Monitoring van eiwit-ligandinteracties in menselijke cellen door real-time kwantitatieve in-cell NMR met behulp van een bioreactor met hoge celdichtheid

In-cell NMR-spectroscopie biedt een unieke benadering om de eiwitstructuur en -functie direct in levende cellen te bestuderen en biologisch relevante processen zoals eiwit-ligandinteracties te monitoren. Deze NMR-bioreactor kan een groot aantal menselijke cellen levensvatbaar en metabolisch actief houden gedurende meerdere dagen in de spectrometer, waardoor real-time in-cell NMR-toepassingen mogelijk zijn. Deze methode kan worden toegepast op elk oplosbaar, vrij tuimelend intracellulair eiwit dat conformationele of chemische veranderingen ondergaat.

Isotopenetikettering breidt de toepasbaarheid van de methode verder uit. Om te beginnen, monteer de stroomeenheid met behulp van een tweede stroomeenheid NMR-buis, die later zal worden vervangen door degene die cellen bevat. Raadpleeg de gebruiksaanwijzing van de flow unit voor de juiste montage.

Stel het waterbad dat is aangesloten op de temperatuurregeling van de flow unit in op 37 graden Celsius en plaats de reservoirfles in het waterbad. Sluit de FEP-slang van de reservoirfles aan op de pomp. Draai de bioreactorklep om de pomp te omzeilen en vul deze voor met medium.

Draai vervolgens de bioreactorklep om te stromen en vul de bioreactor voor met het medium met 0,1 milliliter per minuut. Neem een T75-kolf met getransfecteerde HEK 293 T-cellen uit de kooldioxide-incubator en verwijder het gebruikte medium. Voeg twee milliliter trypsine EDTA toe aan de cellen en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen los te maken.

Inactiveer de trypsine met 20 milliliter volledige DMEM en suspensie de cellen grondig opnieuw door op en neer te pipetteren. Breng ze vervolgens over in een centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer de cellen bij 800X G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.

Breng de celkorrel over in een afgedekte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Om de cellen in agarosedraden in te bedden, smelt je een aliquot van gestolde agarose bij 85 graden Celsius in een blokverwarmer en houd je het vervolgens in oplossing bij 37 graden Celsius in de blokverwarmer. Vul met een Pasteur pipet de bodem van de NMR-buis van de flow unit met 60 tot 70 microliter 1,5% agarosegel en plaats deze op ijs om een vijf millimeter hoge bodemplug te creëren.

Verwarm de celkorrel gedurende 15 tot 20 seconden in de blokverwarmer en suspensie de cellen voorzichtig opnieuw in 450 microliter agarose-oplossing, waarbij de vorming van bellen wordt vermeden. Zuig de cel/agarose-suspensie op in een 30 centimeter lange chromatografie PEEK-buis met een binnendiameter van 0,75 millimeter, verbonden met een spuit van één milliliter. Laat de slang twee minuten afkoelen bij kamertemperatuur.

Vul de NMR-buis van de flow unit voor met 100 microliter PBS bij kamertemperatuur. Gegoten draden van cellen ingebed in agarose in de NMR-buis van de stroomeenheid door zachtjes op de spuit te duwen. Verwijder de lege NMR-buis uit de stroomeenheid en verhoog het debiet gedurende enkele minuten tot twee milliliter per minuut om resterende gasbellen in de inlaatbuis te verwijderen.

Stel het debiet in op 0,2 milliliter per minuut en plaats de NMR-buis met de cellen door deze langzaam maar gestaag omhoog te duwen. Lever het bioreactormedium met een debiet van 0,1 milliliter per minuut. Stel de temperatuur in de NMR-spectrometer in op 310 Kelvin en plaats de stroomeenheid in de spectrometer.

Zodra de bioreactor in de NMR-spectrometer is geplaatst, wacht u een paar minuten om de mediumuitwisseling mogelijk te maken. Pas de matching en afstemming van het protonkanaal aan, shim de magneet en bereken de proton 90 graden harde pulslengte. Pas de protonvermogensniveaus in elke pulssequentie aan volgens de harde puls van het proton.

Neem een eerste zgesgp proton NMR-spectrum op om de monsterinhoud in veldhomogeniteit vast te leggen. Kopieer de zgesgp en de p3919gp of de SOFAST-HMQC experimenten naar het gewenste aantal en zet ze in de wachtrij in de acquisitiespooler. Injecteer een geconcentreerde oplossing van het externe molecuul in de medium reservoirfles door de siliconenslang te doorboren met een steriele spuit met lange naald.

Vervang aan het einde van het NMR-experiment de buis met de cellen door een lege buis en spoel de stroomeenheid met water. Voor cellen die ongelabelde koolzuuranhydrase tot expressie brengen, verwerkt u de p3919gp-spectra door nulvullende en exponentiële lijnverbredende vensterfunctie toe te passen. Voor cellen die stikstof-15-gelabeld, superoxide dismutase tot expressie brengen, verwerkt u de SOFAST-HMQC-spectra door nulvullende en vierkante tekenbelvensterfunctie in beide dimensies toe te passen.

Importeer in MATLAB de spectrale gebieden met behulp van het aangepaste script Load_ascii_spectra. Voer het Load_acqus script uit om de tijdstempels uit de 1D-spectra te extraheren. Open MCR-ALS 2.0 GUI door het mcr_main script uit te voeren en laad de spectramatrix op het tabblad Gegevensselectie.

Controleer de gegevens door deze uit te zetten. Evalueer het aantal componenten, hetzij door enkelvoudige waardedecompositie of handmatig, en selecteer een methode voor de eerste schatting van de zuivere spectra. Ofwel zuiverste variabele detectie of evoluerende factoranalyse kan worden gebruikt.

Selecteer in het venster Selectie van de gegevensset de optie Doorgaan. Stel de beperkingen voor de concentraties in het venster Beperkingen:rijmodus in. Pas een niet-negativiteitsbeperking toe en selecteer fnnls als Implementatie en twee als het aantal soorten.

Pas vervolgens één sluitingsbeperking toe, stel de beperking in op één, de sluitingsbeperkingsvoorwaarde als gelijk aan, en van toepassing op alle soorten. Stel de beperkingen voor de spectra in het venster Beperkingen:kolommodus in. Pas een niet-negativiteitsbeperking toe en selecteer fnnls als implementatie en twee als het aantal soorten.

Stel in het laatste venster 50 iteraties en een convergentiecriterium van 0,01 in. Geef de uitvoernamen op voor concentraties, spectra en standaarddeviatie. Klik op Doorgaan om de MCR-ALS fitting uit te voeren.

De cellen in de bioreactor kunnen tot 72 uur in leven worden gehouden, zoals bevestigd door een trypan blue test. De bioreactor werd gebruikt voor real-time monitoring van de binding van twee remmers, acetazolamide en methazolamide aan koolzuuranhydrase overexpressie in het cytosol van HEK 293 T-cellen. De aanwezigheid van signalen van het overexpressie eiwit en de veldhomogeniteit werd beoordeeld met het eerste excitatie-sculpterende protonenspectrum.

In het geval van koolzuuranhydrase werd de intracellulaire binding van de twee remmers gecontroleerd door protonsignalen te observeren in het gebied tussen 11 en 16 delen per miljoen van het WATERGATE-spectrum, voortkomend uit de zinkcoördinerende histidines en andere aromatische residuen. Succesvolle binding werd bevestigd door het verschijnen van extra signalen. MCR-ALS werd gebruikt om de NMR-signalen afkomstig van vrije en gebonden koolzuuranhydrase te scheiden en om de relatieve concentratieprofielen van de twee soorten te leveren.

De bioreactor werd toegepast om de vorming van zinkgebonden superoxide dismutase intramoleculaire disulfidebinding te volgen die wordt bevorderd door ebselen, een glutathionperoxidase-nabootsing. MCR-ALS-analyse op geselecteerde regio's van het 2D-spectrum scheidde de signalen die van de twee soorten afkomstig waren en leverde hun relatieve concentratieprofielen op. Het is belangrijk om de NMR-buis van de flow unit langzaam en gestaag in te brengen en te verwijderen om druksprongen te voorkomen die de vorming van bellen kunnen veroorzaken.

De ontwikkeling van NMR-bioreactoren heeft de weg vrijgemaakt voor het bestuderen van tijdsafhankelijke processen voor atomaire resolutie, zoals het plotten van redux-regulatie en geneesmiddel / doelinteracties in levende cellen.