Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen
31 maart 2021
Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.
Dit protocol beschrijft een methode om een goed gekarakteriseerde populatie van menselijke hemogene endotheelcellen te genereren. Deze cellen kunnen worden gebruikt om de moleculaire regulatie en endotheel-naar-hematopoietische overgang te bestuderen. Begin met het kweken van menselijke embryonale stamcellen gedurende vier dagen om ze te differentiëren in primordiale endotheelcellen.
Op dag vijf aspirateer je het medium boven de cellen. Was de cellen vervolgens voorzichtig met één milliliter DMEM/F-12 per putje. Voeg één milliliter vers bereid hemogeen endotheelceldifferentiatiemedium per put toe en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
Vervang op dag zes en dag zeven het medium boven de cellen door één milliliter vers bereid homogeen homogeen endotheelceldifferentiatiemedium per put en incubeer de cellen nog eens 24 uur. Op dag acht. na het losmaken en wassen van de cellen, verdeel ze gelijkmatig in microcentrifugebuizen op ijs, elk met minimaal 600 microliter cellen met een dichtheid van 1 keer 10 tot de 5e cellen per milliliter.
Voeg antilichamen toe aan de buizen die cellen bevatten en incubeer op ijs beschermd tegen licht gedurende 30 minuten. Pelleteer de cellen door centrifugeren op 1000 keer G en 4 graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspenseer de pellets in 600 microliter ijskoude sorteerbuffer.
Zeef de monsters door de mesh filterdop van vijf milliliter FACS-buizen en sla de cellen op ijs beschermd tegen licht voor onmiddellijke celsortering. Om hemogene endotheelcellen te isoleren door FACS, moet eerst de CD45-negatieve celpopulatie worden afgesloten. Dan binnen de CD45-negatieve populatie, gate de CD31-positieve cellen.
Volgende binnen de CD31-positieve populatie, poort voor de VE-cadherine-negatieve celpopulatie. En dan binnen de VE-cadherine-negatieve populatie, poort voor de c-Kit-positieve cellen. Van de c-Kit-positieve populatie, poort de CD34-positieve celpopulatie.
En ten slotte van de CD34-positieve celpopulatie, identificeer en verzamel de KDR-positieve cellen. Na het zaaien van hemogene endotheelcellen in een op methylcellulose gebaseerd medium geformuleerd voor groei van hematopoëtische voorlopercellen, worden kolonievormende unit-erytroïde kolonies en blastvormende eenheid-erytroïde kolonies geteld op dag acht. Kolonievormende eenheid-granulocyt-macrofaag en kolonievormende eenheid-granulocyt, erytroïde, macrofaag en megacaryocyt.
Multipotente hematopoëtische voorloperkolonies worden geteld op dag 14. Per 1000 hemogene endotheelcellen die worden geplateerd, worden ongeveer 20 kolonievormende eenheden gegenereerd. Cellen met endotheelcelmorfologie zijn ook zichtbaar in de culturen.
Dit zijn de hemogene endotheelcellen die aanleiding geven tot multilineaire hematopoëtische voorlopercellen op eencellig niveau. Dit protocol is een 2D-serum en murine feeder-vrij kweeksysteem dat menselijke hemogene endotheelcellen in ongeveer een week kan genereren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het afleiden van hemogene endotheliale cellen uit menselijke embryonale stamcellen in ongeveer één week. De methode stelt onderzoekers in staat om een goed gekarakteriseerde populatie van deze cellen te genereren, die cruciaal zijn voor het bestuderen van de endotheliale-naar-hematopoëtische transitie en potentiële toepassingen hebben in de regeneratieve geneeskunde en de productie van bloedproducten.
Belangrijkste Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Vasculaire biologie
- Hematopoëse
- Tissue engineering
Achtergrond
- Bloedvaten zijn essentieel voor de weefselfunctie en zijn bekleed met vasculaire endotheelcellen.
- Hemogene endotheelcellen zijn een gespecialiseerd subtype dat tijdens de ontwikkeling hematopoëtische stam- en progenitorcellen voortbrengt.
- Het in vitro genereren van deze cellen is waardevol voor het bestuderen van de bloedcelontwikkeling en voor potentiële therapeutische toepassingen.
- Bestaande protocollen voor de afleiding van endotheelcellen leveren geen goed gekarakteriseerde hemogene endotheelcellen op vanuit menselijke stamcellen.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar protocol vast te stellen voor het genereren van hemogene endotheelcellen uit menselijke embryonale stamcellen.
- Om de studie van moleculaire regulatie en de endotheel-naar-hematopoëtische transitie in vitro mogelijk te maken.
- Om een feeder-vrij, serumvrij systeem te bieden dat geschikt is voor downstream-applicaties.
Gebruikte methoden
- Kweek van menselijke embryonale stamcellen en stapsgewijze differentiatie gedurende acht dagen.
- Inductie van mesodermale en endotheliale lijnen met behulp van specifieke groeifactoren en kleine moleculen (bijv. GSK3β-remmer, bFGF, BMP4, VEGF-A, retinoïnezuur).
- Flowcytometrie (FACS) voor sequentiële gating en isolatie van hemogene endotheliale cellen op basis van oppervlaktemarkers (CD45-, CD31+, VE-cadherine-, c-Kit+, CD34+, KDR+).
- Functionele beoordeling via colony-forming assays in een medium op basis van methylcellulose om het hematopoëtische potentieel te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol levert binnen één week een gedefinieerde populatie hemogene endotheelcellen op.
- Er worden ongeveer 20 colony-forming units per 1000 hemogene endotheelcellen gegenereerd, wat wijst op een robuust hematopoëtisch potentieel.
- Zowel erytroïde als multipotente hematopoëtische progenitorcolonies worden waargenomen.
- De morfologie van de endotheelcellen blijft in kweek behouden, wat de celidentiteit bevestigt.
Conclusies
- Dit feeder-vrije en serumvrije protocol genereert op efficiënte wijze menselijke hemogene endotheelcellen uit embryonale stamcellen.
- De methode faciliteert in vitro studies naar de endotheel-naar-hematopoëtische transitie en moleculaire regulatie.
- Het biedt een platform voor potentiële ex vivo generatie van bloedproducten en vermindert de afhankelijkheid van menselijke donoren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Gerichte differentiatie van hemogene endotheliale cellen uit menselijke pluripotente stamcellen pakt een kritieke flessenhals aan bij het modelleren van de hematopoëtische ontwikkeling en het ex vivo genereren van bloedlijnen. Deze mogelijkheid maakt een mechanische risicoreductie van de endotheliaal-naar-hematopoëtische transitie mogelijk en ondersteunt het voorspellende vertrouwen in vroege stadia van celtherapie- en regeneratieve geneeskundige pijplijnen. Het feeder-vrije en serum-vrije ontwerp van het protocol verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor R&D-portfolio's in de zakelijke sector.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar moleculaire pathways die de endotheel-naar-hematopoëtische transitie reguleren.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie voor factoren die de specificatie van bloedlijnen beïnvloeden.
- Faciliteert predictieve risicoanalyse van kandidaat-targets in de hematopoëtische ontwikkeling.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, goed gekarakteriseerde celpopulatie voor daaropvolgende functionele assays.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van hematopoëtische kolonievorming uit gedefinieerde progenitorcellen mogelijk.
- Ondersteunt reproduceerbare screening van modulatoren die het endotheliale of hematopoëtische lot beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stelt een platform vast voor het modelleren van ziekterelateerde hematopoëtische defecten in vitro.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie van strategieën voor de generatie van bloedcellen.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van celgebaseerde therapeutische concepten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door de robuuste generatie en isolatie van hemogene endotheliale cellen mogelijk te maken voor mechanistische studies en functionele assays.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten over de moleculaire regulatie van het ontstaan van bloedlijnen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve colony-forming resultaten voor comparatieve analyse.
- Analytics: Biedt flowcytometrie-gebaseerde gating en koloniekwantificering voor objectieve readouts.
- Translational Research: Slaat een brug tussen in vitro modellering en preklinische evaluatie van het hematopoëtische potentieel.
- Enterprise Reuse: Biedt een schaalbaar, feeder-vrij systeem dat aanpasbaar is voor verschillende stamcellijnen en ziektemodellen.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de modellering van hematopoëtische lijnen en targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor celdifferentiatie.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming voor programma's op het gebied van celtherapie en regeneratieve geneeskunde.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutische kandidaatcellen in een vroeg stadium mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in kweek- en differentiatieprotocollen voor menselijke pluripotente stamcellen.
- Vereist toegang tot flowcytometrie-instrumentatie voor multi-parameter cellsorting.
- Noodzaakt standaardisatie van gating-strategieën en koloniekwantificering tussen teams.
- Aanpasbaar aan verschillende menselijke stamcellijnen via protocoloptimalisatie.
- Afhankelijk van gevalideerde antilichaampanels en functionele assays op basis van methylcellulose.
