Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton
25 februari 2021
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van Spotiton, een nieuw robotsysteem, om twee interessante monsters af te leveren op een zelfafvoerend nanodraadrooster dat zich minimaal 90 ms mengt voorafgaand aan vitrificatie in vloeibaar cryogeen.
Met behulp van het Spotiton-robotsysteem kan men een interessant eiwit mengen en vitrificeren met een interagerende partner op een elektronenmicroscoopraster in slechts 90 milliseconden. Dit protocol maakt het mogelijk om tussenliggende eiwitbevestigingen vast te leggen die te vergankelijk zijn om te worden vastgelegd met standaard rastervoorbereidingstechnieken. Time resolved Spotiton kan sub-seconde biologische of biochemische systemen informeren, zoals membraankanaalactivatie, DNA- of RNA-synthese, of vroege interactie van een geneesmiddel of antilichaam met zijn doeleiwit.
De gebruiker moet tegelijkertijd verschillende componenten beheren die rechtstreeks van invloed zijn op de kwaliteit van een raster. Het is belangrijk om het systeem te begrijpen voordat u het gebruikt en geduld te hebben bij het voorbereiden van rasters. Open om te beginnen de hoofdklep op de stikstoftoevoertank en zorg ervoor dat het systeemreservoir wordt gevuld met ontgast ultrapijn water.
Schakel de computer en het Spotiton-systeem in bij de stekkerdoos met meerdere stopcontacten. Klik op het bureaubladpictogram om de gebruikersinterface van de Spotiton-software te openen. Selecteer in het menu Extra de optie Stadia initialiseren om de drieassige robots en roterende dispenserkopassemblage te initialiseren en te huiselen, zodat de dispenserpunten naar beneden wijzen voordat ze worden geïnitialiseerd en gehuldigd.
Klik in het hoofdmenu op Ga naar veilige positie om de robots naar de veilige positie te sturen. Selecteer op het tabblad Aspirate de optie Prime om de dispenserkoppen meerdere keren door te spoelen met water uit het reservoir. Ga door totdat er twee ononderbroken stromen water te zien zijn die uit de uiteinden komen.
Stuur op het tabblad Inspecteren tip één naar de inspectiecamera en test het bluswater, waarbij u de amplitude aanpast totdat discrete druppels worden geproduceerd. Druk op de opnameknop in de bovenste cameramonitor om een video op te nemen van het afvuren van tip één. Stuur tip twee naar de inspectiecamera.
Speel de video af van tip één die in de rechter monitor afvuurt op hetzelfde moment dat tip twee wordt afgevuurd in de bovenste cameramonitor, passend bij het patroon van druppelproductie van de twee dispensers. Verwijder het pincet van de houder op de rasterrobot met behulp van de meegeleverde inbussleutel. Plaats op een nabijgelegen tafelblad een nanodraad van het testraster aan de rand van het rasterblok.
Pak voorzichtig de rand van het rooster vast en plaats deze correct in het pincet. Monteer vervolgens het pincet opnieuw. Klik op het tabblad Cryo op Tip naar camera om tip één naar het gezichtsveld van de bovenste duikpadcamera te verplaatsen, zodat Live is geselecteerd in de bovenste cameramonitor.
Schakel het bovenste cameralampje in en pas het aan. Plaats tip één zichtbaar in de bovenste cameramonitor door met de muis in de monitor te klikken. Klik op Raster naar camera om het raster voor de bovenste camera te plaatsen en pas indien nodig de positie van tip één positie opnieuw aan.
Zorg er op het tabblad Cryo voor dat Vitrified Grid niet is geselecteerd, klik op Wachtrijdoel en vervolgens op Plunge. Evalueer de bovenste en onderste afbeeldingen om te bevestigen dat de dispensers normaal functioneren. Verdun twee monsters tot de gewenste concentraties met een geschikte buffer, idealiter met dezelfde voor beide, en vul de cryogene kom met vloeibare stikstof.
Plasma reinigt drie tot vier nanodraadroosters met vijf watt waterstof en zuurstof, en 1,5 minuut als uitgangspunt. Sluit de vernevelaar aan en observeer de damp die de centrale poort van de vernevelaardop verlaat. Observeer de Live Humidity Monitor in het hoofdvenster of open de Ambient Humidity Tracker onder Reports and Ambient.
Controleer de luchtvochtigheid in de kamer en de lijkwadezones. Voeg vijf microliter van elk monster toe aan de monsterbekers. Plaats de monsterbekers in de ophoudlade met een monster voor tip één aan de linkerkant en voor tip twee aan de rechterkant.
Duw vervolgens de lade terug in de machine totdat deze zit. Selecteer op het tabblad Aspirate drie microliters voor het volume dat door elke punt moet worden aangezogen. Zorg ervoor dat de monsterlade goed is geplaatst, klik op Aspirate en observeer hoe de pipettrap de dispenserkoppen in de monsterbekers verplaatst.
Controleer de succesvolle aspiratie van beide monsters door de monsterbekers te verwijderen en een daling van de vloeistofniveaus te observeren. Stuur op het tabblad Inspecteren elke tip naar de inspectiecamera om de onbelemmerde afgifte te bevestigen. Pas de amplitude indien nodig aan om de druppelvorming van elke punt te evenaren.
Laad een vers plasma gereinigd rooster in het pincet, maar monteer het pincet nog niet. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid wordt verhoogd tot ongeveer 90 tot 95%Vul de ethaanbeker en voer een laatste testvuur van beide tips uit voor de inspectiecamera, waarbij wordt bevestigd dat er geen obstructie is. Klik op het tabblad Cryo op Tip naar camera.
Controleer ethaanbeker. Als ethaanijs zich heeft gevormd, smelt dan indien nodig met extra ethaangas. Monteer het pincet met het rooster op de rastertrap.
Klik op het tabblad Cryo op Raster naar camera en zorg ervoor dat tip één correct in de bovenste cameramonitor is geplaatst. Klik op Vitrified Grid, Queue Target en vervolgens Plunge. Klik op OK wanneer u wordt gevraagd de rasterrobot opdracht te geven om het raster van ethaan in vloeibare stikstof te hoppen en op de ondergedompelde plank vrij te geven.
Onderzoek afbeeldingen van het raster om te beslissen of het moet worden bewaard of weggegooid. Als u het rooster houdt, koelt u de tang met fijne punt vooraf, pakt u het raster voorzichtig bij de rand en plaatst u het in een roosterkastsleuf, te beginnen met de eerste sleuf aan de linkerkant van de inkeping en met de klok mee. Gebruik de experimenteerviewer om de rasterbeelden van de bovenste en onderste camera's te bekijken en te vergelijken, samen met de apparaatinstellingen en vochtigheidsmetingen op het moment van de duik door Rapporten en experiment te selecteren.
Beelden van rasters die tijdens een enkele tijd opgeloste Spotiton-sessie zijn gemaakt door RNA-polymerase te mengen in een DNA-oligomeer van 105 basenparen dat gedurende 150 milliseconden voorafgaand aan vitrificatie een promotorsequentie draagt, worden hier getoond. Van de zes rasters vertoont er slechts één suboptimale wicking. Het patroon van ijsafzetting op een verglaasd raster komt nauw overeen met het patroon van afgezette vloeistof dat te zien is in het bovenste camerabeeld.
Effectieve afvoer van de gemengde monsters vindt plaats langs de met nanodraad bedekte rasterbalken waar het monster zelden overloopt in vierkanten naast die waarin het is geland. In met ijs gevulde vierkanten is het ijs meestal het dikst in gaten in het midden van het vierkant en wordt het dunner in gaten dichter bij de rasterbalken. Gaten direct naast de rasterbalken zijn vaak leeg, vanwege de nabijheid van de nanodraden.
Een goede voorbereiding en behandeling van de nanodraadroosters zorgt voor een goede ijsdikte op gemengde monsterroosters. Het Spotiton-systeem stelt de gebruiker ook in staat om de twee monsters afzonderlijk op één rooster te deponeren, waardoor een ongemengde regeling tijdens dezelfde netonderhoudssessie kan worden verzameld. Spotiton heeft het mogelijk gemaakt om de eerste tussenproducten in bacteriële genexpressie in realtime vast te leggen.
Omdat ze zich vormen op een tijdschaal van minder dan een seconde, waren hun structuren tot nu toe onbekend.
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol dat gebruikmaakt van het Spotiton robotsysteem voor het snelle mengen en vitrificeren van eiwitten op een elektronenmicroscoopraster. De techniek legt tijdelijke eiwitconformaties vast die standaardmethoden niet kunnen, waardoor inzichten in dynamische biologische processen worden geboden.
Belangrijke studieonderdelen
Onderzoeksgebied
- Eiwitinteracties
- Tijdelijke conformaties
- Cryo-elektronenmicroscopie
Achtergrond
- Belang van het bestuderen van snelle eiwitinteracties
- Uitdagingen bij het vastleggen van tijdelijke toestanden
- Nut van vitrificatie in biologisch onderzoek
Gebruikte methoden
- Gebruik van het Spotiton-systeem voor het mengen en vitrificeren van monsters
- Toepassing omvat eiwit en interacterende partner op nanodraadrasters
- Snel mengen voor het vastleggen van intermediaten
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vitrificatie van gemengde eiwitmonsters in slechts 90 ms
- Efficiënt wikkelen langs nanodraadrasters waardoor de monsterintegriteit gewaarborgd blijft
- Duidelijke visualisatie van ijsdepositiepatronen die correleren met mengopbrengsten
Conclusies
- Deze studie toont effectief de bruikbaarheid van Time-resolved Spotiton bij het observeren van snelle biologische processen.
- De bevindingen verbeteren het begrip van eiwitdynamica en interacties die cruciaal zijn voor biologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Capturing transient molecular intermediates is a critical challenge in early-stage drug discovery and structural biology. The Spotiton robotic system enables time-resolved cryo-EM grid preparation, allowing R&D teams to interrogate rapid biomolecular interactions and conformational changes with high temporal precision. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of short-lived protein conformations relevant to target engagement.
- Supports mechanistic de-risking by capturing intermediate states in protein-ligand or protein-nucleic acid interactions.
- Facilitates functional target validation by revealing structural transitions on sub-second timescales.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological grids for downstream cryo-EM analysis with minimal sample volume.
- Standardizes grid preparation for reproducible, quantitative structural readouts.
- Enables rapid, scalable grid production to support high-throughput screening of molecular interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant mechanisms, informing translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Reduces ambiguity in structure-based drug design by capturing elusive intermediate states.
Pipeline & Workflow Integration
The Spotiton system integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging mechanistic interrogation with structural validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling capture of rapid molecular events and pathway transitions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cryo-EM grids for comparative analysis of compound or biomolecule effects.
- Analytics: Provides high-resolution structural data to inform condition comparisons and mechanistic hypotheses.
- Translational Research: Connects early structural findings to preclinical validation when disease-relevant systems are studied.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for repeated use across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable grid preparation for structural studies.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of discovery assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing transient states critical to biological function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM grid handling and robotic system operation.
- Needs access to Spotiton instrumentation and compatible nanowire EM grids.
- Demands rigorous calibration and cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation may be needed for different biomolecular systems or sample types.
- Grid quality is sensitive to humidity control, dispenser calibration, and sample preparation protocols.
