Name: Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Leer snelle antimicrobiële gevoeligheidstests met gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van deuteriumincorporatie in individuele bacteriën. Deze methode levert resultaten binnen 2,5 uur uit urine en bloed.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH R01AI141439 naar J.-X.C en M.S, en R35GM136223 naar J.-X.C.

Het gebruik van menselijke bloedmonsters is in overeenstemming met de richtlijnen van de IRB van Boston University en de National Institutes of Health (NIH). Concreet zijn de exemplaren afkomstig van een bank en zijn ze volledig gedeïdentificeerd. Deze exemplaren worden niet beschouwd als menselijke proefpersonen door het bureau van de Institutional Review Board (IRB) aan de Universiteit van Boston.
1. Bereiding van de voorraadoplossing voor bacteriën en antibiotica
<ol><li>Bereid de antibiotica (gentamicinesulfaat of amoxicilline) stamoplossing in een concentratie van 1 mg / ml opgelost in steriel1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of dimethylsulfoxide (DMSO) oplosmiddel in microbuizen van 1,5 ml. Los gentamicinesulfaat op in steriele PBS-oplossing en amoxicilline in steriel DMSO-oplosmiddel. Bewaar daarna de antibiotica-oplossing bij 2-8 °C zoals voorgesteld.</li>
	<li>Om D2O met kation-aangepaste Mueller-Hinton Broth (MHB) media te maken, voegt u 220 mg MHB-bouillonbasis toe aan 10 ml D2O om 100% D2O-bevattend medium te maken. Steriliseer de oplossing door te filteren met filters van 200 nm poriegrootte. OPMERKING: Gebruik dit protocol altijd voor het maken en steriliseren van mediumoplossingen in verdere stappen.</li>
	<li>Om bacteriële monsters voor te bereiden op SRS-beeldvorming, voegt u 2 ml normale MHB-media, die geen deuterium bevatten, toe aan een steriele kweekbuis met ronde bodem en vervolgens prewarmen bij 37 °C.</li>
	<li>Gebruik een steriele lus om één bacteriële (Escherichia coli BW 25113 of Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) kolonie uit de verse cultuur te selecteren op een tryptische soja-agarplaat. Hang het vervolgens op in de voorgewarmde kweekmedia en vortex voorzichtig om de bacteriesuspensie voor te bereiden.</li>
	<li>Incubeer bacteriën bij 37 °C in een shaker met 200 omwentelingen per minuut (rpm) totdat deze de logaritmische fase bereikt.</li>
</ol>2. D2O-opnamebehandeling in aanwezigheid van antibiotica (figuur 2a)
<ol><li>Controleer de bacteriële concentratie door de optische dichtheid (OD) te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nm.</li>
	<li>Verdun de bacteriële oplossing met behulp van het normale MHB-medium, dat geen deuterium bevat, om een uiteindelijke celconcentratie van 8 x 105 CFU / ml te bereiken. Vortex voorzichtig om de bacteriële cellen te mengen.</li>
	<li>Bereid 300 μL aliquots van de bacteriële oplossing in zeven microbuizen van 1,5 ml en 600 μL aliquots van de bacteriële oplossing in één microbuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 4,8 μL antibioticum (gentamicine of amoxicilline) stamoplossing (1 mg/ml) toe aan de microbuis met 600 μL van de bacteriële oplossing, om de uiteindelijke antibioticaconcentratie op 8 μg/ml te brengen.</li>
	<li>Neem 300 μL oplossing uit de 8 μg/ml antibioticabevattende bacterieoplossing en voeg toe aan nog eens 300 μL bacteriële oplossing om een tweevoudige verdunde antibioticum- (4 μg/ml) bevattende bacterieoplossing te maken.</li>
	<li>Herhaal de tweevoudige seriële verdunning van de testantibiotica, gentamicine of amoxicilline, totdat de microbuis met de laagste concentratie (0,25 μg/ml) is bereikt en gooi 300 μL uit de buis. Voor zowel gentamicine als amoxicilline variëren de seriële concentraties van 0,25 μg/ml tot 8 μg/ml.<ol><li>Laat één buis zonder antibiotica voor blanco controle. Dit zal de positieve controle zijn om de bacteriële metabole activiteit te inspecteren zonder antibioticabehandeling maar met D2O-behandeling.</li>
		<li>Laat één buis zonder antibiotica en geen D2O voor de negatieve controle.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubeer het bacteriële aliquot met het bepaalde antibioticum (gentamicine of amoxicilline) dat MHB-medium bevat gedurende 1 uur.</li>
	<li>Bereid tijdens de incubatie een seriële verdunning van antibiotica met 100% D2O bevattend medium met dezelfde concentratiegradiënt van antibiotica bereid in stap 2.6. Voor zowel gentamicine als amoxicilline variëren de seriële concentraties van 0,25 μg/ml tot 8 μg/ml.</li>
	<li>Voeg na 1 uur antibioticabehandeling respectievelijk 700 μL serieel verdund antibioticum en 100% D2O-bevattend MHB-medium toe aan de 300 μL antibiotica-voorbehandelde bacteriën in dezelfde antibioticaconcentratie (bereid in stap 2.6).<ol><li>Voeg bijvoorbeeld 700 μL 100% D2O-bevattend MHB-medium (met 8 μg/ml antibioticum) toe aan de 300 μL van 8 μg/ml antibiotica-voorbehandelde bacteriën. Breng op dezelfde manier over naar de overeenkomstige buizen van de volgende concentratie en homogeniseer door meerdere keren op en neer te pipetteren.</li>
		<li>Voeg 700 μL antibioticavrij 100% D2O-bevattend MHB-medium toe aan 300 μL antibioticavrije bacteriën (bereid in stap 2.6.1) als blanco controle.</li>
		<li>Incubeer bij 37 °C in een incubatieschudder bij 200 tpm gedurende nog eens 30 minuten. OPMERKING: In deze stap is de uiteindelijke concentratie van D2O in het medium voor de test 70%.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugeer eerst het 1 ml antibioticum en het met D2O behandelde bacteriële monster bij 6200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en was vervolgens tweemaal met gezuiverd water. Ten slotte, bevestig monsters in 10% formaline-oplossing en bewaar ze bij 4 °C.</li>
</ol>3. Bereiding van bacteriën in urineomgeving (figuur 2b)
<ol><li>Om E. coli BW 25113 in de logaritmische fase te bereiden, volgt u de stappen in 1.4 en 1.5.</li>
	<li>Controleer de bacteriële concentratie door de OD te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nm.</li>
	<li>Om de klinische UTI-monsters 14,18,41 na te bootsen, piekt u de E. coli-oplossing in 10 ml gedeïdentificeerde urine om een uiteindelijke celconcentratie van 10 6 CFU / ml te bereiken.</li>
	<li>Filter de E. coli-geprikte urine met behulp van een filter van 5 μm en verdeel vervolgens de bacteriële oplossing in 300 μL-aliquots in zeven microbuizen van 1,5 ml en 600 μL-aliquots van de bacteriële oplossing in één microbuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voer de D2O-opnamebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica en monsterverzameling zoals beschreven in de vorige stappen van 2.4 tot 2.10.</li>
</ol>4. Bereiding van bacteriën in het bloedmilieu (figuur 2c)
<ol><li>Om Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 in de logaritmische fase te bereiden, volgt u de stappen in 1.4 en 1.5.</li>
	<li>Om de klinische bloedbaaninfecties monsters42,43 na te bootsen, spike P. aeruginosa in 1 ml gedeïdentificeerd menselijk bloed om een concentratie van 107 CFU / ml te bereiken.</li>
	<li>Voeg 9 ml steriel gezuiverd water toe om het bloed te lyseren.</li>
	<li>Filtreer het P. aeruginosa spiked bloed met behulp van een 5 μm filter. Oogst vervolgens bacteriën tot 1 ml volume door centrifugeren bij 6200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.  Voeg 9 ml voorverwarmde normale MHB toe aan de bacterie-oplossing en vortex voorzichtig. De uiteindelijke concentratie van bacteriën is 106 CFU / ml</li>
	<li>Verdeel de P. aeruginosa spiked bloedoplossing in 300 μL aliquots in zeven 1,5 ml microbuizen en 600 μL aliquots van de bacteriële oplossing in één 1,5 ml microbuisjes.</li>
	<li>Voer de D2O-opnamebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica en monsterverzameling zoals beschreven in de vorige stappen van 2.4 tot 2.10.</li>
</ol>5. SRS-beeldvorming van D2O metabole opname in een enkele bacterie
<ol><li>Was 1 ml vaste bacterieoplossing met gezuiverd water en centrifugeer vervolgens op 6200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant. Verrijk de bacteriële oplossing tot ongeveer 20 μL.</li>
	<li>Deponeer de bacteriële oplossing op een poly-L-lysine gecoat coverglass. Sandwich en verzegel het monster voor SRS-beeldvorming.</li>
	<li>Beeld bacteriën op de C-D trillingsfrequentie bij 2168 cm-1 met behulp van een SRS microscoop.<ol><li>Voer de golflengte van de pomp in en stem deze af op 852 nm met behulp van de besturingssoftware op een computer.</li>
		<li>Meet het laservermogen met behulp van een vermogensmeter. Stel het vermogen van de pomplaser op het monster in op ~ 8 mW en het vermogen van de Stokes-laser op het monster op ~ 40 mW door de halfgolfplaat voor de laseruitgang aan te passen. OPMERKING: In de SRS-microscoop levert een instelbare femtosecondelaser met een herhalingsfrequentie van 80 MHz de pomp (680 tot 1300 nm) en Stokes (1045 nm) excitatielasers.</li>
	</ol></li>
	<li>Door de schroeven van de reflectiespiegels af te stellen, de pomp- en Stokes-stralen ruimtelijk uit te lijnen en de twee stralen in een rechtopstaande microscoop te leiden die is uitgerust met een 2D galvo-spiegelsysteem voor laserscanning.<ol><li>Gebruik een 60x water onderdompeling objectief om de pomp en Stokes lasers op het monster te richten.</li>
		<li>Gebruik een oliecondensor om de signalen van het monster in voorwaartse richting te verzamelen.</li>
		<li>Gebruik een bandpass-filter om de Stokes-laser eruit te filteren voordat u deze in een fotodiode richt.</li>
		<li>Extraheer het gestimuleerde Raman-signaal door een lock-in versterker en detecteer de signalen door de fotodiode.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel elke SRS-afbeelding in op 200 x 200 pixels en de pixel dwell-tijd op 30 μs in het bedieningspaneel van de software. De totale acquisitietijd voor één afbeelding is ~1,2 s. Stel de stapgrootte in op 150 nm, zodat de afbeeldingsgrootte ongeveer 30 x 30 μm2 is. Afbeelding van ten minste drie weergaven voor elk voorbeeld.</li>
</ol>6. Beeldverwerking en data-analyse ( Figuur 3)
<ol><li>Om de gemiddelde C-D signaalintensiteit te verkrijgen, opent en verwerkt u SRS-beelden met ImageJ-software.</li>
	<li>Converteer eerst SRS-afbeeldingen naar 8-bits typeafbeeldingen met omgekeerde kleuren door op Afbeelding | Type | 8-bits en vervolgens | bewerken Knoppen omkeren in de ImageJ-software.</li>
	<li>Filter vervolgens de afbeeldingen met Gaussiaanse vervaging door te klikken op Proces | Filters | Gaussische vervaging knoppen en stel de Sigma (Radius) in op 1.</li>
	<li>Gebruik de aanpassing van de afbeeldingsdrempel om het bacteriële gebied te selecteren. Klik op Afbeelding | | aanpassen Drempelwaarde om ervoor te zorgen dat de geselecteerde bacteriegrootten overeenkomen met die in de oorspronkelijke SRS-afbeeldingen. Elimineer kleine deeltjes door de groottedrempel aan te passen om de deeltjes te bepalen. Klik op Toepassen.</li>
	<li>Analyseer | toepassen Deeltjesanalyseknoppen om het gebied van bacteriën te labelen en te bepalen.</li>
	<li>Door op de knop Alles weergeven in de ROI-manager naar de oorspronkelijke onbewerkte SRS-afbeelding te klikken, labelt u hetzelfde bacteriegebied en bepaalt u de gemiddelde intensiteit van elk gegevenspunt door op de knop Meten in de ROI-manager te klikken.</li>
	<li>Omcirkel het achtergrondgebied in de oorspronkelijke SRS-afbeelding en meet de gemiddelde intensiteit van de achtergrond. De gemiddelde C-D-intensiteiten van elke bacterie worden verkregen door de intensiteit van het achtergrondsignaal af te trekken.</li>
</ol>7. Kwantificering van antimicrobiële gevoeligheid via SC-MIC
OPMERKING: De afkapwaarde op 0,60 om de SC-MIC te bepalen, wordt vastgesteld volgens de statistische analyse van de SRS C-D-intensiteiten van de metabolisme-actieve en metabolisme-geremde omstandigheden voor bacteriën bij verschillende concentraties van blootstelling aan geneesmiddelen40. De C-D-intensiteiten voor de antibioticagevoelige en antibioticaresistente groepen werden voorzien van een normale verdeling.
<ol><li>Zet de ROC-curve (Receiver Operating Characteristic) uit en evalueer de afkapdrempel op 0,60. Op basis van deze afkapwaarde kan de SC-MIC als indicator van de werkzaamheid van antibiotica worden gedefinieerd om de metabolisch inactieve en metabolisch actieve groep te bepalen.</li>
	<li>Om de SRS-beeldvormingsgegevens kwantitatief te analyseren, plott u de histogrammen van C-D-signaalintensiteiten voor elke bacteriegroep die wordt behandeld met de serieel verdunde antibioticaconcentratie. De gekleurde datapunten staan voor verschillende individuele bacteriën.</li>
	<li>Normaliseer de C-D-intensiteiten van de met antibiotica behandelde groep tot de gemiddelde intensiteit van de controlegroep zonder antibioticabehandeling. Bepaal de SC-MIC-resultaten van verschillende bacterie- en antibioticacombinaties door de SRS-signaalintensiteiten in het C-D-gebied versus verschillende concentraties antibiotica te kwantificeren met behulp van de afkapwaarde op 0,60.</li>
	<li>Valideer en vergelijk de SC-MIC-uitlezing met de MIC die is bepaald met behulp van conventionele bouillonmicroverdunningstest.</li>
	<li>Volgens het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) wordt de gevoeligheidscategorie op basis van de SRS metabole beeldvormingsresultaten voor elke geteste bacteriestam geïnterpreteerd als "vatbaar", "resistent" of "intermediair".</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Snelle ASAT kan worden verkregen door de respons van bacteriële metabole activiteit op antibioticabehandeling te beoordelen met behulp van eencellige SRS metabole beeldvorming binnen 2,5 uur van het monster tot SC-MIC-resultaten. De respons van bacteriële metabole activiteit en antimicrobiële gevoeligheid kan worden gedetecteerd door de metabole opname van D2O voor biomolecuulsynthese te monitoren met behulp van SRS-beeldvorming van C-D-bindingen. Omdat water alomtegenwoordig wordt gebruikt in levende cellen, ...

Antimicrobiële resistentie (AMR) is een groeiende wereldwijde bedreiging voor de effectieve behandeling van infectieziekten1. Er wordt voorspeld dat AMR tegen 2050 nog eens 10 miljoen doden per jaar en $ 100 biljoen wereldwijd bbp-verlies zal veroorzaken als er geen actie wordt ondernomen voor de bestrijding van antibioticaresistente bacteriën 1,2. Dit benadrukt de dringende behoefte aan snelle en innovatieve diagnostische methoden voor antibioticagevoeligheidstests (ASAT) van infectieuze bacteriën om de opkomst van antibioticaresistente bacteriën te vertragen en het gerelateerde sterftecijfer te verminderen3. Om het best mogelijke klinische resultaat te garanderen, is het cruciaal om binnen 24 uur effectieve therapie te introduceren. De huidige gouden standaardmethode, zoals schijfdiffusie of bouillonverdunningsmethode, vereist echter meestal ten minste 24 uur voor de pre-cubatieprocedure voor klinische monsters en een extra 16-24 uur om de resultaten van de minimale remmende concentratie (MIC) te verkrijgen. Over het algemeen zijn deze methoden te tijdrovend om een onmiddellijke beslissing voor infectieziektebehandeling in de kliniek te begeleiden, wat leidt tot het ontstaan en de verspreiding van antimicrobiële resistentie4.
Genotypische AST-methoden, zoals polymerasekettingreactie (PCR)-gebaseerde technieken5, zijn ontwikkeld voor snelle detectie. Dergelijke technieken meten de specifieke resistentie genetische sequenties om snelle AST-resultaten te verkrijgen. Ze zijn niet afhankelijk van tijdrovende celkweek; alleen specifieke bekende genetische sequenties met resistentie worden echter getest. Daarom is de toepassing ervan beperkt tot verschillende bacteriesoorten of verschillende resistentiemechanismen. Ook kunnen ze geen MIC-resultaten leveren voor therapiebeslissingen 6,7. Bovendien zijn er nieuwe fenotypische methoden voor snelle ASAT in ontwikkeling om deze beperkingen te overwinnen8, waaronder microfluïdische apparaten 9,10,11,12,13, optische apparaten 14,15,16, fenotypische AST die de nucleïnezuren kwantificeert kopie nummer 17,18, en Raman spectroscopische methoden19, 20,21,22,23,24. Deze methoden verkorten de tijd om AST-resultaten te begeleiden, maar de meeste zijn alleen van toepassing op bacteriële isolaten, niet rechtstreeks op klinische monsters, en vereisen nog steeds langdurige pre-incubatie.
In dit werk presenteren we een methode voor snelle bepaling van de gevoeligheid van bacteriën in de urine en volbloed via monitoring van de cellulaire metabole activiteit door SRS-beeldvorming. Water (H2O) neemt deel aan de overgrote meerderheid van essentiële biomoleculaire syntheseprocessen in levende cellen. Als een isotopoloog van water, door middel van een enzymgekatalyseerde H/D-uitwisselingsreactie tussen het redox-actieve waterstofatoom in NADPH en het D-atoom in D2O, kan deuterium worden opgenomen in biomassa in een cel25,26. Een gedeutereerde vetzuursynthesereactie wordt gemedieerd door het deuterium gelabelde NADPH. De D2O-opname in reacties van aminozuren (AA's) resulteert in de gedeutereerde eiwitproductie26 (figuur 1). Op deze manier kunnen de nieuw gesynthetiseerde C-D-bindingsbevattende biomoleculen in enkele microbiële cellen worden gebruikt als een algemene metabole activiteitsmarker die moet worden gedetecteerd. Om de novo gesynthetiseerde C-D-bindingen uit te lezen, wordt Raman-spectroscopie, een veelzijdig analytisch hulpmiddel dat specifieke en kwantitatieve chemische informatie over biomoleculen biedt, veel gebruikt om antimicrobiële gevoeligheid te bepalen en de testtijd aanzienlijk te verkorten tot een paar uur 27,28,29,30 . Vanwege de inherente lage efficiëntie van het Raman-verstrooiingsproces is de spontane Raman-spectroscopie echter van lage detectiegevoeligheid. Daarom is het een uitdaging om real-time beeldresultaten te verkrijgen met behulp van spontane Raman-spectroscopie. Coherente Raman-verstrooiing (CRS), inclusief coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS), heeft een hoge detectiegevoeligheid bereikt vanwege het coherente lichtveld om ordes van grootte te genereren die groter zijn dan die van spontane Raman-spectroscopie, waardoor snelle, specifieke en kwantitatieve chemische beeldvorming op het niveau van één cel 31,32,33,34,35 wordt weergegeven ,36,37,38,39.
Hier, op basis van ons meest recente werk40, presenteren we een protocol voor snelle bepaling van de metabole activiteit en antimicrobiële gevoeligheid door femtoseconde SRS C-D beeldvorming van D2O opname van bacteriën in het normale medium, urine en volbloedomgeving op het niveau van één cel. Femtoseconde SRS-beeldvorming vergemakkelijkt het monitoren van de single cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) tegen antibiotica op het niveau van de enkele bacterie binnen 2,5 uur. De SC-MIC-resultaten worden gevalideerd door standaard MIC-test via bouillonmicroverdunning. Onze methode is toepasbaar voor het bepalen van antimicrobiële gevoeligheid van bacteriën urineweginfectie (UTI) en bloedbaaninfectie (BSI) pathogenen met een veel kortere testtijd in vergelijking met de conventionele methode, die de mogelijkheid opent voor snelle fenotypische AST in de kliniek op het niveau van één cel.

<table><tbody><tr><td>Acousto-optic modulation</td><td>Gooch&amp;Housego</td><td>R15180-1.06-LTD</td><td>Modulating stokes laser beam</td></tr><tr><td>Amoxicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8523-5G</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter</td><td>Chroma</td><td>HQ825/150m</td><td>Block the stokes laser beam before the photodiode</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Cation adjustment</td></tr><tr><td>Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>B12322</td><td>Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002542</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses</td><td>VWR</td><td>16004-318</td><td></td></tr><tr><td>Culture tube with snap cap</td><td>Fisher brand</td><td>149569B</td><td></td></tr><tr><td>Daptomycin</td><td>Acros</td><td>A0386346</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td></td><td>151882</td><td>Organic solvent to dissolve antibiotics</td></tr><tr><td>Deuterium oxide-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156914</td><td>Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system</td></tr><tr><td>Escherichia coli BW 25113</td><td>The Coli Genetic Stock Center</td><td>7636</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td><td>Fisher brand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4918</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLSV025NB</td><td>pore size 5 &micro;m</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52t</td><td>Image processing and analysis</td></tr><tr><td>Incubating orbital shaker set at 37 &deg;C</td><td>VWR</td><td>97009-890</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop</td><td>Sigma</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>InSight DeepSee femtosecond pulsed laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>Model: insight X3</td><td>Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging</td></tr><tr><td>Lock-in amplifier</td><td>Zurich Instrument</td><td>HF2LI</td><td>Demodulate the SRS signals</td></tr><tr><td>Oil condenser</td><td>Olympus</td><td>U-AAC</td><td>NA 1.4</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 47085</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode</td><td>Hamamatsu</td><td>S3994-01</td><td>Detector</td></tr><tr><td>Polypropylene conical tube 15 mL</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene filters</td><td>Thermo Scientific</td><td>726-2520</td><td>pore size 0.2 &micro;m</td></tr><tr><td>Sterile petri dishes</td><td>Corning</td><td>07-202-031</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10 mL</td><td>Fisher brand</td><td>14955459</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model: DU 530</td><td>Measuring optical density at wavelength of 600 nm</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Water objective</td><td>Olympus</td><td>UPLANAPO/IR</td><td>60&times;, NA 1.2</td></tr></tbody></table>

snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde raman-verstrooiing beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

Om de verspreiding van antimicrobieel resistente infecties te vertragen en te voorkomen, is het dringend noodzakelijk om de antimicrobiële effecten op pathogenen kwantitatief te bepalen. Het duurt meestal dagen om de AST te voltooien met conventionele methoden op basis van de langdurige cultuur, en ze werken niet direct voor klinische monsters. Hier rapporteren we een snelle AST-methode die mogelijk wordt gemaakt door gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) beeldvorming van deuteriumoxide (D2O) metabole opname. Metabole opname van D2O in biomassa en de metabole activiteitsremming bij blootstelling aan antibiotica op het niveau van één bacterie worden gemonitord door SRS-beeldvorming. De single-cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) van bacteriën bij blootstelling aan antibiotica kan worden verkregen na een totaal van 2,5 uur monstervoorbereiding en -detectie. Bovendien is deze snelle AST-methode direct toepasbaar op bacteriële monsters in complexe biologische omgevingen, zoals urine of volbloed. SRS metabole beeldvorming van deuteriumincorporatie is transformerend voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Het effect van incubatietijd op de opname van deuterium wordt gemeten door spontane Raman-microspectroscopie in het C-D (2070 tot 2250 cm-1) en C-H (2.800 tot 3.100 cm-1) gebied (figuur 4a). De time-lapse eencellige Raman-spectra van P. aeruginosa gekweekt in 70% D2O met medium vertonen een toenemende CD / CH-intensiteit gedurende de incubatietijd van 0 tot 180 min. (Figuur 4b) De toenemende C-D-abundantie in enkele micr...

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests kunnen binnen 2,5 uur in urine en bloed worden verkregen, wat wordt beschouwd als een enorme vermindering van de analysetijd in vergelijking met de conventionele bouillonmicroverdunningsmethode. Het kan bacteriële metabole activiteit in een complexe omgeving, zoals volbloed, volgen. Controleer om te beginnen de bacteriële concentratie van de monsters door de optische dichtheid te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nanometer.Om een uiteindelijke celconcentratie van acht keer 10 tot de vijfde kolonievormende eenheden, of CFU, per milliliter te bereiken, verdunt u de bacteriële oplossing met behulp van het normale MHB-medium zonder deuterium. Na het mengen van de bacteriële cellen door vortex, verwijdert u 300 microliter aliquots van de bacteriële oplossing in zeven 1,5-milliliter microbuisjes en een 600 microliter aliquot van de bacteriële oplossing in een 1,5-milliliter microbuis. Voeg vervolgens 4,8 microliter van de antibioticumvoorraadoplossing toe aan de microbuis met 600 microliter van de bacteriële oplossing om de uiteindelijke antibioticaconcentratie van acht microgram per milliliter te bereiken.Voeg 300 microliter van de bacteriële oplossing met antibioticum toe aan een aliquot van 300 microliter van de bacteriële oplossing zonder antibioticum om een tweevoudige verdunde oplossing te bereiken met de uiteindelijke antibioticaconcentratie van vier microgram per milliliter. Herhaal de tweevoudige seriële verdunning van de testantibiotica totdat de laagste concentratie van 0,25 microgram per milliliter is bereikt. Gooi 300 microliter van de oplossing uit de laatste microbuis weg.Wijs één buis zonder antibiotica toe aan de positieve controle met deuteriumbehandeling en de negatieve controle zonder deuterium. Incubeer het bacteriële aliquot met het antibioticum dat MHB-medium bevat gedurende één uur. Bereid ondertussen een seriële verdunning van antibiotica met 100% deuteriumhoudend MHB-medium met dezelfde concentratiegradiënten als eerder beschreven.Voeg na een uur incubatie 700 microliter antibioticum serieel verdund met 100% deuteriumhoudend MHB-medium toe aan de 300 microliter voorbehandelde antibioticabacteriën in dezelfde antibioticaconcentratie. Homogeniseer het mengsel door meerdere keren op en neer te pipetteren. Voeg 700 microliter antibioticavrije 100% deuteriumhoudende MHB-medium toe aan 300 microliter antibioticavrije bacteriën als een positieve controle.Voeg 700 microliter antibioticavrije 0% deuteriumhoudende MHB-medium toe aan 300 microliter antibioticavrije bacteriën als negatieve bestrijding. Incubeer alle microbuisjes bij 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut gedurende 30 minuten. Na incubatie, centrifugeer het ene milliliter met antibiotica en deuterium behandelde bacteriële monster op 6, 200 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Was de pellet vervolgens twee keer met gezuiverd water. Bevestig de monsters in een formalineoplossing van 10% volume per volume en bewaar ze bij vier graden Celsius. Controleer de Escherichia coli-concentratie van het vers bereide bacteriële monster door de optische dichtheid te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nanometer.Om de klinische urineweginfectiemonsters na te bootsen, piekt u het Escherichia coli-monster in 10 milliliter gedeïdentificeerde urinemonsters om een uiteindelijke concentratie van 10 tot de zes CFU per milliliter te bereiken. Filter de Escherichia coli spiked urine met behulp van een filter van vijf micron en verdeel de gefilterde bacteriële oplossing in 300 microliter aliquots in zeven microbuizen van 1,5 milliliter en een aliquot van 600 microliter in één microbuisje van 1,5 milliliter. Voer deuteriumincorporatiebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica zoals eerder beschreven.Om de klinische bloedbaaninfectiemonsters na te bootsen, spike Pseudomonas aeruginosa in één milliliter gedeïdentificeerd menselijk bloed om een uiteindelijke concentratie van 10 tot de zesde CFU per milliliter te bereiken. Om het bloed te lyseren, voeg je negen milliliter steriel gezuiverd water toe. Filter het Pseudomonas aeruginosa spiked bloed met behulp van een filter van vijf micron.Oogst vervolgens bacteriën uit het gefilterde monster tot een volume van één milliliter door centrifugeren bij 6.200 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verdeel na centrifugatie de Pseudomonas aeruginosa spiked bloedoplossing in 300 microliter aliquots in zeven 1,5-milliliter microbuisjes en een 600 microliter aliquot van de bacteriële oplossing in één 1,5-milliliter microbuis en voer deuterium-opnamebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica zoals eerder beschreven. Was voor de monstervoorbereiding een milliliter vaste bacterieoplossing met gezuiverd water en centrifugeer de gewassen bacterie-oplossing op 6, 200 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Verwijder het supernatant en verrijk de bacteriële oplossing tot ongeveer 20 microliter met gesteriliseerd water. Deponeer de bacteriële oplossing op een poly-L-lysine gecoat afdekglas, sandwich met een ander afdekglas en sluit het monster af. In de SRS-microscoop levert een instelbare femtosecondelaser met een herhalingsfrequentie van 80 megahertz de pomp- en Stokes-excitatielasers.De Stokes-bundel wordt gemoduleerd door een acousto-optische modulator van 2,4 megahertz. De twee balken worden colinear gecombineerd door middel van een dichroïsche spiegel. Vervolgens worden de pomp en Stokes-stralen in een in het laboratorium gebouwde laserscanmicroscoop geleid met een 2D Galvo-spiegel voor laserscanning.Een waterprester van 60x richt de lasers op het monster en een oliecondensor verzamelt het signaal van het monster. Twee filters worden gebruikt om de Stokes-straal eruit te filteren, terwijl de pompbundel wordt gedetecteerd door een fotodiode, waarna het gestimuleerde Raman-signaal wordt geëxtraheerd door een lock-in versterker. Met behulp van de besturingssoftware voert u de golflengte van de pomp in en stemt u deze af op 852 nanometer.Stel de trillingsfrequentie C tot D in op 2, 168 golfnummer om bacteriën in beeld te brengen met behulp van een SRS-microscoop. Meet het laservermogen met behulp van een vermogensmeter. Stel het vermogen van de pomplaser op het monster in op acht milliwatt en het vermogen van de Stokes-laser op het monster op 50 milliwatt door de halfgolfplaat voor de laseruitgang aan te passen.Plaats het standaardmonster DMSO d6 op het monsterstadium en gebruik een 60x waterdompelingsobjectief om de pomp en Stokes-lasers op het monster te richten. Door de schroeven van de reflectiespiegels af te stellen, de pomp- en Stokes-stralen ruimtelijk uit te lijnen en de twee stralen in een rechtopstaande microscoop te leiden die is uitgerust met een 2D Galvo-spiegelsysteem voor laserscanning. Stel in het bedieningspaneel van de software elke SRS-afbeelding in op 200 bij 200 pixels en de pixelverblijftijd op 30 microseconden.De totale acquisitietijd voor één afbeelding is ongeveer 1,2 seconden. Stel de stapgrootte in op 150 nanometer, zodat de beeldgrootte ongeveer 30 bij 30 micrometer in het kwadraat is. Nadat u het systeem hebt geoptimaliseerd, haalt u het standaardmonster eruit en plaatst u het bacteriële monster op het monsterstadium onder het doel van 60x waterdompeling.Start de SRS-beeldvorming van bacteriële monsters. Afbeelding van ten minste drie gezichtsvelden voor elk voorbeeld. Het effect van incubatietijd op de deuteriumincorporatie wordt gemeten door spontane Raman-microspectroscopie in de CD- en CH-regio's.De CD over CH intensiteit ratio plot over deuterium incubatietijd voor enkele bacteriën toonde toenemende CD over CH intensiteit over incubatietijd van nul tot 180 minuten. SRS-beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa werd uitgevoerd na incubatie met gentamicine en 70% deuterium. De verdere kwantitatieve statistische analyse toonde aan dat CD-signalen van bacteriën significant lager waren bij twee microgram per milliliter, of een hogere gentamicineconcentratie dan zonder gentamicinebehandeling.De cutoff intensiteitsdrempel bij 0,60 concludeerde dat Pseudomonas aeruginosa metabolisch geremd was bij twee microgram per milliliter en hogere concentraties gentamicine. De SC-MIC voor Pseudomonas aeruginosa tegen gentamicine in een normaal MHB-medium werd bepaald op twee microgram per milliliter, wat binnen het eenvoudige verschilbereik met MIC van vier microgram per milliliter lag, bepaald door de bouillonmicroverdunningsmethode. Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests, of AST, van Escherichia coli spiked urinemonsters werden uitgevoerd door SRS-beeldvorming.De SC-MIC voor het Escherichia coli spiked urinemonster tegen amoxicilline werd vastgesteld op vier microgram per milliliter, dat dezelfde gevoeligheidsuitlezing heeft als de MIC van acht microgram per milliliter volgens de conventionele bouillonverdunningsmethode voor pure Escherichia coli in normaal MHB-medium. De toepasbaarheid van snelle ASAT van Pseudomonas aeruginosa piek in menselijk bloed werd onderzocht door middel van SRS-beeldvorming. De CD-intensiteit van het SRS-beeld bij 2.168 per centimeter werd gedomineerd door bacteriële signalen afkomstig van de metabole deuteriumincorporatie van levende bacteriën.De SC-MIC voor Pseudomonas aeruginosa in het bloed werd vastgesteld op twee microgram per milliliter, wat goed overeenkwam met het conventionele standaard MIC-resultaat voor Pseudomonas aeruginosa in het normale groeimedium. Het bacteriële celnummer dat wordt gebruikt voor antimicrobiële gevoeligheidstests wordt op ongeveer vijf keer 10 tot de vijfde kolonievormende eenheden per milliliter gehouden, zoals aanbevolen door het Clinical and Laboratory Standards Institute. Een hogere bacterieconcentratie kan leiden tot een toename van de minimale remmende concentratie.Het combineren van in situ pathogene identificatie en snelle antimicrobiële gevoeligheidstestdiagnostiek zou een groot potentieel kunnen hebben voor vertaling naar een kliniek die tijdige identificatie van geschikte antimicrobiële middelen voor nauwkeurige behandeling mogelijk maakt.

rapid-antimicrobial-susceptibility-testing-stimulated-raman

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Zhang, M. et. al., Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the application of stimulated Raman scattering microscopy to assess susceptibility to antibiotics by tracking deuterium-labeled metabolic activity. By monitoring carbon–deuterium signals, the method enables rapid detection of resistant and susceptible bacterial populations.

Detection of Bacterial Antibiotic Susceptibility Using a Stimulated Raman Scattering Microscope

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

We hebben een microfluïdisch platform ontwikkeld voor snelle antibioticagevoeligheidstests. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën kunnen deze stressvolle omstandigheden echter overleven.

Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip

Hier beschrijven we een colorimetrische test om de aanwezigheid van reducerende suikers te detecteren tijdens de kieming van bacteriële sporen.

Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht

De werkzaamheid van antibiotica wordt meestal bepaald door het uitvoeren van dodingskinetische studies en het meten van kolonievormende eenheden (CFU's). Door rasterelektronenmicroscopie (SEM) te integreren met deze standaardmethoden, kunnen we de farmacologische effecten van behandeling tussen verschillende antibiotica onderscheiden.

Een protocol om de morfologische veranderingen van<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In reactie op Antibiotische Behandeling

Een eenvoudige ATP-metende assay en leven/dood kleuring methode dienden te kwantificeren en te visualiseren van Neisseria gonorrhoeae voortbestaan na de behandeling met ceftriaxone. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de antimicrobiële gevolgen van een antibioticum en kan worden gebruikt voor het definiëren van de minimale remmende concentratie van antibiotica in bacteriële biofilms.

Kwantitatieve onderzoek van antibiotische gevoeligheid van Neisseria gonorrhoeae met behulp van aggregaten ATP-gebruik commerciële testen en Live/Dead vlekken

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) biedt een krachtig platform voor bacteriële studies, waardoor resolutie op nanoschaal kan worden bereikt. Zowel het in kaart brengen van subcellulaire veranderingen (bijvoorbeeld bij celdeling) als vergelijkende studies van de chemische samenstelling (bijvoorbeeld als gevolg van medicijnresistentie) kunnen worden uitgevoerd op een enkel celniveau in bacteriën.

Atomic Force Microscopie gecombineerd met infraroodspectroscopie als hulpmiddel om single bacterium chemistry te onderzoeken

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Een nieuwe monstervoorbereidingsmethode wordt gedemonstreerd voor de analyse van op agar gebaseerde, bacteriële macrokolonies via matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatiebeeldvorming massaspectrometrie.

Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie

We rapporteren een stage-top, flexibele omgevingskamer voor time-lapse beeldvorming van levende cellen met behulp van rechtop gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie met verzonden signaaldetectie. Lipidedruppeltjes werden afgebeeld in SKOV3-cellen behandeld met oliezuur gedurende maximaal 24 uur met een tijdsinterval van 3 minuten.

Een flexibele kamer voor time-lapse live-cell imaging met gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Om de snelle en nauwkeurige detectie van Acinetobacter baumannii te vergemakkelijken, presenteren we een protocol dat gebruik maakt van Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in combinatie met LbaCas12a-endonuclease voor het identificeren van A. baumannii-infecties .

Snelle en specifieke detectie van Acinetobacter baumannii-infecties met behulp van een op recombinasepolymeraseamplificatie/Cas12a gebaseerd systeem

Leer snelle antimicrobiële gevoeligheidstests met gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van deuteriumincorporatie in individuele bacteriën. Deze methode levert resultaten binnen 2,5 uur uit urine en bloed.

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie (Video) | JoVE Journal

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Meer video's verkennen