Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [^18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie

Er is tot op heden geen klinisch gevalideerd chimere antigeenreceptor T-cel beeldvormingsplatform. De natriumjodidesymporter vertegenwoordigt een gevoelige en klinisch relevante verslaggever om Car T-cellen in beeld te brengen door PET-scan. TLP PET-beeldvorming van NIS CAR T-cel stelt onderzoekers in staat om niet-invasief geïnfundeerde cellen in vivo te volgen en heeft een potentieel om de werkzaamheid en toxiciteit van CAR T-celtherapie te voorspellen.

Efficiënte beeldvorming van CAR T-cellen maakt de evaluatie van T-celhandel en -uitbreiding mogelijk en maakt de ontwikkeling van strategieën mogelijk om de beperkingen te overwinnen. De methode die in dit protocol wordt beschreven, is eenvoudig en kan worden toegepast op andere CAR-constructies dan die welke in deze studie worden getoond. Begin met de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen of PBMC's uit het bloedmonster met behulp van de standaard dichtheidsgradiënttechniek.

Voeg hiervoor voorzichtig 15 milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe aan een scheidingsbuis van 50 milliliter dichtheidsgradiënt om bubbelvorming te voorkomen. Om celvangst te voorkomen, verdunt u het bloedmonster met PBS met 2% FBS bij een één-op-één volumeverhouding en brengt u het verdunde bloed voorzichtig over op het medium met dichtheidsgradiënt zonder het raakvlak tussen de twee te verbreken. Centrifugeer vervolgens de scheidingsbuis op 1, 200 maal G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Verzamel het supernatant in een verse conische buis van 50 milliliter, was de cellen met PBS met 2% FBS door de buis tot 50 milliliter te vullen en de buis gedurende acht minuten bij kamertemperatuur op 300 maal G te centrifugeren. Zuig het supernatant op voordat u de gepelletiseerde cellen resuspendeert in 50 milliliter PBS met 2% FBS. Resuspend de gepelleteerde PBMC's in PBS met 2%FBS tot een concentratie van 50 maal 10 tot de zesde cel per milliliter.

Herhaal de was in een verse tube van 50 milliliter. Tel het aantal cellen en centrifugeer de celsuspensie vervolgens gedurende acht minuten bij kamertemperatuur op 300 maal G. Breng voor T-celisolatie geïsoleerde PBMC's over naar een ronde onderbuis van 14 milliliter polystyreen.

Gebruik vervolgens een negatieve selectie magnetische kralenkit om T-celisolatie uit te voeren door de PBMC's in negatieve selectie antilichaamcocktail in een volledig geautomatiseerde celscheider te plaatsen. Tel na T-celisolatie de cellen en kweek de cellen in T-cel expansiemedium of TCM in een concentratie van twee keer 10 tot de zesde cel per milliliter. Meng vervolgens de injectieflacon met de anti-CD3/CD28-kralen door te wervelen en pipetteer het vereiste volume kralen in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Voor het wassen, resuspend de kralen in een milliliter TCM voordat u de buis gedurende één minuut op een magneet plaatst en het supernatant opzweept. Nadat u de buis uit de magneet hebt verwijderd, resuspendeert u de gewassen kralen in één milliliter TCM en herhaalt u de was twee keer. Resuspend de gewassen kralen in één milliliter TCM om ze over te brengen naar de T-cellencultuur, verdun vervolgens de T-celkraalsuspensie met TCM tot een concentratie van 1,0 maal 10 tot de zesde cel per milliliter voordat u deze overbrengt naar een weefselkweek behandelde zes-well plaat.

Incubeer de putplaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Om vooruitgang te boeken met de transductie van lentivirussen, ontdooit u de bevroren lentivirussen in coating chimere antigeenreceptoren of natriumjodidesymporter bij vier graden Celsius. Na 24 tot 48 uur T-celstimulatie mengt u de T-cellen om de clusters te breken en voegt u het vers ontdooide lentivirus toe aan de cellen bij een veelvoud aan infecties van vijf.

Incubeer de getransduceerde T-cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Tel op dag drie, vier en vijf van incubatie de getransduceerde T-cellen en pas de celconcentratie aan tot 1,0 maal 10 tot de zesde cel per milliliter door verse voorverwarmde TCM toe te voegen. Voor NIS-getransduceerde T-cellen die het puromycineresistentiegen dragen, behandel de cellen met één microgram per milliliter puromycinedihydrochloride op dag drie, vier en vijf.

Breek op dag zes de T-celclusters op en verwijder de anti-CD3/CD28-kralen uit de getransduceerde T-cellen door de plaat gedurende één minuut op een magneet te plaatsen. Plaats vervolgens de verzamelde cellen terug in de kweek in een concentratie van 1,0 maal 10 tot de zesde cel per milliliter. Was een aliquot van de T-celcultuur met 50.000 cellen met flowbuffer en resuspend de cellen met 50 microliter flowbuffer.

Voor het detecteren van CAR-expressie, kleur de T-cellen met één microliter geitenantilichaam tegen muizen. Om de dode cellen uit te sluiten, voegt u 0,3 microliter LIVE/DEAD Aqua toe. Incubeer de gekleurde cellen in het donker bij kamertemperatuur.

Was de cellen na 15 minuten met 150 microliter flowbuffer op 650 maal G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Om de gekleurde cellen te fixeren en te permeabiliseren, incubeer de cellen met 100 microliter fixatiemedium gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Was de cellen vervolgens tweemaal met 100 microliter van een buffer met daarin een celpermeabilisatiemiddel zoals saponine en centrifuge.

Na het wassen resuspend de gepermeabiliseerde cellen in 50 microliter van een permeabiliserende buffer. Voeg vervolgens 0,3 nanogram anti-humaan ETNL NIS-antilichaam toe en incubeer bij vier graden Celsius. Was de cellen na een uur incubatie door 150 microliter flowbuffer en centrifuge toe te voegen, zoals aangetoond.

Incubeer vervolgens de cellen met 50 microliter flowbuffer met 2,5 microliter anti-konijn secundair antilichaam gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Na het wassen van de T-cellen zoals aangetoond, resuspend de cellen in 200 microliter flowbuffer om flowcytometrie uit te voeren. Bepaal vervolgens de transductie-efficiëntie van de cellen.

Tel en draai op dag acht de T-cellen gedurende acht minuten bij vier graden Celsius op 300 maal G voordat de celkorrel opnieuw wordt opgeschort met een vriesmedium in een concentratie van 10 keer 10 tot de zesde cel per milliliter. Breng één milliliter van de celsuspensie over naar elke gelabelde cryoflacon om gedurende 48 uur bij een vriezer van min 80 graden Celsius te bewaren. Breng na 48 uur de T-cellen over in vloeibare stikstof.

Bereid de muizen geïnjecteerd met NIS-positieve BCMA CAR T-cellen voor op de PET / CT-beeldvorming door de muizen te wegen en metalen oormerken te verwijderen. Injecteer vervolgens 9,25 megabecquerel vers bereid F18-tetrafluorboraat intraveneus in de muis via staartaderinjectie. Na 45 minuten opnameperiode, ga verder met het verkrijgen van statische PET-beelden van een verdoofde muis gedurende 15 minuten, gevolgd door CT-beeldacquisitie gedurende vijf minuten met 360 graden rotatie en 180 projecties.

In deze representatieve analyse genereerde co-transductie van twee virussen in T-cellen NIS-positieve BCMA CAR T-cellen waar meer dan 90% van de cellen NIS-positief waren. De analyse van T-celgroeikinetiek van nul tot acht dagen onthulde dat de integratie van BCMA CAR en NIS geen significante invloed had op T-celexpansie in vergelijking met de niet-getransformeerde cellen. In de flowcytometrische analyse van OPM-2 vertegenwoordigden cellen getransduceerd met lentivirus de GFP-expressie na behandeling met puromycine.

De muizen die BCMA-positieve luciferasepositieve OPM-2-cellen kregen, werden onderworpen aan bioluminescentiebeeldvorming om de engraftment van OPM-2-cellen te bevestigen. PET-beeldvorming van de met F18 tetrafluorboraat toegediende muis toonde NIS-positieve BCMA CAR T-celverdeling in de verschillende organen en het beenmerg. Bovendien vertoonden de beenmergcellen die uit de muis werden geoogst de engraftment van OPM-2-cellen en de afgifte van de NIS-positieve BCMA CAR T-cellen aan het beenmerg.

Voor hoogwaardige beeldvorming van geïnfundeerde CAR T-cellen is het belangrijk om de stappen van het NIS CAR T-cell generation protocol te volgen en de aanwezigheid van dubbele NIS- en CAR-positieve fracties te bevestigen.