Precisie gesneden longplakken als een efficiënt hulpmiddel voor ex vivo longvatstructuur en contractiliteitsstudies
May 24th, 2021
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het behoud van de vasculaire contractiliteit van PCLS-muizenlongweefsel, wat resulteert in een geavanceerd driedimensionaal beeld van de pulmonale vasculatuur en de luchtwegen, die tot 10 dagen kunnen worden bewaard en die vatbaar zijn voor tal van procedures.
Precisie gesneden longplakken methode zal de structuur en ruimtelijke oriëntaties in drie dimensies behouden zonder regionale vertekening en kan dienen als een live surrogaatmodel voor vaten en luchtwegcontractiliteitsmetingen. In combinatie met time-lapse beeldvorming, Western blot en RNA-analyse dragen nauwkeurig gesneden longplakken bij aan het uitgebreide begrip van signaleringscascades die ten grondslag liggen aan een breed scala aan aandoeningen en leiden tot een beter begrip van de pathofysiologie bij pulmonale vaatziekten. Plaats om te beginnen de geëuthanaseerde volwassen muis in rugligging en zet hem op zijn plaats door de poten en neus met plakband op de tafel te plakken.
Spuit het ventrale oppervlak van de muis met 70% ethanol. Gebruik een tang om de buikhuid van de muis op de locatie van de blaas op te tillen en een chirurgische schaar om in de middellijn te knippen, waarbij je superieur naar het cervicale gebied beweegt om de luchtpijp bloot te leggen. Gebruik vervolgens een pincet om de onderliggende fascialaag op te tillen en gebruik een chirurgische schaar om de viscerale organen en het mediastinale compartiment bloot te leggen, waarbij opnieuw inferieur aan superieur wordt gesneden.
Snijd het borstbeen aan de middellijn om het hart en de longen bloot te leggen. Ontleed het middenrif zorgvuldig van de lever en het buikcompartiment. Lokaliseer de inferieure vena cava onder de darmen en snijd deze.
Gebruik na het lokaliseren van de rechter ventrikel een vlindernaald van 25 tot 30 gauge om 0,5 milliliter 1% gefractioneerde heparine in de rechter ventrikel te injecteren en deze langzaam maar gestaag te spoelen met 10 tot 15 millimeter PBS. Gebruik na het lokaliseren van het strottenhoofd een stompe pincet om de omliggende fascia en weefsel te ontleden, plaats vervolgens de chirurgische hechting onder de luchtpijp en bind losjes een chirurgische knoop. Plaats een klein gaatje in de luchtpijp dat superieur is aan de snaar en cannuleer met een 20 gauge stompe naald.
Span de hechtdraad rond de naald en luchtpijp aan met behulp van een chirurgische knoop. Injecteer vervolgens 2,5 tot 4 milliliter agarose in de luchtpijp en controleer op inflatie van de long. Giet na de agarose-injectie koude PBS over de long om de agarose te stollen.
Snijd vervolgens de luchtpijp die superieur is aan de chirurgische hechting en ontleed de long en het hart van het mediastinum door eventuele verklevingen en fascia te verwijderen. Plaats na stolling het weefsel in DMEM in een petrischaaltje op ijs en ga onmiddellijk over tot het snijden van één kwab met behulp van een trilmachine. Om de longplakken te bereiden, bevestigt u het monster met secondelijm aan het platform, waarbij de mediale kant naar boven gericht blijft.
Vul vervolgens de monstercontainer met PBS. Vul de container met ijs om de omringende PBS en monster koud te houden. Schakel de trilling in.
Pas de dikte aan tot 300 micrometer, frequentie tot 100 Hertz, amplitude tot 0,6 millimeter en snelheid tot vijf micrometer per seconde. Gebruik een inbussleutel om de bladhouder in de veilige positie te draaien en de kaken te openen om een mes in te brengen. Span vervolgens de kaken aan met een inbussleutel.
Plaats het monster op de doos en zorg ervoor dat het wordt ondergedompeld in PBS. Schuif de doos in de juiste positie omhoog en zorg ervoor dat deze veilig is. Draai de meshouder in de juiste positie om te snijden.
Breng het trilmes tot aan de rand van het blok en laat het mes handmatig zakken totdat het gelijk is met de bovenkant van het monster. Bevestig de instellingen en voer de vibratome uit. Nadat de verse plakjes zijn gesneden, verwijdert u de monsters uit de PBS en plaatst u ze in een steriel petrischaaltje met 10 milliliter DMEM met eenmalig antimycotisch antibioticum.
Nadat u alle plakjes in een petrischaal hebt geplaatst, trekt u het mes volledig in en gebruikt u de inbussleutel om het mes in een veilige positie te brengen. Bewaar de monsters in DMEM bij 37 graden Celsius. En leg een vibratome slice op een microscoopglaasje.
Gebruik een reinigingsdoekje om overtollig medium te verwijderen. Plaats het monster op de fasecontrastmicroscopie en gebruik 10 tot 20x vergroting om een vat te identificeren. Voeg vervolgens 500 microliter vasoconstrictoren toe, zoals 60 millimolair kaliumchloride of één micromolair endotheline-1 om de dia volledig onder te dompelen.
Observeer en leg de video vast door gedurende 30 tot 60 seconden op te nemen. Voordat u met het experiment begint, vult u een kleine polystyreenschuimdoos met één liter vloeibare stikstof en plaatst u twee microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter in de container met vloeibare stikstof. Doe vier tot vijf verse plakjes vibratome in een vijzelkom.
Giet 5 tot 10 milliliter vloeibare stikstof over de plakjes en gebruik snel de stamper om de plakjes tot poeder te malen voordat de vloeibare stikstof verdampt. Gebruik een voorgekoelde stalen laboratoriumschep om het poeder in de twee gekoelde microcentrifugebuizen te scheppen en het poeder te lyseren door 500 microliter RNA-extractiereagens toe te voegen voor RNA-isolatie of 500 microliter RIPA-buffer voor eiwitlysis. In het representatieve levensvatbaarheidsexperiment werd de kleurverandering van de PCLS-plakjes gedetecteerd van dag nul tot één en dag negen tot 10.
De oplossing was aanvankelijk blauw en werd 's nachts roze, wat de levensvatbaarheid aantoonde. Kleurverandering trad meestal op binnen één tot vier uur, maar een langere tijd kan nodig zijn. Het dagelijkse verschil tussen absorptie op golflengten van 562 en 613 nanometer voor het vibratome-geprepareerde weefsel wordt hier weergegeven.
De vernauwing van de vasculatuur in een vibratome-geprepareerd longweefsel met behulp van endotheline-1 en kaliumchloride kan hier worden gevisualiseerd. Het behoud van tdTomato-etikettering in cellen een week na tamoxifeninjectie wordt aangetoond in deze longplakken. Het is het belangrijkst om de longreinigings- en inflatiestap goed uit te voeren om al het bloed uit de bloedsomloop te verwijderen voordat aanvullende experimenten en beeldvorming worden uitgevoerd.
Naast vaatziekten kan PCLS worden toegepast om de fysiobiologie van luchtweggerelateerde ziekten te bestuderen en kan het verder worden getest op menselijke longweefsels in klinisch relevante scenario's.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het behoud van de vasculaire contractiliteit van precisie gesneden longslices (PCLS) van muis longweefsel. Deze methode maakt geavanceerde driedimensionale beeldvorming van de pulmonaire vaatbundel en luchtwegen mogelijk, die tot 10 dagen kan worden onderhouden en geschikt is voor verschillende experimentele procedures.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Pulmonair vaatkundig onderzoek
- Experimentele biologie
Achtergrond
- Precisie gesneden longslices behouden structurele integriteit en ruimtelijke oriëntatie.
- Deze methode vermijdt regionale bias in contractiliteitsmetingen.
- PCLS dienen als een levend surrogaatmodel voor het bestuderen van pulmonaire vaatziekten.
- Time-lapse beeldvorming en moleculaire analyses verbeteren het begrip van ziektemechanismen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het behoud van de longweefsel contractiliteit.
- Om de studie van signaalroutes in pulmonaire aandoeningen te faciliteren.
- Om het begrip van de pathofysiologie in pulmonaire vaatziekten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van precisie gesneden longslices van geëuthanaseerd volwassen muizen.
- Gebruik van time-lapse beeldvorming voor dynamische observatie.
- Western blot en RNA-analyse voor moleculaire karakterisering.
- Onderhoud van slices gedurende maximaal 10 dagen voor experimentele procedures.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle behoud van vasculaire contractiliteit in PCLS.
- Driedimensionale beeldvorming onthult gedetailleerde pulmonaire architectuur.
- De methode maakt een uitgebreide analyse van contractiliteit en signaalroutes mogelijk.
- Draagt bij aan het begrip van mechanismen van pulmonaire vaatziekten.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor pulmonair onderzoek.
- PCLS kunnen worden gebruikt voor verschillende experimentele benaderingen.
- Deze methode verbetert de studie van pulmonaire vaatziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Precision-cut lung slices (PCLS) provide a physiologically relevant ex vivo platform for evaluating pulmonary vessel structure and contractility, addressing key challenges in preserving native tissue architecture and function. This method enables integrated imaging, functional assays, and molecular analyses, supporting predictive confidence in early-stage pulmonary drug discovery. PCLS enhances translational continuity and de-risking for portfolio decisions in pulmonary vascular and airway disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pulmonary vessel contractility and signaling pathways in a preserved tissue context.
- Supports biological de-risking by maintaining three-dimensional lung architecture and cellular composition.
- Facilitates functional target validation through live imaging and response to vasoconstrictors.
- Improves predictive confidence for advancing pulmonary targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides validated ex vivo lung tissue for reproducible contractility and viability assays.
- Enables quantitative measurement of vessel responses to pharmacological agents using time-lapse imaging.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in pulmonary research.
- Allows for integration with molecular analyses such as RNA and protein extraction.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying pulmonary vascular and airway pathophysiology.
- Maintains translational biomarker continuity by enabling visualization of genetically labeled cells.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions through comprehensive functional and molecular readouts.
- Supports adaptation to human lung tissue for clinically relevant research scenarios.
Pipeline & Workflow Integration
PCLS fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical research, enabling integrated functional and molecular analyses of pulmonary tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in a physiologically relevant lung model.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative contractility and viability outputs for compound assessment.
- Analytics: Provides real-time imaging, absorbance measurements, and molecular data for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation with disease-relevant tissue and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable ex vivo platform adaptable to various pulmonary research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pulmonary target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of lung tissue assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing comprehensive functional and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of pulmonary disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine lung dissection, tissue handling, and vibratome operation.
- Needs access to confocal microscopy, time-lapse imaging, and molecular analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization for tissue preparation and assay protocols.
- Adaptable to both murine and human lung tissues for broader translational relevance.
- Dependent on precise lung inflation and blood removal for optimal imaging and assay quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Extraction of Mouse Lung
3:34
Precision Cut Lung Slices (PCLS)
5:35
Vasoconstrictor Experiment
6:20
Preparing the Tissue for RNA or Protein Lysis on PCLS
7:26
Results: Ex Vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies of PCLS
8:32
Conclusion
