Dubbele etikettering van immunofluorescentie met behulp van antilichamen van dezelfde soort om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen

In dit protocol kunnen twee antilichamen van dezelfde gastheer samen worden gebruikt in de immunofluorescentietest om gastheercel- en pathogeeninteracties te bestuderen. Omdat er slechts enkele commerciële antilichamen beschikbaar zijn om specifieke celstructuren en eiwitten in parasieten te herkennen, kan dit protocol zeer nuttig zijn. Dit is een eenvoudig uit te voeren dubbel labelend immunofluorescentieprotocol dat polyklonale en monoklonale antilichamen gebruikt die in dezelfde soort zijn gekweekt.

Veel onderzoekers zijn zich er misschien niet van bewust dat dit mogelijk is. Deze aanpak helpt wanneer de bron van antilichamen beperkt is. Het kan worden gebruikt om de pathogenen in de gastheerceleiwitten in geïnfecteerde gastheercellen te detecteren en kan ook worden toegepast op vrije levende organismen.

Dit is een eenvoudig protocol, vereist één blokkerende stap tussen het eerste en tweede paar antilichamen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Camila Gachet-Castro en promovendus Lays Trajano-Silva uit mijn laboratorium. Drie dagen na het infecteren van LLC-MK2-cellen met Trypanosoma cruzi, verzamel het supernatant van de geïnfecteerde cellen in een conische buis van 15 milliliter celkweek.

Centrifugeer het monster om celresten te verlagen en plaats de buis vervolgens op kamertemperatuur zodat de trypomastigoten naar het supernatant kunnen zwemmen. Verzamel na 10 minuten het supernatant in een nieuwe conische buis, centrifugeer vervolgens het monster en gooi het supernatant weg voordat u de pellet met de parasieten in volledig RPMI-medium resuspendeert. Voeg LLC-MK2-cellen toe in 24-putplaten met UV-gesteriliseerde afgeronde coverslips en laat de & m gedurende 16 uur bezinken.

Voeg vervolgens, om de cellen te infecteren, supernatant met T.Cruzi toe aan elke put en incubeer gedurende zes uur. Was vervolgens de coverslips met de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen vijf keer met PBS en fixeer de cellen vervolgens met 2% paraformaldehyde in PBS. Was na 10 minuten de coverslips drie keer gedurende vijf minuten elk met PBS en permeabiliseer vervolgens de coverslips met niet-ionisch wasmiddel gedurende 10 minuten.

Na drie PBS-wasbeurten van vijf minuten incubeer je de coverslips in blokkerende oplossing gedurende 30 minuten, gevolgd door nog eens 30 minuten incubatie met een monoklonaal of polyklonaal antilichaam van de muis. Nadat PBS wast, incubeer de coverslips gedurende 30 minuten met secundair antilichaam in blokkerende oplossing en falloïdine om actinefilamenten in de gastheercel te kleuren. Was vervolgens de coverslips nog drie keer met PBS voordat u een kleine hoeveelheid anti-fade montagereagens met DAPI-medium op het oppervlak van de dia aanbrengt.

Gebruik een tang om de coverslip voorzichtig in het medium te kantelen om bubbelvorming te voorkomen. Voor dubbele etikettering, na het incuberen van de coverslips in blokkerende oplossing zoals eerder aangetoond, incubeer ze gedurende 30 minuten in het polyklonale antilichaam van de muis. Was vervolgens de coverslips drie keer gedurende vijf minuten elk met PBS voordat u ze gedurende 30 minuten met het secundaire antilichaam incubeert.

Voer vervolgens na drie PBS-wasbeurten een tweede blokkeringsstap uit met AffiniPure konijn anti-muis IgG verdund in blokkerende oplossing. Was de coverslips na 30 minuten opnieuw met PBS voordat u ze nog eens 30 minuten incubeert met het monoklonale antilichaam van de muis. Incubaleer vervolgens na drie PBS-wasbeurten de coverslips met geitenantimuis IgG 2B-antilichaam en falloïdine.

Breng vervolgens na drie PBS-wasbeurten anti-fade montagereagens aan zoals eerder is aangetoond. Voor drievoudige etikettering, na het blokkeren van de coverslips en het broeden met het polyklonale antilichaam van de muis, gevolgd door geitenantilichaam tegen muizen, start een nieuwe incubatie met konijn polyklonaal antilichaam in blokkerende oplossing gedurende 30 minuten. Incubeer vervolgens na drie PBS-wasbeurten de dekenslips met geitenantilichaam tegen konijnen gedurende 30 minuten.

Voer vervolgens, na drie PBS-wasbeurten, een blokkerende stap uit met AffiniPure konijn anti-muis antilichaam verdund in blokkerende oplossing gedurende 30 minuten. Was vervolgens de dekmantels opnieuw voordat u gedurende 30 minuten broedt met een monoklonaal IgG-subklasse antilichaam van de muis. Na drie PBS-wasbeurten incubeer je de coverslips gedurende 30 minuten met een specifiek paar geitenantimuis IgG-subklasse-antilichamen.

Was na de incubatie de deklipjes driemaal gedurende vijf minuten met PBS. Analyseer de immunofluorescente monsters met behulp van een confocale microscoop met een 63X olie-onderdompelingsobjectief en detecteer de fluorescentie met een fotomultiplicatorbuis en hybride detector. Verkrijg vervolgens alle confocale afbeeldingen met gescheiden kanalen en voer beeldverwerking uit met Adobe Photoshop.

Deze confocale microscopiebeelden tonen resultaten met de controle-experimenten van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen die de specificiteit van de antilichamen in de gastheercel en de geïnternaliseerde parasiet benadrukken. Het polyklonale antilichaam anti-Trypanosoma cruzi FAZ van muizen herkende het T.cruzi-reuzeneiwit in de flagellumaanhechtingszone bij de parasiet flagellum, maar niet in de gastheercel. Verdeling van het heterogene nucleaire ribonucleoproteïne A1 in de kernen werd waargenomen met behulp van een commercieel monoklonaal antilichaam van muizen dat alleen de gastheer zoogdiercellen herkent, maar niet de parasiet.

Ook werden de gastheer- en parasietkernen en de parasiet kinetoplasten gekleurd met DAPI en gastheer F-actine werd gekleurd met falloïdine geconjugeerd aan Alexa 594, wat de specificiteit van de antilichamen bevestigde. Double-labeling immunofluorescentie toont de eiwitverdelingen in de gastheer en de parasiet geanalyseerd door confocale microscopie. De etikettering suggereerde geen kruisreactie tussen antilichamen met behulp van deze methodologie.

Samenvattend biedt het hier beschreven protocol om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen een eenvoudige en uitgebreide techniek die kan worden aangepast aan elke combinatie van antilichamen. Deze aanpak maakt immunofluorescentie kosteneffectief en kan helpen bij het bestuderen van de lokalisatie van twee of meer eiwitten van belang wanneer er weinig antilichamen beschikbaar zijn.