Strategieën voor optimalisatie van cryogene elektronentomografiegegevensverwerving
19 maart 2021
De toenemende vraag naar grootschalige gegevensverzameling in cryogene elektronentomografie vereist routines voor beeldverwerving met hoge doorvoer. Hier wordt een protocol beschreven dat de recente ontwikkelingen van geavanceerde acquisitiestrategieën implementeert die gericht zijn op het maximaliseren van de tijdsefficiëntie en doorvoer van tomografische gegevensverzameling.
De installatie van een grootschalige sessie voor het verzamelen van gegevens is een tijdrovende procedure die de resterende microscooptijd die beschikbaar is voor het verkrijgen van tilt-series aanzienlijk kan verkorten. Deze methode maakt een snelle installatie van grootschalige geautomatiseerde tomografiegegevensverwerving mogelijk om de tijdefficiëntie van tomografie-experimenten te maximaliseren die een zorgvuldige selectie van acquisitiedoelen vereisen. Begin met het openen van een dummy SerialEM-exemplaar.
Zodra het eerste rastervierkant is toegewezen, gebruikt u de menuoptie SerialEM navigator merge om de montage in het dummy SerialEM-exemplaar te zien. Dubbelklik op het navigatorvenster om de vierkante kaart van het raster te openen. Doorzoek de kaart en gebruik de dummy SerialEM navigator optie punten toevoegen om afbeeldingsacquisitiepunten toe te voegen aan het doel van belang.
Nadat u de nieuwe vierkanten hebt toewijzing, slaat u het navigatorbestand op en voegt u de navigator opnieuw samen. Ga door totdat alle rastervierkanten zijn toegewezen. Voeg nogmaals het navigatorbestand samen met het dummy SerialEM-exemplaar.
Voer het pi em virtuele kaarten script uit vanuit het dummy SerialEM menu. Selecteer gereedschappen en selecteer virtuele ankertoewijzingen. Dit kan enige tijd duren, afhankelijk van de grootte en hoeveelheid van de vierkante rasterkaarten, evenals de binning van de weergave- en voorbeeldkaarten.
Gebruik dezelfde vergrotings- en bundelgrootte-instelling voor gegevensverzameling in de volgende volgorde om de juiste microscoopprestaties te garanderen. Voer SerialEM coma-vrije uitlijning uit door CTF. Plaats en centreer een objectief diafragma.
Voer SerialEM correct astigmatisme uit door CTF en GIF quick tune. Open in SerialEM het nieuwe navigatorbestand. Alle A-punten de-selecteren.
Selecteer de kaarten van de eerste weergave. Selecteer samenvouwen. Klik tweemaal op A en de-selecter samenvouwen.
Selecteer de positie van de kaart van de eerste weergave. Druk op Shift T, selecteer vervolgens de allerlaatste weergavekaartpositie en druk nogmaals op Shift T. Kies afbeeldingen met één frame in de eigenschappen van het bestand om een dialoogvenster te openen.
Selecteer in het volgende dialoogvenster bestandseigenschappen de gewenste parameters op basis van de beeldbehoeften en de instelling van het instrument. Geef op de vraag een naam met een nummer en klik op opslaan. Stel de controller van de tilt-serie in voor de eerste TS-positie.
Als u klaar bent, klikt u op OK om deze parameters in te stellen voor alle kantelreeksen na dit verwervingsitem. Alle voorbeeldtoewijzingen zijn nu geselecteerd als TS met een genummerde bestandsnaam. Stel indien nodig de scherpstel-/spoorafstand in voor elk doel.
Dubbelklik op de weergavekaart om deze te laden. Selecteer de voorbeeldkaart in de navigatorlijst. Selecteer vervolgens de bewerkfocus in het navigatorvenster.
In het bedieningspaneel met lage dosis draait u de inter-area as om de proef te positioneren en scherp te stellen langs de kantelas van het werkgebied. Klik op het gewenste gebied in de geladen weergavekaart om de focusproefpositie voor deze kantelreeks in te stellen en ervoor te zorgen dat het navigatoritem TSP-ingesteld heeft. Herhaal de procedure voor alle items.
Bewerk het scherpstelbereik in het script PreTomo dat vóór elke kantelreeks wordt uitgevoerd. Controleer in het menu SerialEM tilt series het run script in TS en selecteer het scriptnummer van het DuringTomo script tijdens elke tilt. Controleer het niveau van de stikstoftank en of de turbo van de autolader is geselecteerd.
Controleer de vrije ruimte voor gegevensopslag. Selecteer in het menu SerialEM-bestand de continue opslag voor het logboekbestand. Elke tilt-serie krijgt zijn eigen logbestand.
Nadat u op acquire hebt geklikt bij items in het navigatiemenu, voert u het script PreTomo uit. Selecteer primaire taak verwerven tilt-reeksen en selecteer vervolgens script uitvoeren na PostTomo. Selecteer kolomkleppen aan het einde sluiten en stuur e-mail aan het einde en klik vervolgens op go.
71 geschikte vierkanten werden geselecteerd op de rasterkaart bij een lagere vergroting. Middelgrote vergrotingskaarten werden verkregen met instellingen die de directe visualisatie en identificatie van het voorbeeld van interesse mogelijk maken, coronavirussen in dit geval. De acquisitietijd was drie minuten per vierkant, drie uur en 45 minuten in totaal.
Toen de eerste vierkante kaart werd gemaakt, werd een dummy SerialEM-exemplaar geopend op een afzonderlijke computer om de vierkante kaart te visualiseren en punten toe te voegen aan doelen die geschikt zijn voor het verkrijgen van tilt-reeksen. SerialEM lage dosis werd ingesteld en referentieweergave en voorbeeldafbeeldingen werden genomen en opgeslagen als kaarten. De laatste kaarten kunnen vervolgens onmiddellijk op het dummy SerialEM-exemplaar worden gebruikt om de virtuele weergave en virtuele preview van de bijbehorende vierkante kaartafbeeldingen te genereren.
De virtuele weergave kaarten werden gebruikt voor een eerste centreren van het doel, gevolgd door een laatste centreren uitgevoerd bij de werkelijke vergroting van de vergroting van de kantel reeks met behulp van de virtuele voorbeeld kaart. Gebruikers moeten zichzelf voldoende tijd gunn om het voorbeeldlandschap te verkennen. Na het doorzoeken van enkele kaarten, ontwikkelt men een beter gevoel voor gebieden van goede kwaliteit om gegevens van te verzamelen.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een efficiënte workflow voor grootschalige geautomatiseerde cryogene elektronentomografie (cryoET) data-acquisitie, met de focus op het maximaliseren van de microscopietijd en het stroomlijnen van de selectie van acquisitiedoelen. Door gebruik te maken van SerialEM-scripting en PyEM-software maakt deze methode geautomatiseerde grid-mapping, doelselectie en de acquisitie van tilt-series mogelijk, waardoor de handmatige interventie en de opsteltijd aanzienlijk worden verminderd.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Cryogene elektrontomografie (cryoET)
- Structurele biologie
- Automatisering van elektronenmicroscopie
Achtergrond
- CryoET maakt 3D-visualisatie van biologische monsters in een bijna-natuurlijke toestand mogelijk.
- Hoge-resolutiestructuren vereisen de acquisitie van talrijke tilt-series met behulp van geavanceerde elektronenmicroscopen.
- Handmatige selectie van interessante regio's is tijdrovend en beperkt de doorvoersnelheid van de microscoop.
- Geautomatiseerde routines voor data-acquisitie zijn verbeterd, maar de selectie van doelgebieden blijft een knelpunt.
Doel van de studie
- Een protocol presenteren dat de mapping van grids en gridvakken, evenals de acquisitie van tilt-series in cryo-ET automatiseert.
- Demonstreren hoe SerialEM en PyEM kunnen worden gebruikt om grootschalige dataverzameling te stroomlijnen.
- De toepassing van het protocol illustreren bij het verzamelen van Sars-Cov-2 tilt-series data.
Gebruikte methoden
- Instellen van een dummy SerialEM-instantie voor mapping en doelselectie.
- Geautomatiseerde mapping en samenvoeging van gridvelden met behulp van SerialEM-navigator-tools.
- Genereren van virtuele view- en preview-kaarten voor het centreren van doelen.
- Geautomatiseerde acquisitie van tilt-series met scripting voor focus, uitlijning en databeheer.
Belangrijkste resultaten
- Er werden 71 geschikte rastervierkanten geselecteerd en in kaart gebracht bij een lage vergroting.
- Kaarten bij een gemiddelde vergroting maakten directe visualisatie en identificatie van doelen (bijv. coronavirussen) mogelijk.
- De acquisitietijd bedroeg ongeveer drie minuten per vierkant, wat neerkwam op in totaal drie uur en 45 minuten.
- Virtuele kaarten vergemakkelijkten het efficiënt centreren en targeten voor de acquisitie van tilt-series.
Conclusies
- Het protocol verbetert de tijdefficiëntie van cryoET-gegevensverzameling aanzienlijk.
- Geautomatiseerde mapping en doelselectie verminderen de handmatige werklast en maximaliseren het gebruik van de microscoop.
- De workflow is bijzonder geschikt voor experimenten die een zorgvuldige doelselectie en high-throughput acquisitie van tilt-series vereisen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Efficiënte data-acquisitie via cryogene elektronentomografie (cryoET) is cruciaal voor structurele biologie met een hoge resolutie, waardoor een snelle en reproduceerbare 3D-analyse van macromoleculaire complexen mogelijk wordt. Geautomatiseerde workflows met SerialEM en PyEM stroomlijnen het mappen van grids en de selectie van targets, wat de benutting van de microscoop maximaliseert en operationele knelpunten vermindert. Deze vorderingen hebben een directe impact op vroege ontdekkings- en structurele validatie-pipelines in biopharmaceutische R&D.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Versnelt de structurele analyse van biologische complexen in een bijna-natuurlijke staat.
- Ondersteunt functionele target-validatie door high-throughput acquisitie van tilt-series mogelijk te maken.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen bij de analyse van macromoleculaire complexen voor portfolio-triage.
Screening & assayontwikkeling
- Maakt de voorbereiding van gevalideerde 3D-structurele datasets mogelijk voor downstream screeningsworkflows.
- Standaardiseert acquisitieroutines, waardoor de reproduceerbaarheid en de kwaliteit van de kwantitatieve output worden verbeterd.
- Faciliteert schaalbare, geautomatiseerde gegevensverzameling voor betrouwbare platforms voor verbindingsevaluatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt de acquisitie van structurele gegevens uit op ziekte-relevante systemen, zoals virusdeeltjes.
- Waarborgt continuïteit van imaging in de ontdekkingsfase naar preklinische structurele validatie.
- Vermindert risico's in translationeel onderzoek door ondersteuning van robuuste, high-throughput datageneratie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze geautomatiseerde cryoET-workflow integreert alle fasen van vroege ontdekking tot aan lead-identificatie en preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van het testen van structurele hypothesen en het verminderen van risico's bij target-selectie.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt snelle hypothesetoetsing en verduidelijking van pathways mogelijk via 3D-beeldvorming met een hoge resolutie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve tilt-series datasets voor assay-gereedheid.
- Analytica: Biedt gestandaardiseerde metingen en read-outs voor vergelijkende structurele analyse.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers en preklinische continuïteit bij het in beeld brengen van ziekte-relevante complexen.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Vestigt een schaalbaar, herbruikbaar platform voor geautomatiseerde acquisitie van tomografische gegevens over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit in structurele studies.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoer van data-acquisiesessies.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie mogelijk door de instrumentatietijd te maximaliseren.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van structureel gevalideerde targets.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in cryoEM-instrumentatie en software voor data-analyse.
- Is afhankelijk van toegang tot hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscopen en computationele infrastructuur.
- Vereist standaardisatie van acquisitieparameters en datamanagementpraktijken tussen teams.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende monstertypes of gridformaten.
- Operationele beperkingen omvatten handmatige invoer voor de initiële doelwitselectie en kwaliteitsbeoordeling.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
