Name: Quadruple-Checkerboard: een wijziging van het driedimensionale dambord voor het bestuderen van medicijncombinaties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Leer de quadruple checkerboard-methode voor het testen van medicijncombinaties tegen multiresistente micro-organismen zoals E. coli ESBL. Deze efficiënte techniek analyseert alle mogelijke vierdrogcombinaties in één experiment.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Voorbereidingsstappen
<ol><li>Bereid Muller-Hinton bouillon (MHB) door 25 g MH bouillon toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water en meng. Autoclaaf bij 121 °C gedurende 2,5 uur. Bewaar de autoclaafmedia vervolgens op kamertemperatuur of in de koelkast.</li>
	<li>Subcultuur de bacteriën in kwestie (E. coli ESBL) op de agar media met behulp van de vier-kwadrant streaking methode en incuberen 's nachts bij 37 °C.<ol>
<li>Neem met behulp van een steriele lus één kolonie en verspreid deze in de eerste helft van de MacConkey-agarplaat door nauwe parallelle strepen te maken.</li>
		<li>Met behulp van de lus, verspreid de bacteriën in het tweede kwadrant door het uit het eerste kwadrant te strepen.</li>
		<li>Breid vanaf het tweede kwadrant de strepen in het derde kwadrant uit met behulp van nauwe parallelle strepen.</li>
		<li>Verspreid de bacteriën in het midden van het vierde kwadrant door het uit het derde kwadrant te strepen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Voorbereiding van het paneel
<ol><li>Plaats vier 96-put platen naast elkaar om een vierkant te vormen. Plak met behulp van een tape hun billen aan elkaar.</li>
	<li>Herhaal deze stap om vier panelen te verkrijgen die elk 4 platen bevatten en noem ze A1, A2, A3 en A4.</li>
	<li>Voeg 50 μL MH-bouillon toe aan de putten tussen kolom 2 en kolom 11 in de 16 96-putplaten van de vier panelen.</li>
	<li>Voeg 200 μL MH-bouillon toe aan de put H12 die dient als de negatieve controleput in de 16 96-putplaten van de vier panelen.</li>
	<li>Voeg 150 μL MH-bouillon toe aan de putten A1 en H1 die dienen als positieve controleputten in de 16 96-putplaten van de vier panelen.</li>
</ol>3. Geneesmiddel 1, Cefotaxime, seriële verdunning
<ol><li>Voeg aan een conische buis 15 ml steriele dH2O toe.<ol>
<li>Bereken het volume dat uit de voorraadoplossing van het geneesmiddel moet worden verwijderd volgens de formule C1V1 = C2V2. Dus V1 = (C2 x 15 ml) / C1. OPMERKING: In ons geval is de Cefotaxime-voorraadoplossing 105 μg/ml en C2 256 μg/ml; dus V1 = 38,4 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder het berekende volume van de 15 ml steriele dH2O en voeg vervolgens het medicijn toe.</li>
	<li>Pipet 50 μL van de bereide geneesmiddeloplossing in elke put in kolom 11 en kolom 12, behalve H12.</li>
	<li>Start de seriële verdunning door 50 μL uit kolom 11 te verwijderen en in de overeenkomstige putten in kolom 10 te plaatsen, en vervolgens van 10 tot het bereiken van kolom 2, waar de 50 μL uit kolom 2 zal worden weggegooid.</li>
	<li>Herhaal stap 3.4 en 3.5 voor alle 16 96-putplaten van de vier panelen.</li>
</ol>4. Geneesmiddel 2, Amkacine, seriële verdunning
<ol><li>Voeg aan een conische buis 10 ml steriele dH2O toe.</li>
	<li>Bereken het volume dat uit de voorraadoplossing van het geneesmiddel moet worden verwijderd volgens de formule C1V1 = C2V2. V1 = (C2 x 10 ml) / C1. OPMERKING: In ons geval is de Amikacine-voorraadoplossing 103 μg/ml en C2 64 μg/ml; dus V1 = 64 μL.</li>
	<li>Verwijder het berekende volume van de 10 ml steriele dH2O en voeg vervolgens het medicijn toe.</li>
	<li>Neem acht afzonderlijke 96-put platen.</li>
	<li>Voeg aan elke plaat 100 μL MHB toe aan de putten tussen rijen G en B.</li>
	<li>Voeg 100 μL van het eerder bereide medicijn 2-oplossing toe aan de putten van rij G.</li>
	<li>Verdun serieel van rij G naar rij B door 100 μL uit elke put te halen en gooi ten slotte de 100 μL uit de putten van rij B.</li>
	<li>Herhaal stap 4.5, 4.6 en 4.7 om acht borden voor te bereiden.</li>
</ol>5. Overdracht van geneesmiddel 2 naar de vier panelen
<ol><li>Pipetteer 50 μL geneesmiddel 2 uit de putten tussen rijen G en B in de overeenkomstige putten in elke plaat in de vier panelen. Eén bereide 96-putplaat bevat 100 μL geneesmiddel 2, wat voldoende is voor twee platen in één paneel.</li>
</ol>6. Geneesmiddel 3, Levofloxacine, toevoeging
<ol><li>Voeg aan vier verschillende conische buizen 14 ml steriele dH2O toe.</li>
	<li>Bereken het volume dat uit de voorraadoplossing van het geneesmiddel moet worden verwijderd volgens de formule C1V1 = C2V2. V1 = (C2 x 14 ml) / C1. OPMERKING: In ons geval wordt Levofloxacine bereid in vier verschillende concentraties uit een stamoplossing van 5 x 103 μg/ml. C1 = 2 μg/ml, V1 = 5,6 μL C2 = 4 μg/ml, V1 = 11,2 μL C3 = 8 μg/ml, V1 = 22,4 μL C4 = 16 μg/ml, V1 = 44,8 μL</li>
	<li>Verwijder het berekende volume van de 14 ml steriele dH2O uit elke buis en voeg vervolgens het medicijn toe.</li>
	<li>Neem na het bereiden van de vereiste concentraties van het derde geneesmiddel 50 μL en voeg het toe aan de overeenkomstige putten tussen rijen B en G en kolommen 2 en 12 in de overeenkomstige plaat in elk paneel waar C1 overeenkomt met de vier P1-platen in de vier panelen, C2 komt overeen met de vier P2-platen in de vier panelen , C3 komt overeen met de vier P3-platen in de vier panelen en C4 komt overeen met de vier P4-platen in de vier panelen.</li>
</ol>7. Geneesmiddel 4, Trimethoprim-sulfamethoxazol, toevoeging
<ol><li>Voeg aan een conische buis 14 ml steriele dH2O toe.</li>
	<li>Bereken het volume dat uit de voorraadoplossing van het geneesmiddel moet worden verwijderd volgens de formule C1V1 = C2V2. V1 = (C2 x 14 ml) / C1. OPMERKING: In ons geval wordt trimethoprim-sulfamethoxazol bereid in vier verschillende concentraties uit een stamoplossing van 48 x 103 μg/ml. C1 = 512 μg/ml, V1 = 149,33 μL C2 = 1024 μg/ml, V1 = 298,66 μL C3 = 2048 μg/ml, V1 = 597,33 μL C4 = 4096 μg/ml, V1 = 1 194,66 μL</li>
	<li>Verwijder het berekende volume van de 14 ml steriele dH2O van elke buis en voeg vervolgens het medicijn toe.</li>
	<li>Neem na het bereiden van de vereiste concentraties van het vierde geneesmiddel 50 μL en voeg het toe aan de overeenkomstige putten tussen rijen B en G en kolommen 2 en 12 in de vier platen in het overeenkomstige paneel waar C1 overeenkomt met paneel 1, C2 overeenkomt met paneel 2, C3 overeenkomt met paneel 3 en C4 overeenkomt met paneel 4.</li>
</ol>8. Bereiding en toevoeging van bacterieel entmateriaal E. coli ESBL
<ol><li>Breng met behulp van een steriele lus één kolonie van het bacteriële isolaat E. coli ESBL over die eerder op een plaat was gekweekt in 2 ml steriele MHB en vortex.</li>
	<li>Controleer op de troebelheid waar het 0,5 McFarland moet zijn met behulp van een densitometer.</li>
	<li>Voeg 80 ml steriele MH-bouillon toe aan een steriele urinebeker.</li>
	<li>Voeg bacterieel entmateriaal van het 0,5 McFarland-entmateriaal toe aan de urinekop na C1V1 = C2V2, waarbij V1 = (106 x 80 ml) / 108 = 800 μL.</li>
	<li>Pipet 50 μL van de entoplossing 106 KVE/ml in elke put behalve H12, de steriliteitscontroleput.</li>
	<li>Incubeer de panelen 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg na incubatie 50 μL Iodotetrazolium toe om de groei in de putten te registreren.</li>
</ol>9. Protocol voor de FIC-template (Aanvullend Dossier)
<ol><li>Schrijf de hoogste concentratie geneesmiddel 1 (Cefotaxime) in de gele cel in paneel A.</li>
	<li>Schrijf de hoogste concentratie van geneesmiddel 2 (Amikacine) in de gele cel in paneel B.</li>
	<li>Schrijf de hoogste concentratie van geneesmiddel 3 (Levofloxacine) in de gele cel in paneel C.</li>
	<li>Schrijf de hoogste concentratie van geneesmiddel 4 (Trimethoprim-sulfamethoxazol) in paneel D.</li>
	<li>Traceer de Redline (Growth/no Growth interface) door de putten met groei in rood te benadrukken.</li>
	<li>Schrijf de MIC van medicijn 1 in de tabel van medicijn 1 (ATB1).</li>
	<li>Schrijf de MIC van geneesmiddel 2 in de tabel van medicijn 2 (ATB2).</li>
	<li>Schrijf de MIC van geneesmiddel 3 in de tabel van geneesmiddel 3 (ATB3).</li>
	<li>Schrijf de MIC van geneesmiddel 4 in de tabel van geneesmiddel 4 (ATB4).</li>
	<li>FIC voor ATB1 berekenen<ol>
<li>Bepaal de putten op de interface Groei/geen groei.</li>
		<li>Dubbelklik in tabel ATB1 op de cel naast FIC1 en sleep de gele cel links van paneel A naar de eerst geselecteerde put.</li>
		<li>Herhaal stap 9.10.2 voor elke geselecteerde put waar goed 1 overeenkomt met FIC1, put 2 overeenkomt met FIC2, enzovoort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het FIC voor ATB2 berekenen<ol>
<li>Dubbelklik in tabel ATB2 op de cel naast FIC1 en sleep de gele cel links van paneel B naar de eerste vooraf geselecteerde put.</li>
		<li>Herhaal stap 9.11.1 voor elke vooraf geselecteerde put.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het FIC voor ATB3 berekenen<ol>
<li>Dubbelklik in tabel ATB3 op de cel naast FIC1 en sleep de gele cel links van paneel C naar de eerste vooraf geselecteerde put.</li>
		<li>Herhaal stap 9.12.1 voor elke vooraf geselecteerde put.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het FIC voor ATB4 berekenen<ol>
<li>Dubbelklik in tabel ATB4 op de cel naast FIC1 en sleep de gele cel links van paneel D naar de eerste vooraf geselecteerde put.</li>
		<li>Herhaal stap 9.13.1 voor elke vooraf geselecteerde put.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Som in de tabel met het label ATB1+2+3+4 automatisch de FIC1 van elke ATB op. Hetzelfde geldt voor de andere FIC's (FIC2, FIC3, enzovoort).<ol>
<li>Dubbelklik in de cel met FIC en geel gemarkeerd en selecteer de samengevatte ΣFICs in tabel ATB1+2+3+4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal deze stappen voor elk van de negen vellen die de negen platen vertegenwoordigen. OPMERKING: In het fic-blad wordt in de tabel de definitieve samengevatte FIC met de interpretatie van de verkregen waarde weergegeven.</li>
</ol>10. MIC-bepaling met behulp van de microdilutietest voor de vier geneesmiddelen
<ol><li>Label vier verschillende rijen met de afkorting van elk getest medicijn. Bijvoorbeeld CTX voor Cefotaxime, AMK voor Amikacine, LEVO voor Levofloxacine en SXT voor Trimethoprim-sulfamethoxazol.</li>
	<li>Pipet 200 μL steriele Muller Hinton bouillon in put nummer 1 en put nummer 12 in elke gebruikte rij. Nou nummer 12 zal dienen als de negatieve controle goed.</li>
	<li>Pipet 100 μL steriele Muller Hinton bouillon naar de putten 2 tot 11 in elke gebruikte rij.</li>
	<li>Bereken het volume van elk toe te voegen geneesmiddel met behulp van de formule C1V1 = C2V2. Dus V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 is het uiteindelijke volume in de putten dat 200 μL is, C1 is de concentratie van de stamoplossing en C2 is de initiële concentratie die we in de eerste put moeten hebben. OPMERKING: Hier gebruiken we het volgende: Cefotaxime: C1 = 105 μg/ml, waarbij we het verdunnen tot 104 μg/ml, C2 = 256 μg/ml; dus V1 = 20,48 μL Amikacine: C1 = 103 μg/ml, C2 = 64 μg/ml; dus V1 = 51,2 μL Levofloxacine: C1 = 5 x 103 μg/ml, waarbij we het verdunnen tot 5 x 102 μg/ml, C2 = 16 μg/ml; dus V1 = 25,6 μL Trimethoprim-sulfamethoxazol: C1 = 48 x 103 μg/ml, C2 = 4096 μg/ml; dus V1 = 68,26 μL</li>
	<li>Pipetteer het vereiste volume voor elk medicijn in de eerste put van de overeenkomstige rij na het verwijderen van hetzelfde volume uit de bouillon van 200 μL om een totaal volume van 200 μL te verkrijgen na toevoeging van het medicijn.</li>
	<li>Serieel verdunnen door 100 μL te verwijderen van put 1 in put 2 enzovoort tot het bereiken van goed 10 waar de 100 μL die uit put 10 is verwijderd, zal worden weggegooid. Merk op dat put 11 dient als de positieve controle goed.</li>
	<li>Pipet 100 μL van 106 bereid bacterieel entmateriaal in elke put in elke gebruikte rij, behalve putnummer 12 die als negatieve controle dient.</li>
	<li>Incubeer 's nachts bij 37 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+resistance+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li>
<li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistance+crisis%3A+part+1%3A+causes+and+threats%5BTitle%5D)+AND+%22P+%26+T%3A+A+Peer-Reviewed+Journal+for+Formulary+Management%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li>
<li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+Are+we+in+the+post-antibiotic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li>
<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+at+the+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li>
<li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+interactions%3A+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li>
<li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases%3A+role+of+antibiotic+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Diagnostic+Research%3A+JCDR%22%5BJournal%5D)">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li>
<li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy%3A+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science+against+Microbial+Pathogens%3A+Communicating+Current+Research+and+Technological+Advances%22%5BJournal%5D)">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li>
<li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+drugs%2C+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li>
<li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li>
<li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li>
<li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+principles+of+antimicrobial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li>
<li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+combinations%3A+Should+they+be+tested%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li>
<li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+does+2+plus+2+equal+5%3F+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li>
<li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin%2C+meropenem%2C+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479(2015).</li>
<li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li>
<li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+antagonism%2C+and+what+the+chequerboard+puts+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1(2003).</li>
</ol>

De methode Quadruple Checkerboard lijkt op het dambord en het driedimensionale dambord in het protocol. Er moet echter rekening worden gehouden met bepaalde cruciale stappen om fouten tijdens het experiment te voorkomen.
Zorg ervoor dat u voor de MIC van elk geneesmiddel test tegen het geteste isolaat voordat u het protocol start om te weten wat de concentraties zijn die nodig zijn om de verdunningen te starten voor geneesmiddel 1 en medicijn 2 die serieel in de platen moeten worden verdund. W...

Met de toename van resistentie als gevolg van overmatig gebruik en misbruik van antibiotica1,2, is de noodzaak om nieuwe medicijnen en middelen te ontwikkelen om bacteriële infecties te behandelen cruciaal geworden. Nieuwe benaderingen zoals de ontwikkeling van nieuwe medicijnen zijn erg belangrijk om de weerstandscrisis te overwinnen. De farmaceutische industrie is echter niet geïnteresseerd in de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële middelen. Bovendien, als nieuwe geneesmiddelen worden ontwikkeld, zullen bacteriën blijven evolueren en resistentie ontwikkelen tegen deze nieuwe geneesmiddelen3,4. Het probleem van resistentie zal dus niet worden opgelost, waardoor de noodzaak van een andere aanpak een must is die moet worden overwogen en bestudeerd om bacteriële resistentie te overwinnen.
Medicijncombinatie is een zeer belangrijk concept voor de behandeling van bacteriële infecties, voornamelijk die welke worden veroorzaakt door multidrug resistente pathogenen5,6. Het vermindert het verloop van de behandeling, verlaagt de gegeven dosis; dus, het verminderen van de toxiciteit van het gegeven geneesmiddel, helpt bij het verminderen van de snelheid van resistentieontwikkeling en sensibiliseert in zekere zin de bacteriën voor de gegeven geneesmiddelen zoals beschreven in het concept van collaterale gevoeligheid5,7,8,9.
Resistentieontwikkeling tegen één medicijn vereist één mutatie; resistentieontwikkeling tegen een combinatie van geneesmiddelen gericht op meerdere trajecten vereist echter verschillende onafhankelijke mutaties die door deze combinatie worden vertraagd. Een voorbeeld van verminderde resistentie tijdens het gebruik van combinatietherapie is de verminderde weerstand tegen Rifampine bij Mycobacterium Tuberculosis10. Een ander voorbeeld is een studie uitgevoerd door Gribble et al. die aantoonde dat de snelheid van opkomst van resistente stammen bij patiënten die Piperacilline alleen nemen hoger is dan bij patiënten die een combinatie van carboxypenicilline en aminoglycoside10nemen . Studies hebben aangetoond dat resistentieontwikkeling tegen aminoglycosides in evoluerende bacteriën deze stammen gevoelig maakte voor verschillende andere geneesmiddelen5. De combinatie tussen het bèta-lactamklasse geneesmiddel amoxicilline en de lactamaseremmer clavulaanzuur toonde succes bij de behandeling van resistente bacteriestammen8.
Het verminderen van de behandelingstijd is een goed voordeel als gevolg van medicijncombinaties. Bijvoorbeeld, een therapie van gecombineerde penicilline of ceftriaxon met gentamicine gedurende 2 weken zal dezelfde werkzaamheid geven die alleen door penicilline of ceftriaxon wordt gegeven wanneer het gedurende 4 weken wordt gegeven11. Het combineren van geneesmiddelen maakt het gebruik van lagere doseringen van geneesmiddelen mogelijk die niet effectief zijn wanneer ze alleen worden gegeven, zoals de Sub-MICs. Het voorbeeld van sulfonamiden kan worden gegeven wanneer het gebruik van triple-sulfonamiden bij lagere doses de geproduceerde toxiciteit minimaliseert, namelijk kristalvorming of kristalurie bij gebruik van onoplosbare sulfonamiden in volledige doses12.
Dus, het verlagen van de gegeven dosering en het tijdstip van de behandeling zal uiteindelijk de toxiciteit van de geneesmiddelen op het lichaam verminderen. Het idee om methoden te ontwikkelen om de interactie tussen gecombineerde geneesmiddelen te beoordelen is erg belangrijk. In één studie toonden de resultaten aan dat combinatietherapie effectiever is voor de behandeling van resistente soorten Acinetobacter en P. aeruginosa8.
Het geven van drugs in combinatie Er zijn verschillende methoden waarmee we medicijncombinaties kunnen bestuderen, zoals de dambordmethode, de tijddodingscurvemethode en de E-testmethode13. De dambordmethode kan alle mogelijke combinaties tussen de twee geneesmiddelen in kwestie in één experiment zelf bestuderen. Bovendien werd het ontwikkeld om een combinatie van drie geneesmiddelen te bestuderen14. Nu breiden we dit uit om een combinatie van vier geneesmiddelen te bestuderen, voornamelijk voor de behandeling van multidrug-resistente pathogenen.
De time-kill curve assay wordt meestal uitgevoerd om te testen op het bacteriedodende effect van een bepaald medicijn. Het werd ook gebruikt om te testen op het effect van drugscombinaties waarbij verschillende geneesmiddelen in specifieke concentraties worden gecombineerd. Dit protocol vereist de bereiding van verschillende steriele buizen of kopjes waar we in elke beker de bouillon, combinatie van medicijnen en de vereiste bacteriële stam toevoegen. Na incubatie en registratie van de optische dichtheid op verschillende tijdstippen, worden de resultaten vergeleken met de normale groeisnelheid van de gebruikte stam om te zien of de groeisnelheid is toegenomen, afgenomen of niet is veranderd13.
E-testmethode wordt gewoonlijk uitgevoerd om te testen op de minimale remmende concentratie (MIC) waarbij een strip met een gradiëntconcentratie van het geneesmiddel in kwestie op een ingeënte plaat wordt geplaatst. Het werd ook gebruikt om de combinatie tussen twee geneesmiddelen te testen waarbij twee stroken loodrecht aan de plaat worden toegevoegd die elkaar kruisen op hun MMC's13.
Volgens de literatuur is er geen gouden standaard om synergie te definiëren en te bestuderen; het is dus moeilijk te beoordelen welke van de methoden die worden gebruikt om de combinatie te bestuderen beter is en welke betere en betrouwbaardere resultaten oplevert, voornamelijk13. Time-kill assay is echter arbeidsintensief, tijdrovend en duur15,16, terwijl de E-testmethode is ontwikkeld om een combinatie tussen slechts twee geneesmiddelen te bestuderen. Checkerboard kan alle mogelijke combinaties tussen de twee geteste geneesmiddelen bestuderen en daarom is ervoor gekozen om deze techniek te ontwikkelen.

<table><tbody><tr><td>1000 &micro;L tips</td><td>Citotest</td><td>4330000402</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L tips</td><td>Citotest</td><td>4330-0013-17</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>corning</td><td>430828</td><td>Voor bereiding van drug 3 en 4</td></tr><tr><td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>Voor bereiding van 0.5 MacFarland bacteriële inoculum</td></tr><tr><td>90mm petrischalen</td><td>JRZ Plastilab</td><td></td><td>Als bed voor de oplossingen die toegevoegd worden met de meerkanaals pipet</td></tr><tr><td>96-wells platen</td><td>corning</td><td>3596</td><td>Voor seriële verdunning en het combineren van geneesmiddelen</td></tr><tr><td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td><td>Door CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, Frankrijk</td><td>10177403</td><td>Drug 4</td></tr><tr><td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td><td>PHARCO Pharmaceuticals</td><td>24750/2006</td><td>Drug 1</td></tr><tr><td>Densitometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. Coli ESBL stam</td><td>Opgehaald als een medische stam van het Saint-George Ziekenhuis Libanon</td><td></td><td>Bacterieel ras</td></tr><tr><td>Mac Conkey + kristalviolet agar</td><td>BIO-RAD</td><td>64169508</td><td>Voor het maken van agar platen gebruikt voor subcultivering</td></tr><tr><td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td><td>HIKMA Pharmaceuticals</td><td>2BXMIA56N-AEF</td><td>Drug 2</td></tr><tr><td>Muller-Hinton Broth</td><td>BIO-RAD</td><td>69444</td><td>Voor het maken van bacterieel medium</td></tr><tr><td>Meerkanaals Pipet</td><td>Thermo Scientific</td><td>GJ54761</td><td>Voor seriële verdunning en toevoeging van medium, bacteriën en geneesmiddelen</td></tr><tr><td>Papiertape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enkelkanaals pipetten</td><td>Thermo Scientific</td><td>OH19855 HH40868</td><td>Voor de toevoeging van medium, bacteriën en geneesmiddelen</td></tr><tr><td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td><td>sanofi aventis</td><td>221937/2009</td><td>Drug 3</td></tr></tbody></table>

quadruple-checkerboard: een wijziging van het driedimensionale dambord voor het bestuderen van medicijncombinaties

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Het concept van medicamenteuze combinatietherapie wordt vooral erg belangrijk met de drastische toename van de resistentie tegen geneesmiddelen. Het viervoudige dambord, ook wel het Q-dambord genoemd, is gericht op het maximaliseren van het aantal mogelijke combinaties dat kan worden verkregen tussen vier geneesmiddelen in één experiment om de tijd en het werk te minimaliseren dat nodig is om dezelfde resultaten met andere protocollen te bereiken. Dit protocol is gebaseerd op de eenvoudige microverdunningstechniek waarbij de geneesmiddelen worden verdund en gecombineerd in verschillende 96-putplaten.
In de eerste set van 96-put platen wordt Muller-Hinton bouillon toegevoegd, gevolgd door het eerste vereiste medicijn (bijv. Cefotaxime hier) om het serieel te verdunnen. Nadat de eerste stap is voltooid, wordt een andere set 96-putplaten gebruikt om het tweede medicijn te verdunnen (bijv. Amikaci), dat zal worden overgedragen door een specifiek volume van medicijn 2 te verwijderen en in de overeenkomstige putten te plaatsen in de eerste set van 96-putplaten die medicijn één bevatten. De derde stap wordt gedaan door de vereiste concentraties van het derde geneesmiddel (bijv. Levofloxacine) toe te voegen aan de juiste platen in de eerste set met combinatie van geneesmiddel 1 en 2. De vierde stap wordt gedaan door de vereiste concentraties van het vierde geneesmiddel (bijv. Trimethoprim-sulfamethoxazol) toe te voegen aan de juiste platen in de eerste set. Vervolgens wordt E. coli ESBL bacterieel entmateriaal bereid en toegevoegd.
Deze methode is belangrijk om alle mogelijke combinaties te evalueren en heeft een breder scala aan mogelijkheden om verder te testen voor in vivo testen. Ondanks dat het een vermoeiende techniek is die veel focus vereist, zijn de resultaten opmerkelijk en tijdbesparend waar veel combinaties in één experiment kunnen worden getest.

Figuur 2A geeft de resultaten weer die zijn verkregen door Cefotaxime en Amikacine te combineren met specifieke concentraties Levofloxacine en Trimethoprim-sulfamethoxazol. We kunnen in het linkerdeel van de figuur de vier platen zien die schematisch worden gepresenteerd met de concentraties van de medicijnen in het rechterdeel van de figuur. De pijlen vertegenwoordigen de putten op de interface Groei/geen Groei. De gekleurde putten zijn de putten die groei bevatten. We merken dat de vierde ...

Dit protocol beschrijft hoe alle mogelijke combinaties kunnen worden bestudeerd die kunnen worden verkregen tussen vier geneesmiddelen in één experiment. Deze methode is gebaseerd op de standaard 96-well plate micro verdunningstest en de berekening van fractionele remmende concentraties (FIC's) om de resultaten te evalueren.

Quadruple-Checkerboard: een wijziging van het driedimensionale dambord voor het bestuderen van medicijncombinaties

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

quadruple-checkerboard-modification-three-dimensional-checkerboard

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lijm micropatterns dat cellulaire architectuur normaliseren kan gebruikt worden om de gevoeligheid bij de detectie van de effecten van geneesmiddelen te verhogen, het verbeteren van de reproduceerbaarheid en vereenvoudiging van de geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse. Deze technologie zullen profiteren drug / siRNA screeningstesten, uitgevoerd op conventionele celcultuur ondersteunt en daardoor lijden aan overmatige cel-tot-cel variabiliteit.

Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen

Werkwijzen voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie assay voor het meten van de activiteit van de actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanalen voor high-throughput screening verbinding gepresenteerd.

High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Hier beschrijven we een workflow voor het snel analyseren en verkennen van collecties van fluorescentie microscopie beelden met behulp PhenoRipper, een recent ontwikkelde beeldanalyse platform.

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Synergetische drug combinaties zijn moeilijk en tijdrovend te identificeren empirisch. Hier beschrijven we een methode voor het vaststellen en valideren van synergetische kleine moleculen.

High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping2 methode

In dit protocol beschrijven we how to make Loewe additiviteit gebaseerde drug interactie metingen voor paarsgewijs en drieweg drug combinaties.

Diagonale methode maatregel synergie tussen een willekeurig aantal Drugs

Antimicrobiële synergie testen wordt gebruikt ter beoordeling van het effect van twee of meer antibiotica in combinatie gebruikt en worden doorgaans uitgevoerd door een van twee methoden: de dambord array of de bepaling van de tijd-doden. Hier presenteren we een geautomatiseerd, inkjet printer-bijgewoonde dambord matrix synergie techniek en een studie van de klassieke tijd-kill synergie.

Antimicrobiële synergie testen door de Inkjet Printer-bijgewoonde geautomatiseerde dambord matrix en de handmatige methode van de tijd-kill

Bis-3-chloorpiperidines (B-CeP's) zijn nuttige chemische sondes om G-quadruplex-structuren in DNA-sjablonen in vitro te identificeren en te karakteriseren. Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van tastende reacties met B-CeP's en het oplossen van reactieproducten door middel van polyacrylamidegelelektroforese met hoge resolutie.

In vitro Chemisch in kaart brengen van G-quadruplex DNA-structuren door Bis-3-Chloropiperidines

Beschrijven we een chip-gebaseerde platform voor de drie-dimensionale kweken van cellen in micro-bioreactoren. Een chip kan maximaal huis tot 10 miljoen. cellen die kunnen worden geteeld onder nauwkeurig omschreven voorwaarden met betrekking tot stroming, zuurstofspanning enz. in een steriele, gesloten circulatie lus.

Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren

We presenteren twee processen voor de microfabricage van poreuze polymeer chips voor drie-dimensionale celkweek. De eerste is hot embossing gecombineerd met een damp van oplosmiddelen lasproces. De tweede maakt gebruik van een recent ontwikkelde microthermoforming proces in combinatie met ion-Track technologie leidt tot een aanzienlijke vereenvoudiging van de productie.

Microfabricage van Chip-en kleinbedrijf Stellingen voor drie-dimensionale celkweek

Leer de quadruple checkerboard-methode voor het testen van medicijncombinaties tegen multiresistente micro-organismen zoals E. coli ESBL. Deze efficiënte techniek analyseert alle mogelijke vierdrogcombinaties in één experiment.

Quadruple-Checkerboard: een wijziging van het driedimensionale dambord voor het bestuderen van medicijncombinaties

Meer video's verkennen