Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen
4 april 2021
Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.
Dit protocol stelt onderzoekers in staat om gebruik te maken van beschikbare chemische en genetische hulpmiddelen om de mechanismen van leverregeneratie bij zebravissen te bestuderen. Gedeeltelijke hepatectomie maakt de nauwkeurige verwijdering van weefsel mogelijk om leverregeneratie te stimuleren zonder de lichaamsbrede effecten van toxisch leverletsel. Alleen door de moleculaire en cellulaire mechanismen van leverregeneratie te begrijpen, kunnen we nieuwe therapieën ontwerpen om patiënten met gevorderde leverziekte te behandelen.
Verwijder om te beginnen de vis uit de Tricaine-tank met een tang en sluit ze in de groef van een door Tricaine doordrenkte spons met de ventrale kant naar boven. Plaats de spons vervolgens onder een ontleedmicroscoop met top-down verlichting. Knijp de huid en schubben net achter het hart met fijne tang en maak een gat in de lichaamsholte door een snee onder de tang te maken met de veerbelaste schaar.
Draai de spons en maak een incisie van drie tot vier millimeter langs de buik door posteriaal naar de bekkenvinnen te snijden. Draai vervolgens de spons terug. Knijp met één hand in de zijkanten van de spons om de viscerale organen uit de lichaamsholte te dwingen.
De ventrale kwab van de lever is aanwezig op de top van de darm, en de lever is een roze of oranje structuur verspreid over de goudbruine darm, en kan duidelijk worden gevisualiseerd met GVB fluorescentie. Knijp in de fijne tang zodat de tanden elkaar raken en schuif de tanden tussen de lever en de darm. Scheid vervolgens langzaam de tanden om de poortaderaanhechtingen tussen de lever en de darm te breken.
Herhaal dit proces totdat alle portaalverbindingen tussen de lever en de darm zijn verbroken en trek de ventrale kwab uit de darm met behulp van fijne tang. Snijd de ventrale kwab vrij van de rest van de lever. Onderzoek van het dier met GVB-fluorescentie toont aan dat de ventrale kwab is verwijderd.
Als u klaar bent, brengt u de vis voorzichtig over van de spons in de tank met systeemwater en stroomt u het systeemwater een paar minuten over de kieuwen totdat de vis herstelt en zelfstandig zwemt. Nadat u de vis hebt geëuthanaseerd, verwijdert u deze uit ijswater. Plaats het in de groef van een spons met de ventrale kant naar boven en maak een incisie van de ventrale lichaamswand op de voorste achterste positie van het hart.
Maak vervolgens nog twee incisies vanaf de randen van de eerste incisie die langs de voorste achterste as naar de bekkenvinnen lopen en pel de huid en spier terug om de viscerale organen te onthullen. De viscerale organen kunnen nu worden gevisualiseerd met zowel heldere veld- als fluorescentiemicroscopie. Leverherstel na gedeeltelijke hepatectomie werd geschat door de verhouding tussen lever en lichaamsgewicht te berekenen, wat 1,8% was voor mannen en 3,3% voor vrouwen.
De verhouding tussen lever en lichaamsgewicht van beide geslachten werd bepaald op dag nul na de operatie en dag zeven bij gedeeltelijke hepatectomie en schijncontroles. Op dag nul na de operatie hebben schijndieren een zichtbare ventrale kwab, maar bij gedeeltelijke hepatectomiedieren was de ventrale kwab volledig afwezig, wat resulteerde in een vermindering van 30% bij mannen en 20% vermindering van de verhouding tussen lever en lichaamsgewicht bij vrouwen. Op dag zeven na de operatie bij gedeeltelijke hepatectomiedieren werd de ventrale kwab niet geregenereerd en waren de lever-lichaamsgewichtverhoudingen in gedeeltelijke hepatectomie en schijncontroles vergelijkbaar, wat wijst op herwonnen levermassa na gedeeltelijke hepatectomie.
Het effect van tijd op ventrale kwabregeneratie werd bepaald door een volledige 1/3 partiële hepatectomie uit te voeren en de ventrale kwab tot de darmlengteverhouding te meten. De ventrale kwab bezette 50 tot 100% van de darmlengte bij schijncontroles, maar werd ernstig verminderd bij 1/3 gedeeltelijke hepatectomiedieren. Gedeeltelijke hepatectomiedieren op dag 36 na de operatie hadden een verhoogde ventrale kwab-darmverhouding in vergelijking met de eerste dag na de operatie.
Een statistisch significante verhoogde grootte van de ventrale kwab werd waargenomen bij dieren die herstelden van gedeeltelijke hepatectomie op dag 36 na de operatie in vergelijking met dag één, maar niet bij schijncontroles. Sommige dieren regenereerden de ventrale kwab, maar sommige niet, wat wijst op variatie in de respons op de operatie. Het meest kritieke deel van dit protocol is om de lever en de darm netjes te scheiden, zodat de ventrale kwab volledig kan worden verwijderd.
Gedeeltelijke hepatectomie bij zebravissen kan worden uitgevoerd in mutante of transgene lijnen om te meten dat genetische vereisten voor leverregeneratie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd, reproduceerbaar protocol voor het uitvoeren van een partiële hepatectomie bij volwassen zebravisjes, waardoor precieze studie van leverregeneratie mogelijk wordt. De methode stelt onderzoekers in staat om de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan leverherstel te onderzoeken, waarbij de zebravis wordt gebruikt als modelorganisme met directe klinische relevantie voor menselijke leverziekten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Regeneratieve biologie
- Leverfysiologie
- Zebravismodelsystemen
Achtergrond
- Leverfalen is een groot wereldwijd gezondheidsprobleem, met een stijgende mortaliteit door chronische leverziekten.
- Gezonde levers kunnen regenereren na letsel, maar dit vermogen is verminderd bij gevorderde ziektebeelden.
- Zebravisjes zijn een krachtig model voor het bestuderen van orgaanregeneratie, inclusief leverherstel na een partiële hepatectomie.
- Bestaande protocollen voor partiële hepatectomie bij zebravisjes variëren, wat leidt tot inconsistente resultaten.
Doel van de studie
- Het vaststellen van een efficiënt en reproduceerbaar protocol voor partiële hepatectomie bij volwassen zebravis.
- Het aantonen van het vermogen van de zebravis om de geresecteerde leverlob te regenereren.
- Het bieden van een platform voor verdere investigate van de genetische en moleculaire mechanismen van leverregeneratie.
Gebruikte methoden
- Volwassen zebravisjes worden geanestheseerd en met de ventrale zijde naar boven geplaatst in een met Tricaine doordrenkte spons.
- Er wordt een precieze incisie gemaakt om toegang te krijgen tot de lever, waarna de ventrale lob zorgvuldig van de darm wordt gescheiden en wordt geresecteerd.
- Het postoperatieve herstel wordt gemonitord en de leverregeneratie wordt beoordeeld met behulp van zowel lichtveld- als fluorescentiemicroscopie.
- De verhouding tussen het levergewicht en het lichaamsgewicht, evenals de verhouding tussen de lengte van de ventrale lob en de darm, worden op verschillende tijdstippen na de operatie gemeten.
Belangrijkste resultaten
- Een partiële hepatectomie resulteert in een aanzienlijke initiële afname van de verhouding tussen levergewicht en lichaamsgewicht (30% bij mannetjes, 20% bij vrouwtjes).
- Op dag 7 na de operatie is de levermassa grotendeels hersteld, met verhoudingen die vergelijkbaar zijn met die van de sham-controles.
- Regeneratie van de ventrale lob wordt bij sommige, maar niet alle dieren waargenomen op dag 36 na de operatie, wat wijst op variabiliteit in de regeneratieve respons.
- Het protocol kan worden toegepast op mutante of transgene zebravislijnen om de genetische vereisten voor regeneratie te bestuderen.
Conclusies
- Dit protocol maakt een precieze en reproduceerbare partiële hepatectomie mogelijk bij volwassen zebravis.
- Zebravis kan leverweefsel regenereren na chirurgische verwijdering van de ventrale lob.
- De methode faciliteert gedetailleerde studies naar de mechanismen die leverregeneratie sturen, met potentiële implicaties voor therapeutische ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Partiële hepatectomie bij volwassen zebravis biedt een reproduceerbaar, kwantitatief model voor het onderzoeken van leverregeneratiemechanismen die relevant zijn voor menselijke ziekten. Dit protocol maakt nauwkeurige weefselverwijdering en regeneratiebeoordeling mogelijk, wat bijdraagt aan target-validatie en mechanische risicoanalyse in de vroege ontdekkingsfase. De compatibiliteit met genetische en chemische hulpmiddelen positioneert dit als een fundamentele workflow voor preklinisch onderzoek naar de biologie van de lever.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt hypothese-gestuurde analyse van regeneratieve pathways na gecontroleerde leverschade mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van genetische of farmacologische targets die de leverregeneratie beïnvloeden.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door regeneratieve responsen te isoleren van systemische toxiciteit.
- Biedt kwantitatieve eindpunten voor portfolio-triage en target-prioritering.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar letselmodel vast voor downstream screening van verbindingen of genetica.
- Levert kwantitatieve resultaten, zoals lever-tot-lichaamsgewicht en lob-tot-darmverhoudingen, voor de ontwikkeling van assays.
- Maakt een reproduceerbare beoordeling van het regeneratieve vermogen over experimentele cohorten mogelijk.
- Ondersteunt schaalbaarheid en platformhergebruik in transgene of mutante zebravissenlijnen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante regeneratieve eindpunten voor translationele biomarker-exploratie.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van regeneratieve mechanismen.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van kwantitatieve regeneratiemetrieken.
- Ondersteunt voorspellende risicovermindering voor therapeutische strategieën gericht op de lever.
Integratie van pipeline en workflow
Dit protocol integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door gecontroleerde beschadiging, kwantitatieve beoordeling van regeneratie en genetische of farmacologische analyse in een gewervde modelorganisme mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden voor leverregeneratie.
- Screening: Biedt reproduceerbare letselmodellen die klaar zijn voor assays met kwantitatieve resultaten.
- Analytics: Levert meetbare eindpunten, zoals de verhouding tussen levergewicht en lichaamsgewicht en de verhouding tussen lobgewicht en darmgewicht voor comparatieve analyse.
- Translational Research: Slaat de brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie in een ziekterellevant systeem.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor genetische, chemische en mechanistische studies in de leverbiologie.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar leverregeneratie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de beoordeling van letsel en regeneratie voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige biologische risicoreductie mogelijk te maken.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en de voortgang van programma's voor regeneratieve geneeskunde.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van zebravis, microchirurgie en postoperatieve zorg.
- Vereist toegang tot fluorescentiemicroscopie en infrastructuur voor kwantitatieve beeldvorming.
- Vereist standaardisatie van chirurgische en analytische procedures over teams heen.
- Aanpasbaar aan verschillende genetische achtergronden en transgene lijnen voor mechanistische studies.
- Afhankelijk van nauwkeurige weefselscheiding om reproduceerbare regeneratieve resultaten te garanderen.
