Name: Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Ontdek neutron spin echo-spectroscopie voor het bestuderen van lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties. Deze methode biedt unieke inzichten in nanoschaalfluctuaties van biologische membranen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

R. Ashkar bedankt M. Nagao, L.-R. Stingaciu, en P. Zolnierczuk voor vele nuttige besprekingen en voor hun frequente hulp met NSE experimenten op hun respectieve beamlines. De auteurs erkennen het gebruik van neutronenspinechospectrometers bij NIST en ORNL. De NSE spectrometer bij NIST wordt ondersteund door het Center for High Resolution Neutron Scattering, een samenwerkingsverband tussen het National Institute of Standards and Technology en de National Science Foundation in het kader van overeenkomst nr. Dmr-1508249. De NSE spectrometer bij ORNL's Spallation Neutron Source wordt ondersteund door de Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, Us Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory wordt beheerd door UT-Battelle, LLC onder US DOE Contract No. DE-AC05-00OR22725.

De auteurs verklaren geen belangenconflicten en hebben niets openbaar te maken.

NSE is een krachtige en unieke techniek in het meten van mesoscopische dynamiek van lipidenmembranen onder verschillende omstandigheden. Het effectieve gebruik van NSE hangt af van de monsterkwaliteit, het neutronencontrast en het bereik van de toegankelijke dynamiek die voor een bepaald monster kan worden onderzocht. Er zijn dus verschillende kritieke stappen nodig voor het uitvoeren van succesvolle NSE-experimenten en het verzamelen van hoogwaardige gegevens. Een belangrijke stap in het waarborgen van het effectieve ge...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
<img alt="Lipid bilayer structures; neutron scattering analysis; molecular arrangement diagram; lipid vesicles." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Lipid bilayer diagrams with charts, nanostructure spheres, and membrane model in research context." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Het begrip van celmembranen en hun functie is de afgelopen decennia opmerkelijk geëvolueerd. De vroegere visie van celmembranen als passieve lipide-bilayers die celgrenzen definiëren en huismembraaneiwitten1 is geleidelijk veranderd in een dynamisch model waarin lipide-tweelagen een belangrijke rol spelen bij het reguleren van vitale biologische processen, waaronder cellulaire signalering, moleculaire uitwisseling en eiwitfunctie - om er maar een paar2,3,4,5,6te noemen . Dit besef dat celmembranen zeer dynamisch zijn en voortdurend een remodellering en moleculaire herverdeling ondergaan, heeft wetenschappelijke verkenningen aangedrongen die verder gaan dan evenwichtsstructuren van membranen7,8,9. Dienovereenkomstig zijn meerdere benaderingen ontwikkeld om de verschillende dynamische modi in biologische en bio-geïnspireerde lipidenmembranen te bestuderen. Tot op heden hebben de meeste van deze studies zich voornamelijk gericht op diffusieve moleculaire bewegingen10,11,12,13 en macroscopische vormschommelingen14,15,16, waardoor een aanzienlijke kloof is achtergelaten in het begrijpen van de intermediaire membraandynamiek, d.w.z. collectieve fluctuaties van lipidenassemblages bestaande uit enkele 10-100s lipidemoleculen. Deze dynamieken komen voor over lengteschalen van enkele tientallen tot enkele 100 Å en in de loop van de tijd schalen van sub-ns tot enkele honderden ns (zie figuur 1), hier aangeduid als mesoscopische schalen. Het is inderdaad op deze schalen dat belangrijke biologische activiteit plaatsvindt op membraanniveau17. Dit omvat virale ontluikende18, kanaal gating19, en membraan-eiwit interacties20. Het is ook belangrijk erop te wijzen dat het energielandschap van membraaneiwitten21,22 aantoont dat conformationele veranderingen in eiwitten — noodzakelijk voor hun regulerende rol — plaatsvinden in de tijdschalen23 van collectieve membraanschommelingen , waarbij het belang van mesoscopische dynamiek in de biologische functie van celmembranen en hun bio-geïnspireerde analogen verder wordt benadrukt20. Dit artikel richt zich op de twee primaire mesoscopische dynamische modi in lipidemembranen, namelijk buigschommelingen en dikteschommelingen.
De grootste uitdaging bij het direct onderzoeken van deze fluctuatiemodi is de moeilijkheid om tegelijkertijd toegang te krijgen tot hun ruimtelijke en temporele schalen met behulp van standaardspectroscopiemethoden. De andere uitdaging is dat directe contacttechnieken dezelfde fluctuaties kunnen beïnvloeden als die welke bedoeld zijn om16te meten . Dit wordt nog verergerd door de compositorische en structurele complexiteit van biologische membranen24,25, wat resulteert in niet-homogene membraankenmerken, waaronder lipidedomeinvorming26,27,28,29,30 en membraanasymmetrie31,32,33- die selectieve sondes vereisen om de dynamiek van verschillende membraankenmerken te begrijpen. Gelukkig kunnen deze uitdagingen worden overwonnen met niet-invasieve neutronenspectroscopiemethoden, zoals neutronenspinecho (NSE), die inherent toegang hebben tot de vereiste lengte- en tijdschalen, en verder studies van selectieve membraankenmerken mogelijk maken zonder hun fysisch-chemische omgeving te veranderen34. Inderdaad, in de afgelopen jaren is NSE spectroscopie geëvolueerd tot een unieke en krachtige sonde van collectieve membraandynamica35. Resultaten van NSE-studies over lipidemembranen hebben nieuwe inzichten opgeleverd in mechanische36,37 en visco-elastische38,39 eigenschappen van lipidemembranen en hebben nieuw licht geworpen op hun potentiële rol in biologische functie40,41.
De NSE-spectroscopietechniek is gebaseerd op een interferometrisch instrumentontwerp, voor het eerst voorgesteld door Mezei42, met behulp van een reeks spin-flippers en magnetische spoelen om de precessie van de neutronenspin te regelen terwijl neutronen het instrument doorkruisen. Het ontwerp berust op magnetische spiegeling van de magnetische veldelementen ten opzichte van de monsterpositie (figuur 1A). Dit houdt in dat bij gebrek aan energie-uitwisseling tussen het neutron en het monster, het neutron hetzelfde aantal spinprecessies uitvoert, in tegengestelde richting, in de eerste en tweede helft van het instrument (let op de π-flipper tussen de twee precessiespoelen). Als gevolg hiervan blijft de uiteindelijke spintoestand van het neutron ongewijzigd ten opzichte van de begintoestand - een fenomeen dat spin-echo wordt genoemd (zie transparant neutron in figuur 1A). Wanneer het neutron echter energetisch interageert met het monster, wijzigt de energie-uitwisseling het aantal spinprecessies in de tweede helft van het instrument, wat leidt tot een andere eindspintoestand (zie figuur 1A). Dit wordt experimenteel gedetecteerd als een verlies in polarisatie, zoals later in dit artikel zal worden getoond. Voor meer informatie over de NSE-techniek wordt de lezer verwezen naar speciale technische documenten42,43,44,45.
Hier wordt een vereenvoudigde beschrijving gepresenteerd om een ruwe schatting te geven van de lengte- en tijdschalen die toegankelijk zijn met NSE. De lengteschalen worden bepaald door het bereik van haalbare wavevectortransfers, Q = 4π sin θ/λ, waarbij 2θ de verstrooiingshoek is en λ de neutronengolflengte. Men kan zien dat Q wordt ingesteld door het golflengtebereik en de mate van rotatie van de tweede arm van de spectrometer (zie figuur 1A). Een typisch Q-bereikop NSE-spectrometers is ~0.02-2 Å-146,47en tot 0.01-4 Å-1 met recente upgrades48,49, overeenkomend met ruimtelijke schalen van ~1-600 Å. Aan de andere kant wordt de toegankelijke tijdschaal berekend op basis van de totale precessiehoek (of fase) die het neutron in de magnetische precessiespoelen heeft verkregen, en blijktdeze 50te zijn : <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq12v5.jpg"> . In deze uitdrukking is t de Fouriertijd gedefinieerd als <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq13v2.jpg"> , waar is de <img alt="Equation 50" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq50v2.jpg"> neutronen gyromagnetische verhouding, <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg"> is de spoellengte, en <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> is de sterkte van het magnetisch veld van de spoel. Het is de moeite waard erop te wijzen dat de Fouriertijd een hoeveelheid is die strikt afhankelijk is van de instrumentgeometrie, de magnetische veldsterkte en de neutronengolflengte. Bijvoorbeeld, met behulp van neutronen van golflengte <img alt="Equation 70" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq70v6.jpg"> = 8 Å en instrumentinstellingen van <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg">   = 1,2 m en <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> = 0,4 T, wordt de Fouriertijd berekend op t ~ 50 ns. Experimenteel wordt de Fouriertijd afgestemd door de stroom in de precessiespoelen (d.w.z. magnetische veldsterkte) te veranderen of verschillende neutronengolflengten te gebruiken, wat resulteert in typische NSE-tijdschalen van ~ 1 ps tot 100 ns. Recente upgrades in NSE-spectrometers hebben echter toegang gegeven tot langere Fourier-tijden, tot ~ 400 ns op de J-NSE-Phoenix spectrometer op de Heinz Maier-Leibnitz Zentrum51 en de SNS-NSE spectrometer in Oak Ridge National Lab48, en tot ~ 1.000 ns op de IN15 NSE spectrometer in het Institut Laue-Langevin (ILL). 
Naast directe toegang tot de lengte- en tijdschaal van membraandynamica heeft NSE de inherente mogelijkheden van neutronenisotopengevoeligheid52. Met name het vermogen van neutronen om verschillend te interageren met de isotopen van waterstof, het meest voorkomende element in biologische systemen, resulteert in een andere neutronenverstrooiingslengtedichtheid,34 of NSLD (het equivalent van de optische brekingsindex50), wanneer protium wordt vervangen door deuterium. Dit maakt een benadering mogelijk die bekend staat als contrastvariatie, die vaak wordt gebruikt om specifieke membraankenmerken te benadrukken of anderen te verbergen - het laatste scenario wordt contrastmatching genoemd. Een frequente toepassing van contrastvariatie/matching is de vervanging van water (NSLD = -0,56 × 10-6 Å-2) door zwaar water of D2O (NSLD = 6,4 × 10-6 Å-2) om het neutronensignaal van geprotieerde lipidemembranen (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2)te versterken. Deze aanpak is zeer effectief in studies van membraanstructuur omdat de penetratie van D2O in het hoofdgroepgebied van het membraan een nauwkeurige bepaling van de membraandikten mogelijk maakt (zie figuur 2A, linkerpaneel) en van de locatie van verschillende lipidesubgroepen wanneer meer geavanceerde modellen worden toegepast53,54. Dit artikel belicht enkele voorbeelden over het gebruik van contrastvariatie voor studies naar collectieve dynamiek in biomimetische membranen en bepaalde membraankenmerken.
Hier wordt de effectiviteit van NSE bij het bieden van unieke inzichten in dynamische en functionele membraaneigenschappen geïllustreerd aan de hand van tastbare voorbeelden van NSE-studies naar model- en biologisch relevante lipidenmembraansystemen met de nadruk op mesoschaaldynamiek in vrijstaande membranen, in de vorm van liposomale suspensuspensuspensussen. Voor NSE-metingen van membraandynamica in het vlak wordt de lezer verwezen naar speciale publicaties over beweidingsincidentie neutronenspin-echospectroscopie (GINSES)55,56 en andere studies van uitgelijnde multilamellar membraanstapels57,58,59,60.
Voor de eenvoud belicht dit artikel drie verschillende schema's van membraandeuteratie geïllustreerd op een goed bestudeerd domeinvormend, of fasescheidend, lipidenbilayer-systeem van 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) mengsels61,62. De twee lipiden worden gekenmerkt door een mismatch in hun koolwaterstofketenlengte (14 carbons/tail in DMPC vs 18 carbons/tail in DSPC) en hun gel-fluid overgangstemperatuur (Tm, DMPC = 23 °C vs Tm, DSPC = 55 °C). Dit resulteert in laterale fasescheiding in DMPC:DSPC-membranen bij temperaturen tussen de bovenste en onderste overgangstemperaturen van het mengsel63. De hier overwogen deuteratieschema's zijn gekozen om de verschillende dynamische modi aan te tonen die toegankelijk zijn in NSE-metingen op liposomale membranen, namelijk buigschommelingen, dikteschommelingen en selectieve buig-/dikteschommelingen van laterale domeinen. Alle lipidesamenstellingen worden gerapporteerd voor DMPC:DSPC-bilayers bereid met een molfractie van 70:30, met behulp van in de handel verkrijgbare protiated en perdeuterated varianten van DMPC en DSPC. Alle monstervoorbereidingsstappen zijn gebaseerd op 4 ml liposomale suspensie, in D2O, met een lipideconcentratie van 50 mg/ml, voor een totale lipidenmassa van Mtot = 200 mg per monster.

<table><tbody><tr><td>Chloroform (biotech grade)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>496189</td><td>Biotech. grade, &ge;99.8%, bevat 0,5-1,0% ethanol als stabilisator</td></tr><tr><td>Circulating water bath</td><td>Julabo</td><td>SE-12</td><td>Verwarmingscirculator met slimme pomp, programmeerbare temperatuurinstellingen en externe sensoraansluiting voor meting en controle</td></tr><tr><td>Deuterium Oxide</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>DLM-4</td><td>Gedeutereerd water; Zwaar water (D2O) (D, 99,9%)</td></tr><tr><td>Digital Semi-Microbalance</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS105</td><td>Semi-micro weegschaal met 120 g capaciteit, 0,01 mg afleesbaarheid, hoogwaardige weegcel, ergonomische deuren en pipetten-check applicatie</td></tr><tr><td>Ethanol (molecular biology grade)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof ethanol voor moleculaire biologie toepassingen</td></tr><tr><td>Glass Pipets</td><td>VWR</td><td>36360-536</td><td>Weggeefbare Soda Lime glas Pasteur pipetten</td></tr><tr><td>Glass Vials</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7990-1</td><td>Borosilicaat glazen vials met PTFE/Silicone septumdoppen</td></tr><tr><td>Lab grade freezer</td><td>Fisher Scientific</td><td>IU2886D</td><td>Ultra-lage temperatuur vriezer (-86 tot -50 C) voor langdurige opslag van lipiden en eiwitten</td></tr><tr><td>Lipids (protaited or perdeuterated)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>varieerd per lipide</td><td>Lipiden kunnen worden gekocht bij Avanti in poedervorm of in een chloroformoplossing met de vereiste hoeveelheden en deutereringschema's.</td></tr><tr><td>Millipore water purifier</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZRQSVP3US</td><td>Direct-Q&reg;&nbsp;3 UV Waterzuiveringssysteem dat zowel zuiver als ultrazuiver water levert met een ingebouwde UV-lamp om de niveaus van organische stoffen voor biologische&nbsp; toepassingen te verminderen</td></tr><tr><td>Mini Extruder Set</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td>Mini-extruder set bevat mini-extruder, verwarmingsblok, 2 GasTight Spuiten, en 2 O-ringen, Polycarbonaat Membranen en Filter Ondersteuningen</td></tr><tr><td>Quick Connect Fittings</td><td>Grainger</td><td>2YDA1 en 2YDA7</td><td>Push-button buisfittingen voor QuickConnect watercirculatietoepassingen, b.v. hoogtemperatuur blaasjes extrusie</td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>SyringePump.com</td><td>New Era-1000</td><td>Volledig programmeerbare spuitpomp voor infusie en terugtrekking; programmeert tot 41 pompfasen met instelbare pompsnelheden, gedoseerde volumes en extrusiecycli</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPX2800</td><td>Temperatuurgestuurde ultrasoon bad met programmeerbare functionaliteit voor ontgassing en ultrasoon toepassingen</td></tr><tr><td>Vacuum Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>3608</td><td>0,7 cu ft vacuümoven met ingebouwde hoog-limiet thermostaat beschermt tegen oververhitting</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td>Variabele snelheid, analoge bediening die lage rpm start-up toelaat voor zacht schudden of hogesnelheidsmixen voor krachtig vortexen van monsters</td></tr></tbody></table>

neutron spin echo spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Lipide bilayers vormen de belangrijkste matrix van celmembranen en zijn het primaire platform voor nutriëntenuitwisseling, eiwit-membraan interacties, en virale ontluikende, onder andere vitale cellulaire processen. Voor een efficiënte biologische activiteit moeten celmembranen stijf genoeg zijn om de integriteit van de cel en zijn compartimenten te behouden, maar toch vloeibaar genoeg om membraancomponenten, zoals eiwitten en functionele domeinen, te laten diffuus en interactief te zijn. Deze delicate balans van elastische en vloeibare membraaneigenschappen, en hun impact op de biologische functie, vereist een beter begrip van de collectieve membraandynamiek over mesoscopische lengte- en tijdschalen van belangrijke biologische processen, zoals membraanvervormingen en eiwitbindende gebeurtenissen. Een van de technieken die dit dynamisch bereik effectief kan onderzoeken, is neutronenspinecho (NSE) spectroscopie. In combinatie met deuteriumetikettering kan NSE worden gebruikt om direct toegang te krijgen tot buig- en dikteschommelingen, evenals mesoscopische dynamiek van bepaalde membraankenmerken. Dit document geeft een korte beschrijving van de NSE-techniek en schetst de procedures voor het uitvoeren van NSE-experimenten op liposomale membranen, inclusief details van monstervoorbereidings- en deuteratieschema's, samen met instructies voor het verzamelen en verminderen van gegevens. Het artikel introduceert ook gegevensanalysemethoden die worden gebruikt om belangrijke membraanparameters te extraheren, zoals de buigstijfheidsmodulus, gebiedsdrukmodulus en viscositeit in het vlak. Om het biologische belang van NSE-studies te illustreren, worden enkele voorbeelden van membraanverschijnselen besproken die door NSE zijn onderzocht, namelijk het effect van additieven op de stijfheid van membraanbuiging, de impact van domeinvorming op membraanschommelingen en de dynamische signatuur van membraan-eiwitinteracties.

NSE-studies die toegang krijgen tot buigschommelingen worden meestal uitgevoerd over een Q-bereik van ~ (0,04 - 0,2) Å-1. Dit Q-bereik komt overeen met tussenliggende lengteschalen tussen de membraandikte en de liposomale radius, waar buigdynamiek domineert. Meting over een uitgebreid Q-bereik kan toegang geven tot extra dynamische modi, waaronder liposomale diffusie en intramembrane dynamica. Voor meer informatie over de cross-over in membraandynamiek die NSE heeft geraadpleegd , raadpleegt u deze relevante p...

Dit artikel beschrijft de protocollen voor monstervoorbereiding, gegevensreductie en gegevensanalyse in neutronenspinecho (NSE) studies van lipidemembranen. Verstandige deuteriumetikettering van lipiden maakt toegang tot verschillende membraandynamiek op mesoscopische lengte- en tijdschalen mogelijk, waarover vitale biologische processen plaatsvinden.

Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

Dit protocol beschrijft de monstervoorbereiding en gegevensreductie die nodig zijn voor succesvolle neutronenspinechostudies van collectieve membraanschommelingen die relevant zijn voor biologische functies en praktische toepassingen van lipidemembranen. NSE heeft direct toegang tot membraandynamica op de nanoseconde tijdschalen van belangrijke membraanfuncties met het unieke voordeel van isotoopgevoeligheid voor het onderzoeken van selectieve membraanfuncties die niet toegankelijk zijn met andere technieken. Studies van membraandynamica op nanoschaal zijn essentieel voor het begrijpen van de onderliggende membraaneigenschappen van het moleculaire mechanisme en membraan-eiwitinteracties die betrokken zijn bij verschillende celpathologieën.De methode biedt onderzoekers die nieuw zijn bij NSE gedetailleerde richtlijnen voor het ontwerpen, voorbereiden en karakteriseren van lipideblaasjes voor succesvolle experimenten en daaropvolgende analyse en interpretatie van gegevensreductie. Teshani Kumarage en Julie Nguyen, een afgestudeerde student en een student van het laboratorium, demonstreren de procedure. Werk in een kap en bereid de lipidensuspensie voor door nauwkeurig gewogen lipiden

neutron-spin-echo-spectroscopy-as-unique-probe-for-lipid-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft methoden voor door de gebruiker bepaalde spinlabeling en reconstituur van pentamere ligand-gebonden kanalen voor studies met Elektronen Paramagnetische Resonantie. Dit protocol kan worden aangepast voor elk membraaneiwit. De hier beschreven reconstituurmethode kan ook worden gebruikt voor patch-clamp metingen van macroscopische en enkele-kanaalstromen in een gedefinieerd lipidensysteem.

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Dit protocol laat zien hoe een model met een lage resolutie ab initio en structurele details van een wasmiddel-ontbindend membraan eiwit in small-angle neutron scattering met contrast-matching van het detergent oplossing te verkrijgen.

Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van het moleculaire mechanisme van proton translocatie in verschillende lipide membranen van één liposomen, met behulp van cytochroom bo3  als voorbeeld. Het combineren van de elektrochemie en fluorescentie microscopie, pH-veranderingen in het lumen van enkele blaasjes, bevattende één of meerdere enzym, kan worden gedetecteerd en individueel geanalyseerd.

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van de structuur en dynamiek van twee modeleiwitten die een belangrijke rol spelen in de menselijke gezondheid. De techniek combineert bench-top biofysische karakterisering met neutronenspinechospectroscopie om toegang te krijgen tot de dynamiek op tijd- en lengteschalen die relevant zijn voor eiwitinterdomeinbewegingen.

Studie van eiwitdynamica via neutronenspinechospectroscopie

Dit protocol presenteert het gebruik van een gestopte stroommonsteromgeving om snel meerdere vloeibare oplossingen in situ te mengen tijdens een neutronenverstrooiingsmeting met een kleine hoek en om kinetische processen te bestuderen op nanometerlengteschalen en tweede tijdschalen.

Het meten van de tijdsevolutie van materialen op nanoschaal met stop-flow en small-angle neutronenverstrooiing

Dit protocol beschrijft een iSCAT-gebaseerde beeldverwerking en single-particle tracking-benadering die het gelijktijdige onderzoek van de moleculaire massa en het diffusieve gedrag van macromoleculen die interageren met lipidemembranen mogelijk maakt. Stapsgewijze instructies voor monstervoorbereiding, massa-naar-contrastconversie, filmacquisitie en nabewerking worden gegeven naast aanwijzingen om mogelijke valkuilen te voorkomen.

Massagevoelige deeltjestracking om membraangeassocieerde macromolecuuldynamica te karakteriseren

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Er wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om gramicidine A-gedoopeerde druppelinterface-dubbellagen samen te stellen, elektrisch te stimuleren en te analyseren. Relaties tussen lipide-eiwitstructuur en -functie worden gekwantificeerd door veranderingen in membraanoppervlakte, ionische flux en enkelkanaalgeleidbaarheid te meten, en deze responsen te relateren aan plasticiteitsachtige veranderingen in ionische geleiding in een membraanmodel geïnspireerd door elektrische synapsen.

Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

Ontdek neutron spin echo-spectroscopie voor het bestuderen van lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties. Deze methode biedt unieke inzichten in nanoschaalfluctuaties van biologische membranen.

Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Meer video's verkennen