Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Dit protocol beschrijft de monstervoorbereiding en gegevensreductie die nodig zijn voor succesvolle neutronenspinechostudies van collectieve membraanschommelingen die relevant zijn voor biologische functies en praktische toepassingen van lipidemembranen. NSE heeft direct toegang tot membraandynamica op de nanoseconde tijdschalen van belangrijke membraanfuncties met het unieke voordeel van isotoopgevoeligheid voor het onderzoeken van selectieve membraanfuncties die niet toegankelijk zijn met andere technieken. Studies van membraandynamica op nanoschaal zijn essentieel voor het begrijpen van de onderliggende membraaneigenschappen van het moleculaire mechanisme en membraan-eiwitinteracties die betrokken zijn bij verschillende celpathologieën.

De methode biedt onderzoekers die nieuw zijn bij NSE gedetailleerde richtlijnen voor het ontwerpen, voorbereiden en karakteriseren van lipideblaasjes voor succesvolle experimenten en daaropvolgende analyse en interpretatie van gegevensreductie. Teshani Kumarage en Julie Nguyen, een afgestudeerde student en een student van het laboratorium, demonstreren de procedure. Werk in een kap en bereid de lipidensuspensie voor door nauwkeurig gewogen lipiden op te lossen in één milliliter oplosmiddel met handmatig mengen.

Droog de lipideoplossing door voorzichtig een inert gas in de flacon te streamen terwijl u het langzaam onder een hoek draait. Om het resterende oplosmiddel grondig te verwijderen, plaatst u de flacons een nacht in een vacuümoven op 35 graden Celsius. Hydrateer de volgende dag de lipidenfilm met twee milliliter zwaar water om een lipideconcentratie van 50 milligram per milliliter te verkrijgen en vortex de gehydrateerde lipidensuspensie totdat de lipidefilm volledig is opgelost.

Voer vervolgens vijf vries-dooicycli uit door de flacon gehydrateerde lipidensuspensie op minus 80 graden Celsius op te slaan totdat deze bevroren is. En dan overbrengen naar een 35 graden Celsius waterbad om de lipidensuspensie te ontdooien. Draai de ontdooide suspensie tot homogeen voordat u doorgaat naar de volgende cyclus.

Voordat u met het experiment begint, monteert u de extruderopstelling met behulp van een polybicarbonaatmembraan tussen twee membraansteunen en voegt u twee papierfilters aan elke kant toe om extra ondersteuning te bieden. Gebruik luchtdichte glazen spuiten om het polycarbonaatmembraan te hydrateren door meerdere keren 0,3 milliliter zwaar water door de membraanassemblage te laten gaan. Na het hydrateren van het membraan, plaatst u een gasdichte spuit van één milliliter met een bereide melkwitte kleurlipideoplossing in het ene uiteinde en een lege spuit in het andere uiteinde van het extruderapparaat.

Zodra de spuiten zijn aangesloten, plaatst u de montage in het extruderblok. Programmeer de pomp door de rateknop ingedrukt te houden om de extrusiesnelheid in te voeren en druk op de diameterknop om de spuitdiameter in te voeren. Druk vervolgens op Terugtrekken totdat het lampje gaat branden.

Druk op start en wacht tot het monster in de lege spuit begint te doseren. Druk op de stopknop net voordat de monsterspuit volledig leeg is. Neem het afgegeven volume op en houd vervolgens de knop Snelheid ingedrukt totdat fase één op het scherm verschijnt.

Houd het opneemlampje uit, druk op de volumeknop om het eerder opgenomen volume in te voeren. Druk nogmaals op de knop Snelheid en gebruik de rechter pijl-omhoog om toegang te krijgen tot fase twee. Druk op volume om dezelfde waarde in te voeren als het eerder opgenomen afgegeven volume.

Druk in deze fase op de knop Terugtrekken totdat het lampje Terugtrekken is ingeschakeld. Herhaal de cyclus voor fase drie door op de volumeknop te drukken totdat LP:SE op het scherm verschijnt en stel deze in op 20. Druk ten slotte op de rate-knop, toegang tot fase vier en druk op de volumeknop om naar de stopfunctie te gaan om de pompopstelling te voltooien.

Nadat de pomp is geprogrammeerd, drukt u op Start om de extrusiecyclus te starten. Voer 15 tot 20 extrusie cycli voordat u de transparante opaal blauw geëxtrudeerde lipidensuspensie in een schone flacon voor metingen te verzamelen. Open de DAVE-software en selecteer NSE-gegevens verminderen in het menu Gegevensreductie.

Upload de gegevensbestanden over verschillende Q-waarden met behulp van de Open echo-bestanden vanuit het bestandsmenu. De geüploade bestanden worden weergegeven onder de beschikbare gegevenssets. Klik met de rechtermuisknop op het geselecteerde bestand en label het op basis van de meting die overeenkomt met zoals Voorbeeld, Cel of Resolutie.

Groepeer de detectorpixels met behulp van het tabblad Gegevensset in 2 X 2 om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Pas dezelfde binning toe op alle bestanden van Resolutie, Cel en Voorbeeld. Inspecteer de gegevens over alle pixelgroepen en maskeer degenen met slechte signalen door op de eindtoets op het toetsenbord te drukken.

Druk op Enter om toegang te krijgen tot een pop-upvenster om hetzelfde masker op alle vier uw tijden toe te passen. Gemaskeerde pixels worden groen. Zorg ervoor dat de verzamelde gegevens de vorm hebben van een echosignaal.

Begin met het aanpassen van het resolutiebestand in de geüploade bestandslijst door met de rechtermuisknop op het gewenste bestand te klikken en Fit Operations, Fit Echoes Resolution te selecteren in het pop-upmenu. Zorg ervoor dat de pasvormen van de echosignalen redelijke montageparameters opleveren. Als u de fout wilt inspecteren die aan elke montageparameter over de hele detector is gekoppeld, selecteert u Afbeeldingsopties en selecteert u vervolgens de fittingparameter van belang.

Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de detectorafbeelding om toegang te krijgen tot een pop-upvenster met een foutbalkkaart. Als de pasvorm over een specifieke pixel onbevredigend is, past u het signaal opnieuw aan op die pixel door het te selecteren, op het tabblad Passend te drukken en vervolgens op Fit Pixel te drukken. Voer nieuwe startparameters voor de fase en periode in op het tabblad Montage.

Verklein het voorbeeldbestand door het bijbehorende bestand te selecteren in de geüploade en gelabelde bestandslijst. Inspecteer alle pixels en maskeer de slechte zoals hierboven beschreven. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op het bestand en selecteer Bewerkingen aanpassen, Fasen importeren.

Voor het resolutiebestand past u echosignalen zoals eerder beschreven met de waarden van de periode ongewijzigd en echofasepunt geïmporteerd uit de resolutie past. Voer het bundelcentrum voor alle gegevensbestanden in door naar het tabblad Algemeen te gaan en de X- en Y-balkcentrumwaarden in te voeren die uit het experiment zijn opgenomen. Zodra de pasvormen zijn voltooid, berekent u de genormaliseerde tussenliggende verstrooiingsfunctie door rechts op het gewenste voorbeeldbestand uit de lijst met aangesloten bestanden te klikken en Bereken I van Q te selecteren in het pop-upmenu.

Voer de vereiste informatie in voor de resolutie- en celbestanden en het aantal Q-bogen in het pop-upvenster en druk vervolgens op OK om de resultaten weer te geven. Merk op dat de gegevens in cyaan een slecht signaal laten zien als gevolg van detectorrandeffecten en moeten worden geëlimineerd bij het samenstellen van verschillende Q-gegevenssets. Sla ten slotte de gereduceerde gegevenssets op als ASCII-bestanden en sla de hele sessie op als een DAVE-project in de gewenste map.

In deze studie werden de NSE-metingen uitgevoerd van liposomale monsters bereid met verschillende deuteratieschema's. NSE-metingen van membraanbuigschommelingen worden uitgevoerd op volledig contrasterende liposomen. Dit deuteratieschema resulteert in een groot verschil in verstrooiingslengte tussen de membraankern en deuterated vloeistofomgeving, waardoor het verstrooiingssignaal van de liposomale membranen aanzienlijk wordt verbeterd en de meetstatistieken van buigdynamiek worden verbeterd.

Aan de andere kant tonen NSE-metingen van membraandikteschommelingen van liposomen afwijkingen ten opzichte van de Q tot de derde afhankelijkheid van buigschommelingen. Om het diktefluctuatiesignaal te isoleren, wordt het verkregen signaal gedeeld door Q tot het derde en wordt de overtollige dynamiek in Q op een Lorentziaanse functie gemonteerd. De dynamiek die door NSE wordt onderzocht, kan synergetisch worden onderzocht door deuterium NMR-relaxometrie en moleculair-dynamische simulaties om te illustreren hoe moleculaire lipidenstructuren en verpakkingsmotieven membraanfuncties beïnvloeden.

NSE-studies over lipidemembranen werpen nieuw licht op membraanbiofysica, de ingewikkelde relaties van membraanstructuur en dynamiek, en hoe ze membraanfuncties en membraan-eiwitinteracties beïnvloeden.