Geavanceerd hartritmebeheer door toepassing van optogenetische multi-site fotostimulatie in muizenharten

De fysiek meest onderliggende hartfibrilleren en defibrillatie blijven niet volledig begrepen. Optogenetica kan een manier bieden om meer inzicht te krijgen in hartverschijnselen in een goed gecontroleerde omgeving. Lokale lichtstimulatie met behulp van micro-LED's maakt de innovatie van specifieke hartweefselgebieden mogelijk.

Deze gerichte stimulatie is een nieuw hulpmiddel om hartvriendelijke anti-rekenkundige therapiemethoden te ontwikkelen. Het getoonde protocol kan worden gebruikt om hartgedrag tijdens hartritmestoornissen en vooral tijdens beëindiging te bestuderen. In prospectief kunnen de ontwikkelde technieken worden gebruikt om meer klinisch relevante grote diermodellen te bestuderen.

Reinig voor elk experiment alle buizen met volledig gedemineraliseerd water. Belucht schildklieroplossingen met carbogen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en stel de pH in op 7,3 met natriumhydroxide en zoutzuur. Verwarm het perfusiesysteem tot 37 graden Celsius met een waterwarmtepomp.

Houd de perfusaattemperatuur constant in het waterbad door een extra verwarmingselement te gebruiken, zoals een waterdichte verwarmingskabel. Voeg 500 milliliter van elke schildklieroplossing toe aan het overeenkomstige reservoir en ontlucht de buizen en de bellenvanger door de schildklieroplossing door het perfusiesysteem te laten lopen totdat er geen opgesloten luchtbellen meer worden gezien in de buizen of in de bellenval. Ga door met het beluchten van de schildklieroplossingen tijdens het hele experiment in de reservoirs met carbogen om ervoor te zorgen dat de pH van het perfusaat later tijdens de perfusie stabiel blijft.

Na het verwijderen van het hart, voer de fijne voorbereiding uit onder een stereoscopische microscoop. Bevestig de aorta op de stompe naald en bevestig het vat met hechtmateriaal. Injecteer als controle ijskoude schildklieroplossing door de naald in het hart en controleer of het hart stevig is gemonteerd.

Breng het gemonteerde hart over naar het perfusiesysteem en zorg ervoor dat het perfusaat stroomt om te voorkomen dat lucht het hart binnendringt terwijl de naald wordt verbonden met de bellenvanger. Controleer of het hart bedekt is met schildklieroplossing in het waterbad en dat het binnen een paar minuten klopt. Plaats een van de ECG-elektroden zo dicht mogelijk bij het hartoppervlak om een goede signaalkwaliteit te garanderen.

Suspensie de tweede ECG-elektrode in de schildklieroplossing en zorg ervoor dat het ECG wordt geregistreerd. Plaats de micro-LED-array op het interessegebied. Verander de perfusie in een schildklier met een laag kaliumgehalte met penecidle en bekijk het hart gedurende 15 tot 30 minuten.

Om aritmie te induceren, verlicht u het hart met LED één en LED twee met een trein van 20 tot 50 lichtpulsen met een frequentie van 25 tot 35 hertz, pulsduur van twee tot 15 milliseconden en lichtintensiteit van 2,8 milli watt per vierkante millimeter. Herhaal het proces totdat aritmie is geïnduceerd. Zodra een aanhoudende aritmie visueel is gedetecteerd, past u een uitbarsting van pulsen met verschillende breedtes en frequenties toe met behulp van drie, zes of negen micro-LED's van de array bij een pulserende stroom van 15 milliampère pieren.

Als de aritmie doorgaat na vijf micro-LED-array-gebaseerde defibrillatiestudies, classificeert u de poging als mislukt en start u back-updefibrillatie, met led één en led twee met dezelfde timingparameters. Perfuseer het hart met de blebbistatine-oplossing en wacht tot mechanische ontkoppeling optreedt, wat wordt bereikt wanneer het hart stopt met kloppen, maar een ECG-signaal nog steeds meetbaar is. Geef de één milliliter spanningskleurstof, kleurstof 4-A-N-B-D-Q-P-Q als bolus in de bellenvanger van de Langendorff-perfusie en wacht vijf tot 10 minuten om de kleurstof het hart gelijkmatig te laten doornemen.

Schakel LED drie in. Richt de camera op het hartoppervlak en pas 1,27 milli watt per vierkante millimeter optisch vermogen toe. Schakel de laboratoriumlampen uit en begin met opnemen, zorg ervoor dat een optisch signaal wordt verkregen door de frequentie van het verkregen signaal te vergelijken met de frequentie van het opgenomen ECG.

Een reeks experimenten met verschillende frequenties, aantal micro-LED en pulsduur werden getest voor 11 muizen, waaruit bleek dat pulsen van 1 tot 20 milliseconden kunnen defibrilleren met verschillende slagingspercentages. Er is een significante toename van het slagingspercentage van de negen LED's met een pulsduur van één milliseconde en 20 milliseconden bij een defibrillatiefrequentie van 18 en 20 hertz, wat dichter bij de geanalyseerde gemiddelde aritmiefrequentie van 22,55 van alle aritmieën ligt met een foutinterval van plus of min vier punt nul drie hertz. Twee verschillende defibrillatiepogingen met 14 hertz frequentie met hun ECG opnames en hun respectievelijke spectrogrammen worden hier getoond.

In een voorbeeld van defibrillatie met pulsen van 30 milliseconden neemt de dominante frequentie van de aritmie iets toe totdat de fotostimulatie begint. De VF wordt omgezet in een VT waarbij de dominante frequentie daalt tot 14 hertz gevolgd door mislukte beëindiging en terugkeert naar aritmisch gedrag met een dominante frequentie van 24 hertz. In het tweede voorbeeld toont segment één een VT met een dominante frequentie van 23 hertz en zijn harmonische componenten totdat de fotostimulatie begint, met een pulsbreedte van 20 milliseconden.

Segment drie toont een succesvolle beëindiging die leidt tot een normaal sinusritme met een fundamentele frequentie van 3,5 hertz en de resulterende harmonischen. Optische mapping met hogesnelheidscamera's toonde een verandering van fluorescentie-intensiteit tijdens een enkele hartslag tijdens een normaal sinusritme. De duur van de perfusie moet alle voorwaarden handhaven om het hart gezond te houden, namelijk de temperatuur, de pH-waarde en de oxidatie moeten constant blijven.

Het is vooral belangrijk dat de tyroïde-oplossing niet leegloopt, omdat luchtbellen in het systeem het hart kunnen beschadigen. De micro reality array biedt grote flexibiliteit. U kunt verschillende locaties van het hart targeten of zelfs meerdere arrays in één experiment combineren om aritmie op de juiste manier te beëindigen.