In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie

Het algemene doel van dit protocol is om belangrijke belangrijke aspecten van de E3-ligasefunctie te analyseren, waaronder E2-enzymspecificiteit, substraatselectie en ubiquitine-overdracht. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de brede toepasbaarheid, omdat eiwitten uit alle eukaryote bronnen recombinant tot expressie kunnen worden gebracht en in vitro kunnen worden bestudeerd zonder dat speciale apparatuur nodig is. Wanneer de lysine-ontladingstechniek voor de eerste keer wordt gebruikt, is het belangrijk om testparameters, zoals enzymconcentraties, te optimaliseren om de ideale ontladingsomstandigheden voor het E3-ligase naar keuze te identificeren.

Om een in vitro auto-ubiquitylatietest uit te voeren, stelt u een pipetterschema op om het functionele vermogen van verschillende E2-enzymen te testen en een mastermix op ijs te bereiden voor alle alomtegenwoordige reacties plus één extra reactie. Voeg vervolgens een micromolair E2-enzymen toe aan de juiste buizen en incubeer de monsters in een PCR-thermische cycler gedurende twee uur onder de aangegeven omstandigheden. Voeg na de incubatie sds-monsterbuffer toe aan elke reactie en meng door meerdere keren te pipetteren.

Kook de monsters vervolgens onmiddellijk vijf minuten op 95 graden Celsius en bewaar de gedenatureerde eiwitten bij 20 graden Celsius. Om een in vitro substraat ubiquitylatietest uit te voeren, bereidt u het pipetteerschema voor alle reacties voor. Nadat u de hoeveelheid mastermix hebt berekend die nodig is voor één reactie, bereidt u de mastermix voor alle reacties op ijs voor en voegt u de mastermix toe aan elke buis.

Voeg de respectievelijke E3-ligases afzonderlijk toe. Incubeer vervolgens de monsters in de PCR thermische cycler gedurende twee uur zoals gedemonstreerd. Voeg aan het einde van de incubatie twee keer de SDS-monsterbuffer toe aan elke reactie, meng meerdere keren door pipetteren en kook de monsters gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.

Om een lysine-ontladingstest uit te voeren, stelt u het pipetteerschema voor de laadreactie in en incubeert u de laadreacties gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Om de oplaadreactie te stoppen, voegt u apyrase toe aan een eindconcentratie van 1,8 eenheden per milliliter en incubeert u de reactie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie EDTA toe aan een eindconcentratie van 30 millimolar en gebruik dubbel gedestilleerd water om het volume van de reactie aan te passen aan 30 microliter.

Om E2-alomtegenwoordigheid door E3 te ontladen, stelt u vijf buizen in die overeenkomen met de tijdspunten voor het experiment, voegt u 6,7 microliter niet-reducerende monsterbuffer toe aan elke buis, verwijdert u zes microliter van de gestopte laadreactie van het tijdspunt nulbuis en past u het totale volume aan op 26,7 microliter. Om de lozingsreacties in te stellen, voegt u dubbel gedestilleerd water, ubiquitylatiebuffer, BSA, lysine, E3-ligase en de geladen E2 toe aan elke reactie. Breng na de geselecteerde tijdsperioden 20 microliter monsters van elke ontladingsreactie over naar de overeenkomstige monsterbuis.

Draai vervolgens onmiddellijk de monsters en plaats ze gedurende 10 minuten op 70 graden Celsius. In deze representatieve Western blot-analyse was de inactieve CHIP niet auto-ubiquitylated. De E3-onafhankelijke ubiquitineproducten werden echter gevormd in de aanwezigheid van inactieve CHIP en in afwezigheid van CHIP.

De wild-type CHIP werd auto-ubiquitylated in combinatie met de eiwitten van de UBE2D- en de UBE2E-families, terwijl de vrije polyubiquitineketens werden geproduceerd in samenwerking met de eiwitten van de UBE2D-familie, maar niet met de eiwitten van de UBE2E-familie. De binding van het ubiquitine door UBE2N/V1 leidde de vorming van vrije ubiquitineketens. De auto-ubiquitylatie en alomtegenwoordigheid van UNC-45B werd waargenomen met wild-type CHIP, maar niet met de inactieve mutant van CHIP, wat aangeeft dat UNC-45B fungeert als een geconserveerd substraat voor CHIP.

Toen de katalytische activiteit van CHIP werd geanalyseerd met behulp van een lysine-ontladingstest, had het ongeladen UBE2D2-enzym een molecuulgewicht van 17 kilodalton en de geladen UBE2D2 met een enkel ubiquitinemolecuul had een molecuulgewicht van ongeveer 26 kilodalton. Op tijdstip 0 werd de volledige geladen E2-opbrengst waargenomen. In aanwezigheid van inactieve CHIP werd een zwakke E3-ligase-onafhankelijke ontlading van UBE2D2 maar niet auto-alomtegenwoordiging van CHIP gedetecteerd.

In aanwezigheid van wild-type CHIP was de ontlading van UBE2D2 snel en binnen 60 minuten voltooid, en de auto-ubiquitylatie van CHIP duidde op een overdracht van ubiquitine op zijn eigen lysineresiduen. Vanwege het beperkte E2-vermogen, werk zo snel mogelijk en ga onmiddellijk verder met de ontladingsreactie gevolgd door SDS-PAGE en Western blotting. Volgens deze in vitro alomtegenwoordigheidsprotocollen kunnen de specifieke ubiquitylatiekoppelingstypen worden geïdentificeerd door de Western blots te onderzoeken met linkage-specifieke antilichamen.