtdichte afdichting te garanderen.</li>
	<li>Schroef een eenrichtingsstopkraan op de vrouwelijke Luer. Slangen van de luchtinflatiekamer zullen zich aan deze stopkraan hechten.</li>
</ol>4. Bereiding van oplossingen
<ol><li>Heparine oplossing<ol>
<li>Vul een container met calciumvrij PBS en heparine (20 E/ml). Bereid in totaal 10 ml heparine-oplossing voor elke muis. Heparine is een antistollingsmiddel dat voorkomt dat zich tijdens perfusiefixatie bloedstolsels in de bloedvaten vormen. Heparine-oplossing zal worden gebruikt om bloed uit de longen te spoelen voorafgaand aan perfusie-fixatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixatieve oplossing LET OP: Fixatieven kunnen een gevaar voor de gezondheid opleveren en moeten worden gebruikt in een chemische zuurkast. Alle apparaten zijn opgesteld in een chemische zuurkast om inademing van fixatieven te voorkomen.<ol>
<li>Vul een container met calciumvrij PBS en paraformaldehyde (4% eindconcentratie). Bereid een totaal van 50 ml fixatieve oplossing voor elke muis. OPMERKING: Het type fixatief dat wordt gebruikt, kan variëren en is afhankelijk van downstream histologische studies.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.   Voorbereiding van perfusieapparatuur
OPMERKING: Een peristaltische pomp wordt voorgesteld voor de afgifte van vloeistoffen in vasculatuur om een constant debiet te garanderen. De volgende aanwijzingen zijn voor het instellen van de peristaltische pomp en kunnen voor elk model anders zijn. Als alternatief, als een peristaltische pomp niet beschikbaar is, kan een tweede waterkolomapparaat worden gebouwd om vloeistoffen te perfuseren vanaf een hoogte van 35 cm H2O.
<ol><li>Plaats eerst de buizen rond de rolassemblage.</li>
	<li>Bevestig de slang in de ingekepingen.</li>
	<li>Zet de hendels op hun plaats door eerst de linkerhendel rond de slang te plaatsen en deze met de bovenkant en vervolgens de rechterhendel op zijn plaats te zetten.</li>
	<li>Plaats het proximale uiteinde van de slang in de heparine-oplossing en het distale uiteinde in de container voor dierverwerking.</li>
	<li>Laad de heparineoplossing vooraf in de slang door de pomp te laten draaien om lucht uit de buis te verdrijven.</li>
	<li>Bevestig een 25G x 5/8"-naald aan het uiteinde van de linkerkant van de slang.</li>
</ol>6. Voorbereiding van luchtinflatieapparatuur
<ol><li>Plaats de spuit voor de waterkolom in een ringhouder.</li>
	<li>Meet een verticale hoogte van 25 cm vanaf het dierenplatform tot het tapemerk "25 cm" (stap 1.2) op de waterkolom.</li>
	<li>Bevestig het uiteinde van de buis van de waterkolom aan de stopkraan op de luchtkamer.</li>
	<li>Bevestig een buis van de vrouwelijke Luer van de luchtkamer aan de stopkraan op de dierlijke verwerkingscontainer. OPMERKING: Als de luchtinflatiekamer is geconstrueerd zoals afgebeeld in figuur 1C,kan het bevestigen van slangen in omgekeerde volgorde ervoor zorgen dat water lekt in de buis die verbinding maakt met de tracheale canule.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de dop naar de luchtkamer goed gesloten is.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de stopkraan aan de buitenkant van de dierverwerkingscontainer gesloten is en dat de stopkraan op de buis die van de waterkolom naar de luchtinflatiekamer leidt, open is.</li>
	<li>Vul de spuit met water tot de markering "25 cm". Water verlaat de spuit via de slang in de luchtkamer. Zodra de druk is gelijk gemaakt, zal het water stoppen met stromen.<ol>
<li>Het is mogelijk dat water langzaam in de luchtinflatiekamer lekt als de omgevingsluchtdruk in de chemische kap fluctueert. Houd het waterniveau in de spuit in de gaten en voeg indien nodig meer toe. Houd het waterniveau gedurende de hele procedure op de markering "25 cm". OPMERKING: Gewoonlijk blijven de waterstanden consistent voor het eerste deel van de luchtinflatie bij 25 cmH2O; tijdens de fixatie zal echter waarschijnlijk meer water aan de spuit moeten worden toegevoegd. Als het water niet stopt met stromen, is het waarschijnlijk dat er een luchtlek bestaat in de luchtinflatiekamer. Mogelijk moet er meer siliconen pakkingmaker rond de Luers worden aangebracht om luchtlekken te voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Bereiding van dieren (Figuur 2)
OPMERKING: Deze procedure is gewijzigd door Gage et al13. We hebben deze procedure voltooid bij volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen van verschillende leeftijden en merken geen leeftijds- of geslachtsbias op.
<ol><li>Euthanaseer het dier met natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneaal.). Zorg ervoor dat het dier dood is voordat u begint met dissectie. OPMERKING: Hoewel deze procedure wordt uitgevoerd op geëuthanaseerde dieren, kan deze procedure worden uitgevoerd op levende dieren om het hart te gebruiken om perfusaten door het hele dier te pompen.</li>
	<li>Maak twee laterale incisies door de buikwand. Maak de eerste incisie onder de ribbenkast en de tweede boven de heupen. Snijd langs de middellijn van de inferieure incisie naar de superieure incisie.</li>
	<li>Maak met een stompe schaar voorzichtig een incisie in de laterale kant van het diafragma. De longen moeten instorten zodra het middenrif wordt doorboord. OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat de longen niet worden doorboord. Een doorboorde long zal minder snel opblazen tijdens latere stappen.</li>
	<li>Snijd dwars langs het diafragma om de thoracale holte te openen.</li>
	<li>Snijd superieur langs het borstbeen van het xiphoid-proces naar de jugulaire inkeping en zijdelings boven de ribbenkast om het hart en de longen volledig bloot te leggen. Pin de zijkanten van de ribbenkast vast.</li>
	<li>Maak een middellijnincisie in de nek boven de luchtpijp. Verwijder huid, spieren, schildklier en bindweefsel rond de luchtpijp.</li>
	<li>Schuif met een gebogen tang twee stukken draad of hechtdraad onder de achterste luchtpijp. Gebruik het ene stuk hechtdraad om de luer-stub-adapter op zijn plaats te houden en gebruik het andere uiteindelijk om de luchtpijp af te binden aan het einde van luchtinflatie en vasculaire perfusie-fixatie.</li>
	<li>Prik een klein gaatje in de luchtpijp met een 18G x 1" naald of Vannas veerschaar.</li>
	<li>Plaats een 20G Luer-stub adapter in dit gat in de luchtpijp.</li>
	<li>Bind een draad rond de luchtpijp onmiddellijk distal naar waar de Luer-stub adapter binnenkomt om het op zijn plaats te houden.</li>
	<li>Breng het dier over naar de dierverwerkingscontainer.</li>
	<li>Bevestig de Luer-stub adapter aan de vrouwelijke Luer aan de binnenkant van de dierverwerkingscontainer.</li>
</ol>8. Luchtinflatie, perfusie en fixatie van de longen (Figuur 2)
<ol><li>Plaats de 25G x 5/8"-naald die aan de slang van het perfusieapparaat is bevestigd in de rechterkamer van het hart.</li>
	<li>Snijd de abdominale aorta om het bloed uit het hart te laten wegvloeien en om de doorbloeding door de longen te bevorderen.</li>
	<li>Open de stopkraan aan de buitenkant van de dierlijke verwerkingscontainer om de longen op te blazen. OPMERKING: Het kan even duren voor de longen volledig zijn opgeblazen. Let op het waterniveau in de spuit, het mag niet snel dalen, tenzij er een lek in de longen is.</li>
	<li>Blaas de longen op bij 25 cmH2O gedurende 5 minuten. Inflatie bij 25 cmH2O stelt de long voor en helpt bij het werven van atelectatische longgebieden. OPMERKING: Mogelijk moet een kleine hoeveelheid water aan de spuit worden toegevoegd om de hoogte van 25 cm te behouden. Ontsteking en/of experimenteel geïnduceerd longletsel kan de inflatie van de longen beïnvloeden. In dit geval kan het nodig zijn om de inflatiedruk te verhogen tot een maximum van 35 cmH2O om te helpen bij het werven van atelectatische regio's.</li>
	<li>Schakel tijdens de laatste minuut van de longinflatie de peristaltische pomp in tot een debiet van 10 ml / min. Heparine-oplossing moet uit de fles door de slang in het dier stromen.<ol>
<li>Het doel van heparine-infusie is om de vorming van trombi in de bloedvaten te voorkomen. Dienovereenkomstig, infundeer heparine totdat de longen wit worden en verstoken zijn van bloed. Als de longen niet wit worden, kan aanpassing van de rechterventrikelnaald nodig zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schakel na het opblazen gedurende 5 minuten de peristaltische pomp uit en schakel de perfusieslang van de heparine-oplossing naar het fixatief.</li>
	<li>Laat de spuit met waterkolom zakken tot het merkteken "20 cm" (stap 1.3). Het is normaal dat luchtbellen binnen de waterkolom bewegen als de druk verandert van 25 tot 20 cmH2O.<ol>
<li>Controleer het waterniveau in de spuit. Het moet op het merk "25 cm" zijn. Het kan nodig zijn om op dit moment meer toe te voegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wacht 1 minuut om de longen te laten leeglopen van 25 tot 20 cmH2O.</li>
	<li>Start de perfusiepomp opnieuw op met een debiet van 6,5 ml/min.</li>
	<li>Vasculaire perfusie-fix gedurende 10 - 15 minuten.</li>
</ol>9. Extractie van longen (Figuur 3)
<ol><li>Bind het tweede stuk draad rond de luchtpijp distal stevig vast aan de Luer-stub adapter. Verwijder de Luer-stub adapter uit de luchtpijp.</li>
	<li>Verwijder de naald uit het hart.</li>
	<li>Bevrijd de longen en het hart van de thoracale holte door het bindweefsel achter het mediastinum met een stompe schaar door te knippen. Zorg ervoor dat u de longen niet doorprikt.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het hart uit de longen.</li>
	<li>Plaats de longen een nacht fixatief. OPMERKING: De duur van het fixatief varieert afhankelijk van downstream histologische studies.<ol>
<li>Plaats de longen in een conische buis van 50 ml met 20-25 ml fixatief. Plaats de draad die de luchtpijp vastmaakt door de opening van de conische buis en zet vast aan de draden van de dop. Keer de conische buis om om ervoor te zorgen dat de drijvende, aan de lucht opgeblazen longen volledig ondergedompeld blijven in fixatief, anders zullen ze naar de bovenkant van de vloeistof drijven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwerk de longen voor histologische studies.</li>
</ol>

<ol><li>Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Official+Research+Policy+Statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+Standards+for+Quantitative+Assessment+of+Lung+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li>
<li>Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+rapidly+frozen+lungs%3A+evaluation+on+the+basis+of+standard+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).</li>
<li>Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+of+lungs+for+structure-function+analysis%3A+credits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).</li>
<li>Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+volume-surface+area+relation+in+air-+and+saline-filled+lungs+fixed+by+vascular+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).</li>
<li>Harris, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-Volume+Curves+of+the+Respiratory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Care%22%5BJournal%5D)">Pressure-Volume Curves of the Respiratory System.</a> Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).</li>
<li>Bachofen, H., Schürch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+surface+forces+and+lung+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alveolar surface forces and lung architecture.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).</li>
<li>Mead, J., Takishima, T., Leith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+distribution+in+lungs%3A+a+model+of+pulmonary+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity.</a> Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).</li>
<li>Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Mechanical+Strain+Characterization+of+Ventilated+ex+vivo+Porcine+and+Murine+Lung+using+Digital+Image+Correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation.</a> Frontiers in Physiology. 11, 600492(2020).</li>
<li>Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li>
<li>Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Airway Macrophages.</a> American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).</li>
<li>Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+Macrophage+Distribution+in+a+Mouse+Model%3A+The+Importance+of+the+Fixation+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method.</a> Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).</li>
<li>Matulionis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+deformation+and+macrophage+displacement+in+smoke-exposed+and+normal+mice+%28Mus+musculus%29+following+different+fixation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+A%2C+Pathological+Anatomy+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures.</a> Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564(2012).</li>
<li>Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characteristics+of+the+chest+and+lungs+and+the+work+of+breathing+in+different+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species.</a> The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Methods+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Safety+Evaluation%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Principles and Methods of Immunohistochemistry.</a> Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel vaak gebruikt, verdringen intratracheale fixatiemethoden leukocyten uit de luchtwegen en kunnen ze de normale longarchitectuur veranderen. De methode van luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie die in dit protocol wordt gegeven, overwint deze valkuilen en behoudt nauwkeuriger de longanatomie. De sleutels tot het verkrijgen van hoogwaardig weefsel uit de vasculaire perfusie-fixatiemethode omvatten zorgvuldige monitoring van luchtinflatiedrukken, het vermijden van luchtlekken en het zorgen voor een adequate pe...

Longhestologie vertegenwoordigt de gouden standaard voor het beoordelen van longarchitectuur tijdens gezondheid en ziekte en is een van de meest gebruikte hulpmiddelen door longonderzoekers1. Een van de meest kritische aspecten van deze techniek is de juiste isolatie en behoud van longweefsel, omdat variabiliteit in deze stap kan leiden tot slechte weefselkwaliteit en onjuiste resultaten1,2,3. Bij levende dieren wordt het longvolume bepaald door de balans tussen de naar binnen gerichte elastische terugslag van de long en de naar buiten gerichte krachten die door de borstwand en het middenrif worden overgedragen door oppervlaktespanning. Dienovereenkomstig, wanneer de thorax wordt binnengegaan, gaan de uiterlijke krachten verloren en klapt de long in. Histologische secties bereid uit ingeklapte longen hebben een druk uiterlijk en grenzen tussen anatomische compartimenten (d.w.z. luchtruimen, vasculatuur en interstitium) kunnen moeilijk te onderscheiden zijn. Om deze uitdaging te omzeilen, blazen onderzoekers vaak de longen op tijdens chemische fixatie, zodat de grootte en architectuur van het luchtruim behouden blijven.
Longen kunnen worden opgeblazen met lucht of vloeistof. De druk die nodig is om de longen tot hetzelfde volume op te blazen, verschilt tussen lucht- en vloeistofinflatie als gevolg van intermoleculaire krachten op het lucht-vloeistofinterface. Hogere druk (bijv. 25 cmH2O) is vereist tijdens luchtinflatie dan vloeistofinflatie (bijv. 12 cmH2O) om oppervlaktespanning te overwinnen en de ingeklapte longblaasjes te openen4. Zodra longblaasjes zijn gerekruteerd, kan een lagere druk de longblaasjes openhouden tot hetzelfde volume als de druk-volumecurveplateaus, en de druk egaliseert in de hele long volgens de wet van Pascal4,5,6,7,8.
Er bestaan twee belangrijke methoden voor longinflatie en fixatie om muizenlongen te behouden voor histologie. Meestal zijn de luchtruimen doordrongen van vloeistof - vaak met een fixatief. Het grote voordeel van deze aanpak is dat het relatief eenvoudig is en weinig training vereist. Hoewel intratracheale instillatie van fixatief de voorkeur kan hebben in studies die zich richten op de vasculatuur, heeft vloeistof die via de luchtpijp wordt ingebracht de neiging om proximale luchtwegcellen en mucines in meer distale luchtruimgebieden te duwen, terwijl luchtinflatie niet1,3,4,9,10,11. Bovendien verandert onbedoelde onthechting van leukocyten van het epitheel tijdens vloeibare inflatie hun morfologie, waardoor ze artefactueel een eenvoudig, afgerond uiterlijk krijgen4,10,11,12. Ten slotte kan inflatie van de longen met vloeistof onbedoeld het interstitium4,10,11comprimeren. Samen kunnen deze factoren de normale anatomie en cellulaire verdelingen in de bewaarde longen verstoren, waardoor de techniek wordt beperkt.
Een alternatieve methode voor weefselbehoud is vasculaire perfusie-fixatie. Bij deze methode wordt fixatief via de vena cava of de rechter ventrikel in de pulmonale vasculatuur geperfundeerd. Deze methode behoudt de locatie en morfologie van cellen in het luchtruim lumen. Tenzij de longen echter worden opgeblazen tijdens perfusiefixatie, zal het longweefsel waarschijnlijk instorten.
Luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie maakt gebruik van sterke punten van elk van de bovenstaande fixatietechnieken. Hierin geven we een protocol voor deze techniek. De benodigde materialen en apparatuur zijn relatief goedkoop en kunnen eenvoudig worden verkregen en gemonteerd. De voltooide opstelling, weergegeven in figuur 1A,zorgt voor een constante luchtwegdruk op de longen door middel van een verstelbare, met vloeistof gevulde kolom, terwijl een peristaltische pomp fixatief levert via de rechter ventrikel. Longen met geconserveerde morfologie kunnen dan verder worden verwerkt voor structuur-functieanalyses.

<table><tbody><tr><td>00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>Mfr # VPB1000050N &ndash; Item # EW-00117-XF</td><td>Stopcock</td></tr><tr><td>BD 60 mL syringe, slip tip</td><td>BD</td><td>309654</td><td>Spuit gebruikt voor het maken van de waterkolom</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td>Naald voor vasculaire perfusie/fixatie</td></tr><tr><td>Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer</td><td>Nordson Medical</td><td>FTLLBMLRL-1</td><td>Female Luer</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td>Heparine oplossing.</td></tr><tr><td>Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge</td><td>BD Biosciences</td><td>427564</td><td>Luer-Stub Adapter</td></tr><tr><td>Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee</td><td>Nordson Medical</td><td>LT787-9</td><td>Male Luer</td></tr><tr><td>Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8000-9020</td><td>Tubing</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>Fixatieoplossing. Verdund tot 4% met fosfaatgebufferde zoutoplossing</td></tr><tr><td>Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker</td><td>Permatex</td><td>81724</td><td>Siliconomlegging voor luchtdicht afdichten van kamers</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Fles gebruikt voor het maken van de lucht-opblaaskamer en buffer gebruikt voor heparine en fixatieoplossingen</td></tr><tr><td>Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container</td><td>Sterilite</td><td>0342</td><td>Container voor dierverwerking</td></tr></tbody></table>

luchtinflatie van muizenlongen met vasculaire perfusie-fixatie

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Longhestologie wordt vaak gebruikt om de bijdragen van luchtruimcellen tijdens longhomeostase en pathogenese van ziekten te onderzoeken. Veelgebruikte fixatiemethoden op basis van instillatie kunnen echter luchtruimcellen en slijm in terminale luchtwegen verplaatsen en de weefselmorfologie veranderen. Ter vergelijking: vasculaire perfusie-fixatietechnieken zijn superieur in het behoud van de locatie en morfologie van cellen in luchtruimen en de mucosale bekleding. Als positieve luchtwegdruk echter niet tegelijkertijd wordt toegepast, kunnen delen van de longen instorten en kunnen haarvaten uitpuilen in de alveolaire ruimtes, wat leidt tot vervorming van de longanatomie. Hierin beschrijven we een goedkope methode voor luchtinflatie tijdens vasculaire perfusie-fixatie om de morfologie en locatie van luchtweg- en alveolaire cellen en interstitium in muizenlongen te behouden voor downstream histologische studies. Constante luchtdruk wordt via de luchtpijp aan de longen afgegeven vanuit een afgesloten, met lucht gevulde kamer die de druk handhaaft via een instelbare vloeistofkolom terwijl het fixatief door de rechter ventrikel wordt geperfundeerd.

In een intacte thorax worden de longen opengehouden door naar buiten gerichte krachten die door de borstwand worden uitgeoefend via de pleurale ruimte6,14. Wanneer het diafragma tijdens de dissectie wordt betreden, wordt de integriteit van de pleurale ruimte opgeheven en moeten de longen instorten (Figuur 2A, 2B). Om de longen opnieuw uit te zetten, wordt luchtinflatie uitgevoerd. Als eerste stap wordt 25 cm waterdru...

Gepresenteerd is een methode voor luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie van de longen die de locatie van cellen in luchtwegen, longblaasjes en interstitium behoudt voor structuur-functieanalyses. Constante luchtwegdruk wordt gehandhaafd met een luchtinflatiekamer, terwijl fixatief wordt toegediend via de rechter ventrikel. Longen worden verwerkt voor histologische studies.

Luchtinflatie van muizenlongen met vasculaire perfusie-fixatie

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Dit is een goedkope methode die de voordelen van luchtinflatie en vasculaire perfusiefixatie combineert voor het behoud van longen voor structurele en functionele analyses. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het behoud van zowel celmorfologie als locatie binnen het luchtruim van de long. Voorzichtigheid is het nodig om de lokstempadapter in de luchtpijp en de perfusiesnaald in de rechterkamer te plaatsen om voldoende inflatie en fixatie te garanderen.Om het luchtinflatieapparaat in te stellen, plaatst u een spuit voor de waterkolom in een ringhouder en meet u een verticale hoogte van 25 centimeter van het dierenplatform tot 25 centimeter op de waterkolom. Bevestig aan het uiteinde van de waterkolombuis aan de stopkraan op de luchtkamer en bevestig een buis van het vrouwelijke kunstaas van de luchtkamer aan de stopkraan op de dierverwerkingscontainer. Controleer of de dop naar de luchtkamer en de stopkraan aan de buitenkant van de dierverwerkingscontainer gesloten zijn en dat de stopkraan op de buis die van de waterkolom naar de luchtinflatiekamer leidt, open is.Vul vervolgens de spuit met water tot de 25 centimeter markering. Water zal door de spuit en slang in de luch

air-inflation-of-murine-lungs-with-vascular-perfusion-fixation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, we describe the procedure to isolate and chemically fix the mouse pulmonary value in closed conformation via perfusion pressurization.

Pressure Fixation of Isolated Murine Pulmonary Valve: A Procedure to  Isolate and Chemically Fix the Mouse Pulmonary Valve in Closed Conformation

Hypoxische pulmonale vasoconstrictie (HPV) is een belangrijk fysiologisch fenomeen waarbij bij alveolaire hypoxie longperfusie wordt afgestemd op beademing. Het belangrijkste vasculaire segment dat bijdraagt aan HPV is de intra-acinaire slagader. Hier beschrijven we ons protocol voor de analyse van HPV van muriene longvaten met diameters van 20-100 μm.

Videomorfometrische analyse van hypoxische pulmonale vasoconstrictie van intrapulmonale slagaders met behulp van murineprecisie gesneden longschijfjes

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.

Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

Het doel van dit artikel is om eenvoudige methoden die sterk zal helpen bij de opzet en analyse van de muis longen met longkanker of andere aandoeningen te beschrijven. We presenteren 3 protocollen eenvoudig en betrouwbaar uit te voeren long instillaties, fixatie, en longvolume metingen.

Instillatie en Fixatie Methoden Nuttig in Mouse Lung Cancer Research

Interne longoppervlakte (ISA) is een kritisch criterium voor de beoordeling van longmorfologie en fysiologie bij longziekten en schade-geïnduceerde alveolaire regeneratie. We beschrijven hier een gestandaardiseerde methode die de metafora voor ISA kan minimaliseren in zowel longpneumonectomy als protes implantatie muis modellen.

Een gestandaardiseerde methode voor het meten van het interne longoppervlak door middel van muizenpneumonectomy en prothese implantatie

Hier gepresenteerd is een nuttig protocol voor Long fixatie die een stabiele aandoening creëert voor histologische evaluatie van Long specimens uit een muismodel van emfyseem. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat het veel longen met dezelfde constante druk kan oplossen zonder longcollaps of deflatie.

Long fixatie onder constante druk voor de evaluatie van emfyseem bij muizen

Het doel van deze methode is om een eenvoudige en efficiënte methode voor de perfusie, inflatie en fixatie van muislongen te presenteren voor het onderzoek van longtumorpathologie en evaluatie van uitzaaiingen naar de long.

Perfusie en inflatie van de muislong voor tumor histologie

Het doel van deze techniek is ex vivo visualisatie van longslagaderlijke netwerken van vroege postnatale en volwassen muizen door middel van longinflatie en injectie van een radio-ondoorzichtige polymeer-gebaseerde verbinding via de longslagader. Mogelijke toepassingen voor gegoten weefsels worden ook besproken.

Vasculaire casting van volwassen en vroege postnatale muislongen voor micro-CT-beeldvorming

Gecombineerde ozon- en bacteriële endotoxine blootgestelde muizen vertonen wijdverspreide celdood, waaronder die van neutrofielen. We zagen cellulaire aanpassingen zoals verstoring van cytoskelet lamellipodie, verhoogde cellulaire expressie van complexe V ATP synthase subeenheid β en angiostatine in broncho-alveolaire lavage, onderdrukking van de immuunrespons van de longen en vertraagde neutrofiele rekrutering.

Visualiseren van long cellulaire aanpassingen tijdens gecombineerde ozon en LPS geïnduceerde murine acute longletsel

Het doel is om een nieuw ex vivo longperfusie (EVLP) model bij ratten te ontwikkelen dat 4 uur lang een consistente longfunctie kan handhaven gedurende EVLP en de industrie te voorzien van implementatiedetails die een stevige methode bieden voor het toepassen van EVLP op knaagdiermodellen.

Oprichting van een nieuw Ex Vivo longperfusiesysteem voor rattenlongen na circulatoire dood

We presenteren een methode voor een schimmelpathogenesemodel dat de natuurlijke positionering van schimmelsporen in de longluchtwegen behoudt voor analyse via fluorescentiemicroscopie.

Efficiënte methode voor het in beeld brengen van muizenlongen die de ruimtelijke dynamiek van schimmelsporen in de luchtwegen behoudt

Leer een kosteneffectieve methode voor luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie in muizenlongen. Deze techniek behoudt celmorfologie en ruimtelijke locatie voor histologische analyse.

Luchtinflatie van muizenlongen met vasculaire perfusie-fixatie

Meer video's verkennen