Deeltjessjabloonemulgering maakt microfluïdische druppeltests mogelijk

Digitale druppel PCR biedt verbeterde nauwkeurigheid en gevoeligheid in vergelijking met kwantitatieve PCR. Dit is een eenvoudige methode voor digitale druppel PCR die minimale apparatuur en geen expertise vereist. Deeltjessjabloonemulgering is een microfluïdische emulgeringsmethode waarvoor geen gespecialiseerde apparatuur nodig is.

Bovendien vindt emulgering plaats over een periode van seconden en schaalt deze op tot containervolume. Voeg voor commerciële kralen 0,5 gram gedroogde polyacrylamidedeeltjes toe die compatibel zijn met deeltjessjabloonemulgering of PTE aan 30 milliliter steriel water in een conische buis van 50 milliliter en meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Voor de microfluïdische fabricage van kralen, giet een milliliter fotoresist op het midden van een drie-inch silicium wafer en draai het vervolgens op 500 RPM gedurende 30 seconden, gevolgd door 1250 RPM gedurende 30 seconden. Plaats de wafer gedurende 15 minuten op een kookplaat die is ingesteld op 95 graden Celsius om het oplosmiddel te verdampen. Bevestig het fotomasker op de siliciumwafer met een schuifglas en stel de wafer gedurende 2,5 minuten bloot onder een gecollimeerde UV-LED.

Plaats de wafel vijf minuten op een kookplaat die is ingesteld op 95 graden Celsius om na blootstelling te bakken. Ontwikkel de fotoresist siliciumwafer door deze gedurende maximaal 15 minuten onder te dompelen in een bad van 100% PGMEA. Spoel de wafel af met verse 100%PGMEA, gevolgd door 100%isopropanol.

Droog de wafel aan de lucht, droog hem vervolgens gedurende één minuut op een kookplaat die is ingesteld op 95 graden Celsius en plaats hem in een schone petrischaal van drie inch. Meng de PDMS-siliciumbasis en het uithardingsreagens in een verhouding van 10:1 en ontgas vervolgens de gemengde PDMS met behulp van een exsiccator onder vacuüm totdat er geen luchtbellen waarneembaar zijn. Giet het ontgaste PDMS in de petrischaal, zodat de siliciumwafer volledig onder water komt te staan.

Ontgas de siliciumwafer en PDMS en hard vervolgens de PDMS uit door de siliciumwafer gedurende ten minste 60 minuten in een oven te plaatsen die is ingesteld op 65 graden Celsius. Verwijder een blok PDMS met de microfluïdische kenmerken uit de petrischaal met behulp van een scalpel. Pons de inlaten en de uitgangen in het PDMS-blok met behulp van een biopsiespons van 0,75 millimeter.

Verwijder vervolgens stof en deeltjes met het herhaaldelijk aanbrengen en verwijderen van verpakkingstape naar het blokoppervlak. Reinig een glasplaat door deze af te spoelen met 100% isopropanol en vervolgens het oppervlak aan de lucht te drogen. Plasma behandelt zowel de glasplaat als het PDMS met één millibar zuurstofplasma gedurende één minuut, met behulp van een plasmabindingsmiddel.

Bevestig de PDMS op de glasplaat door de plasmabehandelde PDMS met functies naar beneden gericht op de glasplaat te plaatsen, plasmabehandelde zijde naar boven gericht. Plaats de schuif minstens 30 minuten in een oven die op 65 graden Celsius is ingesteld om de hechting te voltooien. Behandel alle microfluïdische kanalen met een gefluoreerde oppervlaktebehandeling om hydrofobiciteit van het oppervlak te garanderen en bak het apparaat vervolgens gedurende ten minste 10 minuten op 65 graden Celsius.

Laad zowel polyacrylamide, of PAA, als fluorwaterstof, of HFE, oplossingsbevattende spuiten in spuitpompen. Sluit beide spuiten aan op het microfluïdische apparaat met behulp van polyethyleen buizen. Voer het druppelgeneratie-apparaat uit en verzamel een milliliter van de druppels in een opvangbuis van 15 milliliter en incubeer vervolgens gedurende drie uur bij kamertemperatuur voor polymerisatie.

Verwijder na de incubatie de onderste laag olie door te pipetteren. Voeg een milliliter van 20% PFO in HFE-olie toe aan de opvangbuis van 15 milliliter als chemische demulgator. Draai na het mengen de 15-milliliter opvangbuis gedurende twee minuten op 2000 x g.

Verwijder de onderste laag door te pipetteren en herhaal het proces nog een keer. Voeg twee milliliter 2%sorbitanmonooleaat in hexaan toe aan de 15-milliliter verzamelbuis en vortex het. Draai de buis gedurende drie minuten op 3000 x g en verwijder het supernatant door te pipetteren om de oppervlakteactieve oplossing te verwijderen.

Herhaal dit twee keer. Voeg vijf milliliter TEBST-buffer toe en meng goed, draai dan drie minuten op 3000 x g en verwijder het supernatant door te pipetteren. Herhaal dit drie keer en geef het vervolgens opnieuw op in vijf milliliter TEBST.

Bereid de polyacrylamidedeeltjes voor op emulgering van deeltjes door gedurende één minuut te centrifugeren bij 6000 x g om de deeltjes te pelleteren. Verwijder vervolgens het supernatant door te pipetteren en resuspend de pellet in steriel water. Herhaal dit drie keer om ervoor te zorgen dat eventuele resterende TEBST wordt verwijderd.

Bereid de disperse fase voor in een verse centrifugebuis van 15 milliliter, met behulp van een PCR-mastermix, de juiste primers en een fluoresceïnehydrolysesonde, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten onder voorzichtig roeren, met behulp van een buisrotator. Centrifugeer de dispergeerfase gedurende één minuut bij 6000 x g en verwijder het supernatant.

Voeg een microliter Saccharomyces cerevisiae genomisch DNA toe aan de pellet en meng grondig door pipetteren of krachtig tappen. Voeg 200 microliter 2% fluorosurfactant in HFE-olie toe aan de buis, voor emulgering. Maak de pellet los door de buis te pipetteren of te tikken en vortex vervolgens bij 3000 RPM gedurende 30 seconden.

Laat de emulsies een minuut bezinken, verwijder vervolgens 100 microliter van de onderste oliefase en vervang dit volume door verse 2% fluorosurfactant in HFE-olie. Keer de buis voorzichtig meerdere keren om om te mengen. Herhaal dit drie keer of meer, totdat kleine satellietdruppeltjes zijn verwijderd.

Verwijder na twee tot vijf minuten bezinken de onderste oliefase. Vervang dit volume door 5%fluorosurfactant in fluorkoolstofolie. Pipetteer 100 microliter monster in PCR-buizen van 200 microliter en plaats de PCR-buizen in een thermocycler.

Pipetteer het monster op een telglaasje voor fluorescerende beeldvorming en stel het monster af. Emulgering met deeltjessjabloon biedt uitstekende monodispersiteit. Naarmate het overtollige supernatant wordt verwijderd, wordt een stabiliserende oppervlakteactieve stof toegevoegd en wordt het monster vortexed om de emulsie te genereren.

De resulterende druppels bestaan uit deeltjeskern en waterig monster met reagentia en monstermoleculen of cellen die nodig zijn voor de reactie. Polydispersed druppels met templating deeltjes duiden op onvoldoende vortex. Een ander probleem is het genereren van overmatige satellieten, die de inkapselingsefficiëntie verlagen.

Satellieten mogen niet meer dan 10% van het totale ingekapselde monstervolume uitmaken. Ze kunnen uit de emulsie worden verwijderd door te wassen met verse olie. Het nut van PTE kan worden aangetoond in digitale PCR wanneer druppels met versterkte doelen fluorescerend worden, waardoor directe kwantificering van doelen mogelijk is.

De fluorescerende druppels leveren weinig positieven op wanneer het doelwit zeldzaam is, en veel wanneer het overvloedig aanwezig is. Deze resultaten zijn herhaalbaar met behulp van in de handel verkrijgbare polyacrylamidedeeltjes, waardoor nauwkeurige metingen over hetzelfde bereik worden bereikt. De verwijdering van supernatant uit de disperse fase is belangrijk voor de inkapseling van monsters.

Het kennen van het volume van de pellet en het supernatant kan helpen bij het identificeren van de interface tussen de twee. Bij twijfel, vergis je aan de kant van het verwijderen van het supernatant.