Kweekmethoden om apicale-specifieke interacties te bestuderen met behulp van intestinale organoïde modellen

Deze studies zijn gericht op robuuste en reproduceerbare modelsystemen om oriëntatiespecifieke studies van het darmepitheel uit te voeren. Apicale organoïden kunnen in grote aantallen worden gegenereerd en beloven een hoge doorvoerscreening. Monolayers zijn gemakkelijker te manipuleren en bieden toegang tot zowel apicale als basale tekens.

Zorg ervoor dat de organoïden een diameter van 150 tot 250 micrometer hebben voordat u met het inversieprotocol begint. Verwijder en gooi het medium voorzichtig weg uit elke put met organoïden zonder de ECM-koepel te verstoren. Voeg een milliliter ijskoude dissociatieoplossing toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende één minuut op kamertemperatuur.

Maak de koepels voorzichtig los door langzaam met een gecoate punt te pipetten, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de organoïden niet worden verstoord en gefragmenteerd. Breng de organoïde suspensie over op een plaat die is behandeld met een anti-hechtingsoplossing en plaats de plaat gedurende 30 minuten op een shaker op vier graden Celsius. Verwijder na 30 minuten de plaat en pipet de oplossing voorzichtig op en neer met behulp van een pipettip van één milliliter bedekt met anti-hechtingsoplossing.

Plaats de plaat nog 30 minuten op de shaker op vier graden Celsius. Verwijder de plaat en laat de organoïden bij kamertemperatuur één tot twee minuten bij kamertemperatuur bezinken door zwaartekracht. Nadat de organoïden zijn neergestreken, verwijdert u zoveel mogelijk van de dissociatieoplossing en wast u deze door 1,5 milliliter DMEM F-12 toe te voegen.

Laat de organoïden bezinken en verwijder het supernatant. Herhaal vervolgens de wasbeurt. Verwijder zoveel mogelijk van de DMEM F-12 en voeg 0,5 milliliter intestinale organoïde expansiemedium toe.

Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Voer de volgende dag een gedeeltelijke mediumwissel uit door de plaat onder een hoek van 25 tot 30 graden te kantelen en het medium langs de wand van de put te verwijderen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat zwevende organoïden niet worden verwijderd. Voeg 0,4 milliliter intestinale organoïde expansiemedium toe en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende drie dagen.

Als er aggregaten zijn gevormd, gebruik dan een pipetpunt van één milliliter bedekt met anti-aanhechtingsoplossing om de aggregaten af te scheren door 20 keer op en neer te pipetten terwijl u het uiteinde van de punt op de bodem van de plaat drukt. Voeg een milliliter voorverwarmde 0,05%Trypsin-EDTA toe aan resuspend organoïden. En meng grondig om een gelijkmatige suspensie te garanderen.

Voeg tot een extra milliliter Trypsin-EDTA toe voor een groot aantal cellen, of als er een aanzienlijke hoeveelheid ECM overblijft. Incubeer gedurende vijf tot tien minuten op 37 graden Celsius en meng vervolgens grondig met een pipet van één milliliter om de organoïden te verstoren, zodat ze volledig worden gedissocieerd in enkele cellen of kleine fragmenten. Om fragmenten of hele organoïden volledig te ontkoppelen, gaat u nog drie tot vijf minuten door met de incubatie met Trypsine-EDTA bij 37 graden Celsius.

Zodra de organoïden voldoende zijn losgekoppeld, voegt u een gelijk volume DMEM F-12 toe en pipet op en neer om grondig te mengen. Inactiveer de Trypsin-EDTA door 10% FBS aan de cellen toe te voegen. Centrifugeer fragmenten bij 200 maal G gedurende vijf minuten bij twee tot acht graden Celsius.

Als de gedissocieerde organoïden er niet in slaagden om de cellen grondig te mengen door op en neer te pipetten en ze opnieuw te centrifugeren. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant. laat alleen de celkorrel achter.

Resuspend de cellen in 100 microliters van intestinale organoïde differentiatie medium voor elke put te zaaien. Het volume op de juiste manier aanpassen voor grotere of kleinere putgroottes. Verwijder de gecoate platen uit de incubator en verwijder de overtollige keldermembraanmatrixoplossing uit elke put.

Voeg 100 microliters van de celsuspensie toe aan de bovenste put van elke celkweekinzet en 500 microliters darmorganoïde differentiatiemedium aan de onderste put. Incubeer vervolgens bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Vervang het medium om de twee tot drie dagen in zowel de bovenste als de onderste put.

Om een ALI-cultuur vast te stellen, verwijdert u het medium uit de bovenste en onderste putten en voegt u een nieuw intestinale organoïde differentiatiemedium toe aan de onderste put, waardoor de bovenste put leeg blijft. De intestinale organoïden gekweekt met intestinale organoïde expansie medium vertoonden een cystische morfologie. Wanneer ECM wordt verwijderd, hebben sommige organoïden de neiging om gedurende de eerste drie dagen samen te voegen en moeten ze worden gesegregeerd om het organoïde aantal te verhogen.

Intestinale organoïden gekweekt in ECM bleven uitbreiden en vertoonden spontane vorming van secundaire ontluikende structuren. Organoïden die gedurende vijf dagen werden bewaard bij afwezigheid van extracellulaire matrix vertoonden langwerpige, cystische en onregelmatige vormen. De expressie van atypische markers, zoals villin en ZO-1, werd gedetecteerd aan de buitenkant van het epitheel dat werd blootgesteld aan het medium.

ECM ingebedde organoïden bevlekt voor kernen, villin en ZO-1 die een apicale basale polariteit demonstreerden waarbij de apicale kant naar het lumen van de organoïde keek. Zodra de monolaag was gevestigd, vormden cellen nauwe verbindingen en een samenvloeiingslaag. De samenvloeiende laag oriënteert ook zijn villin met borstelrand naar de apicale kant van het epitheel en vormt ZO-1 multi-eiwitcomplexen tussen cellen.

Overgang naar een ALI-cultuur veroorzaakte verdere differentiatie met prominentere bokaalcellen die werd gevisualiseerd door kleuring voor het afgescheiden mucine-eiwit MUC2 Om de polariteitsinversie te induceren, is het cruciaal om alle ECM te verwijderen zonder de organoïden te verstoren of te fragmenteren. Mediaveranderingen moeten ook met zorg worden uitgevoerd om te voorkomen dat een van de zwevende organoïden wordt verwijderd. Het waarborgen van voldoende enkele cellen voor de oprichting van de monolaagcultuur is een belangrijke bepalende factor voor de kwaliteit ervan.

Apicale specifieke functies zoals nutriëntenabsorptie of gastheerpathogeneninteracties kunnen nu worden bestudeerd in relevante systemen die voldoen aan de behoeften van de onderzoekers.