Real-time intravitale multifotonenmicroscopie om gerichte echografie en microbubbelbehandelingen te visualiseren om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te vergroten

Echografieblootstelling in de aanwezigheid van microbubbels is naar voren gekomen als een effectieve methode om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière tijdelijk en lokaal te verhogen. Normaal gesproken belemmert de bloed-hersenbarrière de levering van potentiële geneesmiddelen voor verschillende hersenziekten. Na ultrasoonapparaat beginnen de geïnjecteerde microbubbels te oscilleren en veroorzaken ze spanning op de vaatwand, waardoor tight junctions worden geopend en uiteindelijk geneesmiddelen de bloed-hersenbarrière kunnen passeren In preklinische modellen wordt het effect van echografie en microbubbelbehandeling vaak bestudeerd door contrastversterkte magnetische resonantiebeeldvorming of door extravasatie van kleurstoffen ex vivo te bestuderen.

Het nadeel van deze aanpak is dat de real-time respons tijdens en direct na echografie niet kan worden verkregen. Intravitale multifoton beeldvorming van de hersenen geeft de mogelijkheid om deze effecten in real time te bestuderen. In de volgende video zullen we stapsgewijze instructies presenteren over het plaatsen van een schedelvenster in een muis en het uitvoeren van ultrasone microbubbelbehandeling met behulp van een ringtransducer die op de schedel is gemonteerd.

Deze procedure maakt gelijktijdige ultrasoonapparaat en in vivo multifotonbeeldvorming mogelijk. Om te beginnen met het voorbereiden van de materialen die nodig zijn voor de craniale raamchirurgie en ultrasone microbubbelbehandelingen. In deze video laten we een acute niet-herstellende schedelraamoperatie zien.

Voor chronisch herstel zijn craniale raamchirurgie, gesteriliseerde gereedschappen en materialen, een steriele chirurgische ruimte en geschikte medicijnen noodzakelijk. Voorafgaand aan de operatie anesthesie en analgesie toedienen. Verwijder de vacht op het hoofd.

Plaats het dier in een stereotaxisch frame. Breng een katheter in de staartader voor dextran- en microbubbelinjecties. Houd de kerntemperatuur van het dier op 37 graden met behulp van een warmtebron.

Hier gebruiken we een handschoen gevuld met warm water. Om de hoofdhuid te verwijderen, tilt u de huid tussen de ogen op met een tang en snijdt u langs de sagittale hechting. Verwijder het botvlies dat het buitenoppervlak van de schedel bedekt met een wattenstaafje.

Markeer daarna de gewenste locatie van het schedelvenster op de schedel en begin met boren langs de omtrek. Om te voorkomen dat de schedel oververhit raakt tijdens het boren, druppelt u zoutoplossing op de schedel met behulp van een spuit of brengt u een stuk chirurgische spons aan dat is gedrenkt in zoutoplossing. Wissel af tussen het boren en koelen van de schedel.

Controleer de voortgang van het boren door zachte druk uit te oefenen op het boteiland. Verwijder het boteiland met een tang. Zorg ervoor dat de hersenen vochtig worden gehouden door een stuk chirurgische spons te gebruiken dat vooraf is voorgekookt in zoutoplossing.

Om een schedelraam te plaatsen, plaatst u een druppel zoutoplossing aan één kant van een dekplaat en manoeuvreert u deze over het gat in de schedel. Verspreid een laag lijm rond de omtrek van de deklip om deze aan de schedel te bevestigen. Zodra de lijm volledig droog is, deponeert u de agarose-oplossing op het raam en plaatst u de transducer erop.

Oefen stevige druk uit zodat er minimale agarose is tussen de transducer en het schedelvenster. Wanneer de agarose is afgekoeld tot een Jell-O-achtige consistentie, snijdt u de overtollige agarose weg van de omtrek van de dekplaat van de transducer. Verspreid een laag lijm over de omtrek van de deklip van de transducer om deze aan de schedel te hechten.

Nadat de lijm volledig is opgedroogd, plaatst u het dier onder de objectieflens van de microscoop. Zorg ervoor dat het objectief niet botst met de transducer of coverslip. Selecteer een gezichtsveld in de multifotonenmicroscoop.

Stel een beeldscan van de vasculatuur in en begin met ultrasoonapparaat. Voor dit protocol gebruiken we een ringomvormer die wordt bediend met een aandrijffrequentie van 0,82 megahertz, 10 millisecondecycli mechanisch geïndexeerd van 0,2 tot 0,4 en pulsherhalingsfrequenties tussen één en vier Hertz. Sonovue microbubbels worden geïnjecteerd in een dosis van één milliliter per kilogram.

Succesvolle ultrasone microbubbelbehandelingen kunnen worden gedetecteerd door de extravasatie van fluorescerend dextran van het intravasculair naar de extravasculaire ruimte, wat wijst op een toename van de BBB-permeabiliteit. Om de kinetiek van dextranlekkage te evalueren als een representatief model voor medicijnafgifte, kan de signaalintensiteit tussen de intra- en extravasculaire ruimten worden geëvalueerd met behulp van hulpmiddelen zoals MATLAB. Om de vasculaire veranderingen geïnduceerd door ultrasone microbubbelbehandelingen te evalueren, kan de diameter van het vat van belang worden gemeten voor, tijdens en na ultrasone microbubbelbehandeling.

Beeldanalyse kan worden uitgevoerd met behulp van software zoals ImageJ, FIJI of programmeertools. Hier werd Imaris gebruikt voor bloedvatsegmentatie en classificatie. Intravitale multifotonenmicroscopie van de hersenen in combinatie met ringtransducers bieden een methode om de effecten geïnduceerd door ultrasone microbubbelbehandeling in realtime te volgen bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Kwantitatieve en kwalitatieve gegevens kunnen worden verkregen om bijvoorbeeld extravasatiekinetiek en vasculaire veranderingen te bestuderen. De hier gepresenteerde experimentele methode kan worden toegepast op verschillende onderzoeksmodellen en op verschillende ultrasone toepassingen.