Name: Geautomatiseerde detectie en analyse van exocytose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Leer geautomatiseerde detectie en analyse van exocytose met behulp van computer vision-algoritmen in MATLAB en TIRF-microscopie. Deze methode classificeert exocytotische gebeurtenissen en beoordeelt hun ruimtelijke-temporele organisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dustin Revell en Reginald Edwards voor het testen van code en de GUI. De nationale instituten voor gezondheid ondersteunden dit onderzoek: waaronder R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) en F31NS103586 (FLU).

1. Kies datasets en directory
<ol><li>Als u gegevenssets wilt selecteren voor analyse, klikt u op de knop Gegevenssets zoeken (afbeelding 2A, rood vak 1)om naar de map te navigeren waar gegevens worden gedeponeerd (bijvoorbeeld de map RawData). Gegevensbestanden vullen de gegevensbestanden automatisch in als een lijst. Er kan meer dan één gegevensset in de map staan.</li>
	<li>Klik op de knop Directory kiezen en selecteer de map (bijv. Test) waar geanalyseerde bestanden worden gedeponeerd (figuur 2A, rood vak 2) . Een set mappen en voltooide analysebestanden en tussenliggende tijdelijke afbeeldingen worden in deze map gemaakt wanneer de knop Analyse wordt ingedrukt. Er worden fouten geproduceerd als er geen map wordt gekozen.</li>
</ol>2. Stel de pixelgrootte en framerate in
<ol><li>Vul de juiste framesnelheid en pixelgrootte van de afbeeldingen in het juiste vak "Framerate" of "pixelgrootte" in (figuur 2A, groen vak). Als er geen waarden worden opgegeven (ze zijn ingesteld op de standaardwaarde "0"), wordt in het programma gezocht naar de metagegevens die aan het bestand zijn gekoppeld op framerate en pixelgrootte. Als deze waarden niet kunnen worden gevonden, wordt standaard per pixel gebruikt voor meting en per frame voor tijdspunten. OPMERKING: In het opgegeven voorbeeld is de framerate 100 en de pixelgrootte 0,08.</li>
</ol>3. Maskers kiezen of maken
<ol><li>Gebruik de knop Mask Maker om automatisch celmaskers te maken voor de gegevens in de lijst met bestandsgegevenssets (figuur 2A, blauw vak). Na gebruik van de knop Mask Maker wordt een nieuwe map in de gekozen map gemaakt met de naam MaskFiles. De "Run indicator" wordt geel tijdens het hardlopen en keert terug naar groen wanneer deze is voltooid. OPMERKING: Een masker voor elk bestand in de lijst Gegevensbestanden wordt gemaakt van de eerste 10 frames van het afbeeldingsbestand (of van alle frames als er minder dan 10 in het afbeeldingsbestand staan) en in de map MaskFiles gedeponeerd met behulp van het juiste naamgevingsschema (hieronder beschreven).</li>
	<li>Zorg ervoor dat de maskerbestanden automatisch de lijst Maskerbestanden vullen. De gebruiker kan rechtstreeks overgaan tot de analyse. OPMERKING: Controleer maskerbestanden altijd visueel en bevestig dat ze de hele interesseregio vastleggen. Het eerste frame van het gegevensbestand en het maskerbestand worden weergegeven in de gebruikersinterface wanneer deze is geselecteerd. (Figuur 2B). De Mask Maker kan fouten veroorzaken in het geval van een laag signaal naar ruis, dus het valideren dat maskerbestanden geschikt zijn, is van cruciaal belang voor kwaliteitscontrole.</li>
	<li>Als alternatief voor het gebruik van Mask Maker, als het signaal naar ruis van afbeeldingen onvoldoende is, maakt u maskers handmatig in ImageJ.<ol>
<li>Open eerst het onbewerkte afbeeldingsbestand in ImageJ (figuur 3A).</li>
		<li>Klik op de knop Polygoonselectie en klik om een masker rond de cel te tekenen. Als u klaar bent, dubbelklikt u op het laatste punt om de veelhoek te voltooien.</li>
		<li>Als u klaar bent, navigeert u naar bewerken | Selectie | Masker maken (figuur 3B). Er wordt een nieuw omgekeerd masker gemaakt op basis van de polygoontekening. Sla maskers op in een aangewezen map MaskFiles in de gekozen map. Het naamgevingsschema voor maskerbestanden moet overeenkomen met de bijbehorende afzonderlijke gegevensbestanden, gevolgd door "_mask_file". Als een gegevensbestand bijvoorbeeld de naam "VAMP2_488_WT_1.tif" heeft, moet het bijbehorende maskerbestand de naam "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" krijgen.</li>
		<li>Gebruik de knop Maskfiles zoeken om naar de gekozen map met gedeponeerde aangepaste maskerbestanden te navigeren. De maskers vullen de maskerbestanden als een lijst. OPMERKING: Het is belangrijk om voor elk gegevensbestand een masker te hebben voordat u de analyse uitvoert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analyse en functie-extractie
<ol><li>Nadat de map is gekozen en de lijst Gegevensbestanden en Maskerbestanden zijn ingevuld, klikt u op de knop Analyse (figuur 4A). Als de classificatie van exocytische gebeurtenissen vereist is, gaat u naar stap 5. OPMERKING: De klik op de knop Analyse voert een reeks geautomatiseerde taken uit om de gegevens te analyseren. Het maakt afzonderlijke mappen in de gekozen map om geanalyseerde gegevens te deponeren. Tijdens het hardlopen verandert de "run indicator" van groen naar geel (figuur 4A, rood vak). Nadat de analyse is voltooid, verandert dit weer in groen.</li>
	<li>Zoek een map DataFiles (Figuur 4B) met de volledige set analysebestanden (evenals functie-extractiebestanden, die later in classificatie moeten worden gebruikt) met de naam volgens elk gegevensbestand (Figuur 4C). OPMERKING: Een beschrijving van deze analysebestanden vindt u hieronder in de sectie Representatieve resultaten.</li>
</ol>5. Classificatie van exocytische gebeurtenissen
<ol><li>Als u gelijktijdige classificatie van exocytische gebeurtenissen met geautomatiseerde detectie wilt uitvoeren, schakelt u het selectievakje Classificatie in voordat u op de knop Analyse klikt. Wijs voor elke exocytische gebeurtenis een waarschijnlijkheidsscore toe tussen 0-1 voor elke klasse. Een exocytische gebeurtenis wordt beschouwd als een van de vier klassen als de waarschijnlijkheidsscore voor die klasse > 0,5 is. OPMERKING: Zodra de analyse is voltooid, verschijnt er een nieuwe map met gegevensbestanden in de gekozen map. De map bevat analysebestanden die overeenkomen met elk afbeeldingsbestand.</li>
</ol>6. Spatiotemporale analyse van exocytose met behulp van Ripley's K-waarden
<ol><li>Maak een apart maskerbestand "neurite" en "soma". Segmenteer eerst de soma uit de neuriet. Er is geen onpartijdige methode om de soma van de neurieten te segmenteren, dus de gebruiker moet verblind worden voor het conditioneringsexperiment en het beste oordeel gebruiken; een ellipsoïde zonder duidelijke neurietextensies wordt voorgesteld.</li>
	<li>Open ImageJ/Fiji.</li>
	<li>Sleep het maskerbestand en laat het vallen of gebruik File | Open en selecteer vervolgens het maskerbestand.</li>
	<li>Gebruik het gereedschap Kleurkiezer en klik op een van de zwarte pixels op de achtergrond van het masker om de kleur in te stellen op zwart.</li>
	<li>Gebruik het gereedschap polygoonselectie of uit de vrije hand om een omtrek rond de soma te tekenen en deze te scheiden van de neurieten. Dit vereist handmatige besluitvorming.</li>
	<li>Klik op Bewerken | Selectie | Masker maken. Er wordt een nieuwe afbeelding geopend met de omcirkelde soma gesegmenteerd van de rest van de afbeelding. Hiermee wordt een somamaskerbestand gemaakt.</li>
	<li>Zonder het getekende gebied te verplaatsen, klikt u op de koptekst van het oorspronkelijke maskerbestand.</li>
	<li>Klik op Bewerken | Vul in om de omcirkelde soma in te vullen, zodat alleen de neurieten het masker blijven.</li>
	<li>Zodra afzonderlijke neurite- en maskerbestanden zijn verkregen, slaat u beide maskerbestanden op.</li>
	<li>Open "neurite_2D_network" in Matlab.</li>
	<li>Navigeer in MATLAB naar de map met alle analysegegevens.</li>
	<li>Wijzig het pad "maskernaam" in de naam van het neurietmasker, d.w.z. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"</li>
	<li>Wijzig de "csv_file_name" naar waar fluorescent_traces.csv bestand zich bevindt, d.w.z. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".</li>
	<li>Klik op Uitvoeren om het neurietmaskerbestand te skeletoniseren. Hiermee wordt een geskeletiseerde versie van het neurite-maskerbestand gemaakt en wordt het als CSV-bestand onder de map maskfiles gedeponeerd.</li>
	<li>Genereer vervolgens een CSV-bestand voor de soma. Open "CSV_mask_creator.m" in Matlab.</li>
	<li>Zet in het pad voor de "maskernaam" naar de naam van het somamasker, d.w.z. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>Wijzig de "writematrix" in csv-bestandsnaam die moet worden gemaakt, d.w.z. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"</li>
	<li>Klik op Uitvoeren. Hiermee wordt het nieuwe VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv bestand gemaakt.</li>
	<li>Herhaal 6.14 voor elk maskerbestand.</li>
</ol>7. RStudio setup
<ol><li>Open Rstudio en open ripleys_k_analysis. R-bestand.</li>
	<li>Installeer het pakket "spatstat" in RStudio door naar Tools | Installeer pakketten en typ "spatstat" in, gevolgd door op Installerente klikken. OPMERKING: Dit hoeft slechts één keer per Rstudio-installatie te worden uitgevoerd.</li>
	<li>Voer de bibliotheek spatstat uit aan het begin van elke sessie.</li>
	<li>Let in dit geval op twee hoofdvariabelen: 'neuron_mask' en 'neuron_datapoints'. Neuron Mask verwijst naar de set maskerbestanden die moeten worden uitgevoerd, d.w.z. soma-maskerbestanden." OPMERKING: Voer alle soma-maskerbestanden samen uit, los van Neurite-maskerbestanden en vice versa.</li>
	<li>Lees in de .csv van de maskerbestanden voor elk van de te analyseren neuronen.</li>
	<li>Voer meerdere bestanden tegelijk uit door extra neuron_mask_n+1 te kopiëren. Dit maakt het mogelijk om ripley's analyse samen te voegen, met behulp van het script beschreven in sectie 8.</li>
	<li>Controleer nu de tweede variabele, "neuron_datapoints".</li>
	<li>Lees in de." X_fluorescent_traces.csv" bestand gegenereerd door het analyseprogramma (door alle extracted_R bestand) met de x,y,t posities van de exocytische gebeurtenissen, evenals het neurite-specifieke bestand van de x,y posities voor het 2D-netwerk. Dit gaat in de "neuron_datapoints" positie.</li>
	<li>In RStudio Code selecteren | Regio | uitvoeren Voer alles uit. Dit genereert verschillende plots, waaronder de gegroepeerde Ripley's K-waarden en dichtheidspercelen.</li>
	<li>Sla plots op door naar export | te gaan Afbeelding opslaan als | Selecteer de juiste afbeeldingsindeling en map en voer de juiste bestandsnaam in en klik op Opslaan. OPMERKING: De plotfunctie voor de heatmaps wordt in het script aangeroepen met behulp van "plot(density(soma_data,0.4)". Het getal "0.4" geeft hier aan hoe glad de dichtheidsfunctie moet zijn. Het kan worden gewijzigd om gebruikersgegevens op een zinvolle manier aan te passen, maar als vergelijkingen moeten worden uitgevoerd tussen verschillende heatmaps, moet het aantal tussen hen hetzelfde zijn.</li>
	<li>
Afbeelding exporteren of opslaan vanuit Rstudio. Als een heatmap verder moet worden bewerkt, kiest u een geschikt bestandstype (SVG of EPS).</li>
</ol>8. Ripley's analyse
OPMERKING: De Ripleys_k_analysis. R-bestand genereerde ook automatisch Ripley's k-waardeplots. Als u het volledige script uitvoert, worden automatisch de onderstaande functies uitgevoerd, maar het wordt in detail opgenomen als u elk deel van het script afzonderlijk wilt uitvoeren of wijzigingen in de analyse wilt aanbrengen.
<ol><li>Voer eerst de envelopfunctie voor elke cel uit. Deze functie simuleerde volledige ruimtelijke willekeur (CSR) om de Ripley's K-waarde van het exocytische gebeurtenispuntpatroon te testen. Data_envelope_1 = envelop(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = WAAR) Data_envelope_2 = envelop(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = WAAR)</li>
	<li>Bundel vervolgens deze enveloppen en maak één schatting van MVO voor de groep: Pool_csr = zwembad(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) Voer vervolgens de Functie Ripley's K uit voor alle gegevenspunten. Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = WAAR) Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = WAAR)</li>
	<li>Zodra u klaar bent, bundelt u de K-waarden van de Ripley samen en start u hun betrouwbaarheidsintervallen op met de volgende opdracht: Gegevensgroep = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>Bootstrap met de volgende opdracht: Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)</li>
	<li>Plot de gegevens.</li>
	<li>Als een hard-statistisch verschil vereist is, wordt de studentized permutatietest opgenomen in het spatstat-pakket om te testen op een verschil tussen groepen puntpatronen: Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ groep, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren niets openbaar te maken.

Houd er bij het gebruik van de exocytische detectie- en analysesoftware rekening mee dat het programma alleen compressie zonder verlies accepteert .tif bestanden als invoer. De .tif afbeeldingsbestanden kunnen 8-bits, 16-bits of 32-bits grijswaardenafbeeldingen (één kanaal) zijn. Andere afbeeldingsindelingen moeten vóór invoer worden geconverteerd naar een van deze typen. Ter referentie, voorbeelden die hier worden gebruikt, zijn 16-bits grijswaardenafbeeldingen.
Inherent aan het geautomatisee...

VAMP-pHluorine constructen of transferrine receptor (TfR)-pHuji constructies zijn uitstekende markers van exocytische gebeurtenissen, omdat deze pH-gevoelige fluoroforen worden gedoofd in het zure blaasje lumen en fluoresce onmiddellijk na fusie porie opening tussen het blaasje en plasmamembraan1. Na het openen van de fusieporiën vergaat fluorescentie exponentieel, met enige heterogeniteit die informatie over de fusiegebeurtenis onthult. Hier wordt een GUI-toepassing (Graphical User Interface) beschreven die automatisch exocytische gebeurtenissen detecteert en analyseert. Met deze applicatie kan de gebruiker automatisch exocytische gebeurtenissen detecteren die worden onthuld door pH-gevoelige markers2 en functies genereren van elke gebeurtenis die kan worden gebruikt voor classificatiedoeleinden3 (Figuur 1A). Daarnaast wordt analyse van exocytische gebeurtenisclustering met behulp van ripley's K-functie beschreven.
De geautomatiseerde classificatie van exocytische gebeurtenissen in verschillende exocytische modi werd onlangs gerapporteerd3. Twee modi van exocytose, full-vesicle fusion (FVF) en kiss-and-run fusion (KNR) exocytose zijn eerder beschreven4,5,6,7. Tijdens FVF verwijdt de fusieporiën en wordt het blaasje opgenomen in het plasmamembraan. Tijdens KNR opent de fusieporiën tijdelijk en hersealen vervolgens4,5,8,9,10. Vier modi van exocytose werden geïdentificeerd in het ontwikkelen van neuronen, twee gerelateerd aan FVF en twee gerelateerd aan KNR. Dit werk toont aan dat zowel FVF als KNR verder kunnen worden onderverdeeld in fusiegebeurtenissen die onmiddellijk overgaan tot fluorescentiebederf (FVFi en KNRi) na het openen van de fusieporiën of exocytische gebeurtenissen die een vertraging vertonen na het openen van de fusieporiën voordat fluorescentieverval begint (FVFd en KNRd) (Figuur 1B). De classificatie identificeert de modus van exocytose voor elke fusiegebeurtenis. Hier is deze analyse opgenomen in een GUI die kan worden geïnstalleerd in MATLAB in Windows- en Mac-gebaseerde besturingssystemen. Alle analysebestanden zijn te vinden op https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing of https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>R</td><td>R Core Team</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde detectie en analyse van exocytose

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF-microscopie van pH-gevoelige GFP (pHluorine) verbonden aan blaasjes SNARE-eiwitten is een effectieve methode om exocytische gebeurtenissen in het celkweek van één blaasje te visualiseren. Om een onbevooroordeete, efficiënte identificatie en analyse van dergelijke gebeurtenissen uit te voeren, werd een computervisiegebaseerde aanpak ontwikkeld en geïmplementeerd in MATLAB. De analyse pijplijn bestaat uit een algoritme voor cel segmentatie en exocytische gebeurtenis identificatie. De computervisiebenadering omvat hulpmiddelen voor het onderzoeken van meerdere parameters van afzonderlijke gebeurtenissen, waaronder de halfwaardetijd van fluorescentiebederf en piek ΔF/F, evenals analyse van de frequentie van exocytose in hele cellen. Deze en andere parameters van fusie worden gebruikt in een classificatiebenadering om verschillende fusiemodi te onderscheiden. Hier voert een nieuw gebouwde GUI de analysepijplijn van begin tot eind uit. Verdere aanpassing van Ripley's K-functie in R Studio wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen geclusterde, verspreide of willekeurige voorkomen van fusiegebeurtenissen in zowel ruimte als tijd.

Hier werd de GUI (Figuur 2A) gebruikt om exocytische gebeurtenissen te analyseren van drie VAMP2-pHluorine die neuronen uitdrukken bij 3 DIV met behulp van TIRF (totale interne reflectie fluorescentie) microscopie. E15.5 corticale neuronen werden geïsoleerd, gevolgd door transfectie met VAMP2-pHluorine en plating met behulp van de protocollen zoals beschreven in Winkle et al., 2016 en Viesselmann et al., 201111,12. De methodologie va...

We ontwikkelden geautomatiseerde computer vision software om exocytische gebeurtenissen te detecteren die worden gekenmerkt door pH-gevoelige fluorescentiesondes. Hier demonstreren we het gebruik van een grafische gebruikersinterface en RStudio om fusiegebeurtenissen te detecteren, spatiotemporale parameters van fusie te analyseren en weer te geven en gebeurtenissen in verschillende fusiemodi te classificeren.

Geautomatiseerde detectie en analyse van exocytose

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

De geautomatiseerde detectie en analyse van exocytose software zal de gebruiker in staat stellen om automatisch exocytische gebeurtenissen en TIRF beeldsequenties van pH-gevoelige fluoroforen te detecteren. Het zal ook automatisch kenmerken van exocytose uitvoeren, zoals de ruimtelijke verdeling of de frequentie, evenals individuele eigenschappen van exocytische gebeurtenissen, zoals de halfwaardetijd of verandering in fluorescentie over de achtergrond. Daarnaast is een optie opgenomen om exocytische gebeurtenissen te classificeren in vier modi van exocytose, eerder beschreven in de literatuur.Om de geautomatiseerde detectie- en analysesoftware voor exocytose te gebruiken, klikt u eerst op de knop Gegevensset zoeken en navigeert u naar waar uw gegevens worden gedeponeerd en wilt u in een map met de naam onbewerkte gegevens plaatsen. Uw gegevensbestanden vullen de lijst hier automatisch in en u kunt een willekeurig aantal gegevensbestanden in deze map hebben. Vervolgens wilt u een map kiezen waarvoor uw analysebestanden worden gedeponeerd.Hier heb ik een map gekozen met de naam test. U wilt ook de framesnelheid van uw afbeeldingen en de pixelgrootte invullen. Hier zijn mijn framesnelheden honderd milliseconden per frame, mijn pixelgrootte is acht nanometer.Ten slotte hebt u maskerbestanden nodig om de geautomatiseerde detectie- en analysesoftware voor exocytose uit te voeren. U kunt de meegeleverde knop mask maker gebruiken om automatisch maskerbestanden uit uw gegevensbestanden te genereren. De run-indicator wordt geel en vervolgens weer groen wanneer de maskermaker klaar is met draaien.Uw masker wordt gedeponeerd in een nieuwe map met de naam maskerbestanden in de door u gekozen map. En let op, maskerbestanden vullen de lijst hier automatisch in. U wilt controleren of uw maskerbestanden op de juiste manier zijn gemaakt voor uw gegevensbestanden, en u kunt dit doen door een van de gegevensbestanden in de lijst te markeren, evenals het bijbehorende maskerbestand.Het eerste frame van uw gegevensbestand wordt weergegeven en het geselecteerde maskerbestand wordt ook weergegeven. Hier. We kunnen zien dat onze maskerbestanden geschikt zijn voor de analyse bij de hand. Maskerbestanden kunnen ook afzonderlijk door de gebruiker worden geleverd.Wanneer u een maskerbestand wilt maken van een huidig gegevensbestand, raden we u aan Image J.In om dit te doen, opent u eerst de afbeelding in Afbeelding J waaruit u een maskerbestand wilt maken. U kunt vervolgens het gereedschap Polygoonselectie gebruiken om te beginnen met het maken van een maskerbestand door rond de rand van de cel te klikken. Wanneer u uw masker hebt voltooid, dubbelklikt u om verbinding te maken met de hele polygoon.Zodra dit is voltooid, gaat u naar bewerken, selecteren en masker maken. Er wordt een omgekeerd masker gemaakt. U wilt dit maskerbestand opslaan met dezelfde naam als het gegevensbestand, gevolgd door _mask_file.Als u nu uw eigen aangepaste maskerbestanden opgeeft, is het belangrijk om de geautomatiseerde detectiesoftware te laten weten waar die maskerbestanden zich bevinden. Om dit te doen, klikt u op de knop Maskerbestanden zoeken en navigeert u naar de map met uw maskerbestanden erin. De nieuwe maskerbestanden vullen de lijst hier.Het is belangrijk dat u voor elk gegevensbestand een masker hebt voordat de analyse kan worden uitgevoerd. Zodra u uw gegevensset hebt geladen, uw maskerbestanden, uw framesnelheid en pixelgrootte correct zijn aangepast en een gekozen map, kunt u eindelijk beslissen of u classificatie wilt opnemen als onderdeel van uw analyse. Als u de classificatieknop in-//uitschakelt, wordt elke exocytische gebeurtenis niet alleen exocytische gebeurtenissen gedetecteerd, maar wordt deze ook ingedeeld in een van de vier klassen.Zodra u hebt besloten hoe uw analyse moet worden uitgevoerd, kunt u de analyse starten door op de analyseknop te klikken. De run-indicator wordt geel om aan te geven dat de analyse aan de gang is en wordt weer groen wanneer uw analyse is voltooid. Zodra de analyse is voltooid, zoals aangegeven door uw run-indicator die verandert van geel naar groen, zult u merken dat er een nieuwe map met gegevensbestanden is verschenen in de door u gekozen map.In de map gegevensbestanden vindt u analysebestanden die overeenkomen met elke afbeelding die is ingesteld in uw analyserun. Bovendien is hier een celstatistiekenbestand met samenvattingsinformatie zoals de frequentie van exocytose voor elk van de beeldsets. Voor elke afbeeldingsset hebt u een fluorescerend traces-bestand, dat informatie bevat over de X-positie, Y-positie en framenummer voor waar exocytische gebeurtenissen plaatsvinden.Bovendien wordt de gemiddelde fluorescentie in een interessegebied rond elke exocytische gebeurtenis zowel voor, tijdens als na exocytose gepresenteerd. Daarnaast is er ook een trackingbestand, dat vergelijkbare informatie bevat over de X-, Y- en temporele posities. Als het classificatievak echter is aangevinkt, zijn er bovendien vier extra kolommen, die de waarschijnlijkheid aangeven van de exocytische gebeurtenis die tot een van de vier klassen behoort.Ofwel volledige blaasjesfusie onmiddellijk, volledige blaasjesfusie vertraagd, kus-en-looppas ogenblikkelijk, of kus-en-looppas vertraagd. Een exocytische gebeurtenis behoort tot een van de vier klassen als deze groter is dan 0,5 en de hoogste waarschijnlijkheid is binnen de vier beheerste klassen. In dit geval behoort de eerste exocytische gebeurtenis hier tot de volledige blaasfusie onmiddellijk, omdat het het hoogste getal boven de vier klassen is en het groter is dan 0,5.Daarnaast zijn er een aantal andere functiebestanden voor elke beeldset, die worden gebruikt tijdens de classificatie van exocytose en van belang kunnen zijn voor verdere analyse. Ten slotte, als we Ripley's K-analyse willen gebruiken om de ruimtelijk-temporele organisatie van exocytose te detecteren, zullen we eerst beginnen met het splitsen van ons maskerbestand in een neurietmaskerbestand en een somamaskerbestand. We doen dit door eerst ons masker te openen in Afbeelding J.We zullen de kleurkiezer willen gebruiken om een achtergrondpixel te selecteren.En op deze manier, wanneer we het maskerbestand invullen, is het de juiste waarde. Vervolgens gebruiken we het gereedschap polygoonselectie en schetsen we het somatische gebied. Dit vereist een beetje subjectieve, handmatige besluitvorming.We stellen een ruwe ellips voor. Zodra u dat hebt voltooid, gaat u naar bewerken, selecteren en masker maken. Ten slotte komt u terug naar ons originele maskerbestand en gebruikt u bewerken en invullen om de soma in te vullen, en nu hebben we een apart neurite- en somamaskerbestand, dat u vervolgens opslaat.Zodra u uw afzonderlijke neurite- en somamaskerbestand hebt opgeslagen, hier, heb ik het als maskerbestand onderstrepingsteken voor neurite en onderstreept soma, we komen naar MATLAB en openen het neurite 2D-netwerk MATLAB-bestand. Hier navigeren we door de huidige map naar onze directory waar we al onze analysegegevens hebben gedeponeerd. Zodra we dat hebben gedaan, hebben we het pad naar de naam van het masker gewijzigd in ons nieuwe maskerbestand dat de neuriet is.Dus in dit geval heb ik mijn neurite maskerbestand onder de map maskerbestanden. We zullen dan de CSV-bestandsnaam wijzigen naar waar ons fluorescerende traceerbestand zich bevindt. In dit geval bevindt het zich nog steeds in de map gegevensbestanden, en dus snijden de gegevensbestanden en de naam van het CSV-bestand fluorescerende traceert.Zodra dat is voltooid, kunt u vervolgens rennen. Dit maakt vervolgens een geskeletiseerde versie van het neurite-maskerbestand en deponeert het als een CSV-bestand onder de map maskerbestanden, die we hier kunnen zien. Vervolgens genereren we ook een CSV-bestand voor de soma.Open hiervoor het csv-maskermakersbestand. U wilt het pad voor uw somamasker en een naam voor het CSV-bestand dat moet worden gemaakt, inzetten. Hier ging ik gewoon door en gebruikte dezelfde exacte bestandsnaam, alleen met punt CSV toegevoegd.Druk op run en je zult zien dat er een nieuw soma CSV-bestand is gemaakt naast de neuriet. Zodra we de CSV-bestanden hebben gemaakt voor zowel het neurietmasker als het somamasker, kunnen we Ripley's K-analyse uitvoeren. Om dit te doen, navigeren we naar R Studio en openen we het Ripley's K analysis R-bestand.Er zijn hier twee hoofdvariabelen om op te letten, neuronmasker en neurongegevenspunten. Neuronmasker wijst naar de maskerbestanden die u wilt uitvoeren. In dit geval voer ik eerst de soma-maskerbestanden uit.U wilt al uw soma-maskerbestanden afzonderlijk van al uw neurite-maskerbestanden uitvoeren. Hier heb ik twee neuronen, die ik zal gebruiken voor deze analyse. U kunt er echter zoveel gebruiken als u wilt voor de Ripley's K-analyse, u wilt deze code voor neuronmasker kopiëren en plakken en de variabele wijzigen in drie en verder.De tweede variabele zijn neurongegevenspunten. Hier wilt u het wijzen op het bestand dat is gegenereerd door uw functies alle geëxtraheerde R-bestand. De mijne heette fusiestatistieken, en dat is wat het hier leest.Zoals gezegd, heb ik een tweede soma maskerbestand en neuron, dat wordt geanalyseerd, zodat we de Ripley's K samen kunnen voegen. Zodra u deze paden hebt gewijzigd in de juiste pading, gebruikt u code, voert u regio uit en voert u alles uit. Nadat de uitvoering is voltooid, worden verschillende plots gegenereerd, waaronder de gegroepeerde Ripley's K-waarden, evenals de dichtheidsplots.Deze kunnen worden opgeslagen door te exporteren, afbeeldingen op te slaan als en de juiste afbeeldingsindeling, de map, bestandsnaam te kiezen en uiteindelijk op opslaan te drukken. Hier zien we representatieve resultaten van 12 muriene corticale neuronen die vent tot fluor uitdrukken, afgebeeld op twee dagen in vitro met behulp van TIRF-microscopie. In A zien we de frequentie van exocytose gedeeld door klasse.Hier kunnen we zien dat volledige blaasfusie vaker voorkomt dan de andere klassen. In B kunnen we de modusverdeling zien, die bevestigt dat volledige blaasfusie onmiddellijk meer dan de helft van alle gebeurtenissen vormt. In C bepalen we de ruimtelijke verdeling van exocytose als warmtekaart.We kunnen zien dat de meeste exocytische gebeurtenissen zijn geclusterd in een hotspot in de buurt van de soma, evenals aan de distale uiteinden van de neurieten. In D kunnen we vaststellen dat exocytische gebeurtenissen statistisch significant geclusterd zijn en dat de grootte van deze clusters varieert van een halve micron tot een micron groot. Het gebruik van een geautomatiseerd analyseprogramma om exocytische gebeurtenissen op een onbevooroordete manier correct te identificeren en te analyseren, verhoogt de analyse-efficiëntie en verbetert de reproduceerbaarheid en strengheid.Om de nauwkeurigheid van de detectie te garanderen, is het belangrijk om een hoog signaal naar ruis tijdens beeldvorming te behouden. Het vastleggen van exocytische gebeurtenissen of andere pH-gevoelige voorbijgaande gebeurtenissen vereist een beeldfrequentie die snel genoeg is om alle gebeurtenissen vast te leggen en schattingen te verbeteren, zoals de halfwaardetijd of piekverandering in fluorescentie. We hebben aangetoond dat dit programma niet alleen werkt voor het nauwkeurig vastleggen van pH-gevoelige fluorescentie in het ontwikkelen van neuronen, maar ook voor andere celtypen.Als u echter een ander celtype gebruikt, is het belangrijk om te controleren op verschillen in nauwkeurigheid, vanwege het verschillende gedrag van tijdelijke gebeurtenissen in andere celtypen. Deze classificatie is tot op heden alleen gebruikt bij het ontwikkelen van neuronen. En inderdaad weten we niet dat deze processen bestaan in andere celtypen of op latere ontwikkelingstijdpunten in neuronen.

automated-detection-and-analysis-of-exocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a technique to visualize exocytosis in mast cells. The cells are incubated with FITC-dextran — a fluorescent reporter — which is taken up by cells inside secretory granules (SGs), where the acidic pH quenches its fluorescence. Upon stimulation of granule exocytosis, the medium's higher pH induces reporter fluorescence inside the fused SGs, which is visualized using a fluorescence microscope.

An In Vitro Technique to Visualize Exocytosis of Secretory Granules in Mast Cells

Clathrine-gemedieerde endocytose, een snel en zeer dynamisch proces, internaliseert veel eiwitten, inclusief signaalreceptoren. Het hier beschreven protocol visualiseert direct de kinetiek van individuele endocytische gebeurtenissen. Dit is essentieel om te begrijpen hoe kernleden van de endocytische machinerie met elkaar coördineren en hoe eiwitlading dit proces beïnvloedt.

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Veel verschillende methoden bestaan ​​voor de meting van extracellulaire blaasjes (EV) met flowcytometrie (FCM). Verschillende aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Twee protocollen voor het meten van EV's worden gepresenteerd, met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering.

Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

Het doel van het huidige protocol was om een ​​methode die functioneel genomische analyses van mestcel secretie zal ontwikkelen. Het protocol is gebaseerd op kwantitatieve beoordeling van de release van een tl-reporter-gen cotrasfected met het gen van interesse en real-time analyses van de morfologie van de secretoire korrel's.

Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Osmotische stress beïnvloedt exocytose en de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht tijdens dit proces. We laten zien hoe elektrochemische methoden samen met transmissie-elektronenmicroscopie combineren kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van extracellulaire osmotische druk op exocytose activiteit, blaasje quantal grootte en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven tijdens exocytose.

Toezicht op het Effect van de Stress van de osmotische op secretoire blaasjes en exocytose

Hier detail we een methode om levende cellen beeldvorming van gereglementeerde exocytose. Deze methode maakt gebruik van FITC-dextran, die hoopt zich op in lysosoom-gerelateerde organellen, als verslaggever. Deze eenvoudige methode kan ook onderscheid te maken tussen de verschillende modi van gereglementeerde exocytose in cellen die moeilijk zijn te genetisch manipuleren.

Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Live beeldvorming van lysosomale exocytose op micropatterned cellen maakt een ruimtelijke kwantificering van dit proces mogelijk. Morfologie normalisatie met behulp van micropatronen is een uitstekend hulpmiddel om algemene regels over de ruimtelijke verdeling van cellulaire processen te ontdekken.

Kraaktemporale parameters van cellulaire exocytose in micropatterned cellen kwantificeren

Dit protocol beschrijft benaderingen voor detectie en kwantificering van grote geaggregeerde en/of organelle extrusies (~4 μm) geproduceerd door C. elegans cellen in de vorm van membraangebonden exofofen. We beschrijven stammen, groeiomstandigheden, scorecriteria, timing en microscopie overwegingen die nodig zijn om dissectie van dit puin uitzetting mechanisme te vergemakkelijken.

Kwantitatieve benaderingen voor scoren in vivo Neuronal Aggregaat en Organelle Extrusie in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Leer geautomatiseerde detectie en analyse van exocytose met behulp van computer vision-algoritmen in MATLAB en TIRF-microscopie. Deze methode classificeert exocytotische gebeurtenissen en beoordeelt hun ruimtelijke-temporele organisatie.

Geautomatiseerde detectie en analyse van exocytose

Meer video's verkennen