Strategieën voor optimalisatie van cryogene elektronentomografiegegevensverwerving
March 19th, 2021
De toenemende vraag naar grootschalige gegevensverzameling in cryogene elektronentomografie vereist routines voor beeldverwerving met hoge doorvoer. Hier wordt een protocol beschreven dat de recente ontwikkelingen van geavanceerde acquisitiestrategieën implementeert die gericht zijn op het maximaliseren van de tijdsefficiëntie en doorvoer van tomografische gegevensverzameling.
De installatie van een grootschalige sessie voor het verzamelen van gegevens is een tijdrovende procedure die de resterende microscooptijd die beschikbaar is voor het verkrijgen van tilt-series aanzienlijk kan verkorten. Deze methode maakt een snelle installatie van grootschalige geautomatiseerde tomografiegegevensverwerving mogelijk om de tijdefficiëntie van tomografie-experimenten te maximaliseren die een zorgvuldige selectie van acquisitiedoelen vereisen. Begin met het openen van een dummy SerialEM-exemplaar.
Zodra het eerste rastervierkant is toegewezen, gebruikt u de menuoptie SerialEM navigator merge om de montage in het dummy SerialEM-exemplaar te zien. Dubbelklik op het navigatorvenster om de vierkante kaart van het raster te openen. Doorzoek de kaart en gebruik de dummy SerialEM navigator optie punten toevoegen om afbeeldingsacquisitiepunten toe te voegen aan het doel van belang.
Nadat u de nieuwe vierkanten hebt toewijzing, slaat u het navigatorbestand op en voegt u de navigator opnieuw samen. Ga door totdat alle rastervierkanten zijn toegewezen. Voeg nogmaals het navigatorbestand samen met het dummy SerialEM-exemplaar.
Voer het pi em virtuele kaarten script uit vanuit het dummy SerialEM menu. Selecteer gereedschappen en selecteer virtuele ankertoewijzingen. Dit kan enige tijd duren, afhankelijk van de grootte en hoeveelheid van de vierkante rasterkaarten, evenals de binning van de weergave- en voorbeeldkaarten.
Gebruik dezelfde vergrotings- en bundelgrootte-instelling voor gegevensverzameling in de volgende volgorde om de juiste microscoopprestaties te garanderen. Voer SerialEM coma-vrije uitlijning uit door CTF. Plaats en centreer een objectief diafragma.
Voer SerialEM correct astigmatisme uit door CTF en GIF quick tune. Open in SerialEM het nieuwe navigatorbestand. Alle A-punten de-selecteren.
Selecteer de kaarten van de eerste weergave. Selecteer samenvouwen. Klik tweemaal op A en de-selecter samenvouwen.
Selecteer de positie van de kaart van de eerste weergave. Druk op Shift T, selecteer vervolgens de allerlaatste weergavekaartpositie en druk nogmaals op Shift T. Kies afbeeldingen met één frame in de eigenschappen van het bestand om een dialoogvenster te openen.
Selecteer in het volgende dialoogvenster bestandseigenschappen de gewenste parameters op basis van de beeldbehoeften en de instelling van het instrument. Geef op de vraag een naam met een nummer en klik op opslaan. Stel de controller van de tilt-serie in voor de eerste TS-positie.
Als u klaar bent, klikt u op OK om deze parameters in te stellen voor alle kantelreeksen na dit verwervingsitem. Alle voorbeeldtoewijzingen zijn nu geselecteerd als TS met een genummerde bestandsnaam. Stel indien nodig de scherpstel-/spoorafstand in voor elk doel.
Dubbelklik op de weergavekaart om deze te laden. Selecteer de voorbeeldkaart in de navigatorlijst. Selecteer vervolgens de bewerkfocus in het navigatorvenster.
In het bedieningspaneel met lage dosis draait u de inter-area as om de proef te positioneren en scherp te stellen langs de kantelas van het werkgebied. Klik op het gewenste gebied in de geladen weergavekaart om de focusproefpositie voor deze kantelreeks in te stellen en ervoor te zorgen dat het navigatoritem TSP-ingesteld heeft. Herhaal de procedure voor alle items.
Bewerk het scherpstelbereik in het script PreTomo dat vóór elke kantelreeks wordt uitgevoerd. Controleer in het menu SerialEM tilt series het run script in TS en selecteer het scriptnummer van het DuringTomo script tijdens elke tilt. Controleer het niveau van de stikstoftank en of de turbo van de autolader is geselecteerd.
Controleer de vrije ruimte voor gegevensopslag. Selecteer in het menu SerialEM-bestand de continue opslag voor het logboekbestand. Elke tilt-serie krijgt zijn eigen logbestand.
Nadat u op acquire hebt geklikt bij items in het navigatiemenu, voert u het script PreTomo uit. Selecteer primaire taak verwerven tilt-reeksen en selecteer vervolgens script uitvoeren na PostTomo. Selecteer kolomkleppen aan het einde sluiten en stuur e-mail aan het einde en klik vervolgens op go.
71 geschikte vierkanten werden geselecteerd op de rasterkaart bij een lagere vergroting. Middelgrote vergrotingskaarten werden verkregen met instellingen die de directe visualisatie en identificatie van het voorbeeld van interesse mogelijk maken, coronavirussen in dit geval. De acquisitietijd was drie minuten per vierkant, drie uur en 45 minuten in totaal.
Toen de eerste vierkante kaart werd gemaakt, werd een dummy SerialEM-exemplaar geopend op een afzonderlijke computer om de vierkante kaart te visualiseren en punten toe te voegen aan doelen die geschikt zijn voor het verkrijgen van tilt-reeksen. SerialEM lage dosis werd ingesteld en referentieweergave en voorbeeldafbeeldingen werden genomen en opgeslagen als kaarten. De laatste kaarten kunnen vervolgens onmiddellijk op het dummy SerialEM-exemplaar worden gebruikt om de virtuele weergave en virtuele preview van de bijbehorende vierkante kaartafbeeldingen te genereren.
De virtuele weergave kaarten werden gebruikt voor een eerste centreren van het doel, gevolgd door een laatste centreren uitgevoerd bij de werkelijke vergroting van de vergroting van de kantel reeks met behulp van de virtuele voorbeeld kaart. Gebruikers moeten zichzelf voldoende tijd gunn om het voorbeeldlandschap te verkennen. Na het doorzoeken van enkele kaarten, ontwikkelt men een beter gevoel voor gebieden van goede kwaliteit om gegevens van te verzamelen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol dat is ontworpen om de efficiëntie van cryogeen elektronentomografie te verbeteren en aandacht schenkt aan de behoefte aan grootschalige gegevensverzameling. De methode richt zich op het optimaliseren van de beeldvormingsopstelling om een hoge doorvoer tijdens de aanschaf van kantelserieën te garanderen, waardoor het gebruik van microscoop aanzienlijk wordt verbeterd.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Cryogene elektronentomografie
- Beeldverwerving met hoge doorvoer
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Toenemende vraag naar grootschalige gegevensverzameling
- Tijdrovende setups kunnen de effectieve microscooptijd beperken
- Belang van efficiënte tomografische gegevensverzamelingmethoden
Gebruikte methoden
- Protocol voor geautomatiseerde tomografie-gegevensverzameling
- Gebruik van SerialEM voor het navigeren van rastervierkantmapping
- Implementatie van virtuele kaarten voor doelcentrering
Hoofdresultaten
- 71 rastervierkanten werden geïdentificeerd voor gegevensverzameling
- Efficiënte gegevensverzameling met een totale verzameltijd van 3 uur en 45 minuten
- Aangetoonde mogelijkheid om coronavirusmonsters effectief te visualiseren
Conclusies
- Deze studie illustreert een gestroomlijnde aanpak voor beeldverwerving met hoge doorvoer in tomografie
- De bevindingen benadrukken het belang van het maximaliseren van de verzamelefficiëntie in biologisch onderzoek
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient cryogenic electron tomography (cryoET) data acquisition is critical for high-resolution structural biology, enabling rapid and reproducible 3D analysis of macromolecular complexes. Automated workflows using SerialEM and PyEM streamline grid mapping and target selection, maximizing microscope utilization and reducing operational bottlenecks. These advances directly impact early discovery and structural validation pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates structural interrogation of biological assemblies in near-native states.
- Supports functional target validation by enabling high-throughput acquisition of tilt series.
- Improves predictive confidence in macromolecular complex analysis for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Enables preparation of validated 3D structural datasets for downstream screening workflows.
- Standardizes acquisition routines, enhancing reproducibility and quantitative output quality.
- Facilitates scalable, automated data collection for reliable compound evaluation platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data acquisition with disease-relevant systems, such as viral particles.
- Ensures continuity from discovery-stage imaging to preclinical structural validation.
- Reduces risk in translational research by supporting robust, high-throughput data generation.
Pipeline & Workflow Integration
This automated cryoET workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting structural hypothesis testing and target de-risking.
- Discovery Biology: Enables rapid hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution 3D imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative tilt series datasets for assay readiness.
- Analytics: Delivers standardized measurements and readouts for comparative structural analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when imaging disease-relevant complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for automated tomography data acquisition across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of data acquisition sessions.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by maximizing instrument time.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM instrumentation and data analysis software.
- Depends on access to high-end transmission electron microscopes and computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters and data management practices.
- May require adaptation for different sample types or grid formats.
- Operational limitations include manual input for initial target selection and quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
