Name: Isolatie van volwassen menselijke astrocytenpopulaties uit versgevroren cortex met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernensortering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Leer astrocyten isoleren uit versgevroren menselijke hersencortex met FANS-techniek. Deze methode levert hoogzuivere celpopulaties voor transcriptoom- en chromatintoegankelijkheidsanalyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag leden in pathologie en neurochirurgie aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï bedanken voor hulp bij de aanschaf van niet-geïdentificeerd hersenweefsel en ISMMS's Flow Cytometry CORE voor deskundig advies. De studie werd gedeeltelijk gefinancierd door NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (naar N.M.T.) en R61DA048207 (naar S.A.).

OPMERKING: Het programma voor de bescherming van menselijke proefpersonen aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï (ISMMS) en de Institutional Review Board (IRB) verzekert de ethische uitvoering van onderzoek en naleving van federale, staats- en institutionele voorschriften. In deze studie werden alle gebruikte postmortale specimens gedeïdentificeerd, verkregen onder de juiste toestemming via het biorepository en waren vrijgesteld van de aanduiding "menselijk onderzoek" door ismms IRB (HS # 14-01007).
1. Buffervoorbereiding
OPMERKING: Als u downstream RNA-sequencing uitvoert, behandel dan alle werkruimten en tools grondig met RNase Decontamination Solution om mRNA-degradatie te voorkomen.
<ol><li>Bereid lysisbuffer voor.<ol>
<li>Los het volgende op in gedestilleerd H2O tot 50 ml: 5,47 g sucrose (0,32 M definitief), 250 μL 1 M CaCl2 (5 mM definitief), 150 μL 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM definitief), 10 μL ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (0,1 mM final), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 50 μL Triton X-100 (0,1% finale) en 17 μL 3 M dithiothreitol (DTT, 1 mM final, add fresh) (zie de Tabel met materialen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sucrosebuffer voorbereiden<ol>
<li>Los het volgende op in gedestilleerd H2O tot 50 ml: 30,78 g sucrose (1,8 M definitief), 150 μL 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM final), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL van 3 M DTT (1 mM final, voeg vers toe).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bevroren weefseldissociatie in single-nucleus suspensie
<ol><li>Voeg 4 ml ijskoude lysisbuffer toe aan een 7 ml glazen weefseldouncer (grinder) en houd op ijs. Dissecteer ongeveer 200-400 mg vers ingevroren menselijke volwassen cortex, verdubbeling ongeveer 50x, en breng het weefselhomogenaat over naar een 12 ml ultracentrifuge polypropyleen buis.</li>
	<li>Voeg met een pipet van 5 ml 6,5 ml ijskoude sucrosebuffer toe aan de bodem van de ultracentrifugebuis en zorg ervoor dat de laag tussen sucrose en het weefselhomogenaat niet wordt verstoord. OPMERKING: Als u extra monsters verwerkt, moet u de buizen zorgvuldig op gewicht balanceren door extra lysisbuffer aan het lichtere monster toe te voegen. Nauwkeurige balancering van de ultracentrifugebuizen is essentieel om schade aan de rotor te voorkomen en rotatie op de juiste snelheid te garanderen.</li>
</ol>3. Ultracentrifugatie
<ol><li>Ultracentrifugeer het lysaat bij 24.400 tpm (101.814 × g) gedurende 1 uur bij 4 °C. Zuig het supernatant en puin voorzichtig op zonder de pellet te storen. OPMERKING: Een pellet is mogelijk niet zichtbaar als deze begint met minder dan 200 mg weefsel.</li>
	<li>Voeg 600 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (Ca2+, Mg2+ vrij) toe aan de kernenpellet en incubeer gedurende 10 minuten op ijs voordat u resuspendeert.</li>
	<li>Pipetteer 50 keer op en neer om de kernkorrel op ijs te resuspenseren.</li>
	<li>Gebruik een hemocytometer om de intacte kernen onder een microscoop te visualiseren en om ervoor te zorgen dat de concentratie van de resuspensie hoger is dan 105 kernen / ml voordat u doorgaat naar de volgende stap (combineer 10 μL van de geresuspendeerde kernen met 10 μL trypanblauw).</li>
</ol>4. Incubatie van antilichamen
<ol><li>Om het monster voor FANS te immunotaggen, voegt u 500 μL van de geresuspendeerde monsterpellet, 490 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ vrij), 10 μL van 10% BSA (0,1% final), 1 μL muis anti-NeuN antilichaam geconjugeerd aan AF555 (NeuN-AF555, 1:1000 eindconcentratie) en 1 μL muis anti-PAX6 antilichaam geconjugeerd aan allofycocyanine (PAX6-APC, 1:1000 eindconcentratie). OPMERKING: Alternatieve antilichamen geconjugeerd aan andere fluoroforen kunnen worden toegevoegd (zie discussie). Hier werd muis anti-OLIG2 geconjugeerd aan AF488 (1:1000 concentratie) gebruikt met gunstige resultaten.</li>
	<li>Voer alleen 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-only en single-color controles uit om gatingparameters in te stellen, waarbij indien nodig een kleine hoeveelheid van het monster wordt gebruikt.<ol>
<li>Om AF555-controle met één kleur uit te voeren, voegt u 20 μL van de geresuspendeerde monsterpellet, 970 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ vrij), 10 μL 10% BSA (0,1% definitief) en 1 μL NeuN-AF555-antilichaam (1:1000-concentratie) toe.</li>
		<li>Om APC-controle met één kleur uit te voeren, voegt u 20 μL van de geresuspendeerde monsterpellet, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ vrij), 10 μL van 10% BSA (0,1% finale) en 1 μL PAX6-APC-antilichaam (1:1000 concentratie) toe.</li>
		<li>Om alleen DAPI-controle uit te voeren, voegt u 20 μL van de geresuspendeerde monsterpellet, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ vrij) en 10 μL 10% BSA (0,1% definitief) toe (DAPI zal later worden toegevoegd, zie 4.4). OPMERKING: Als er meer dan twee antilichamen worden gebruikt, wordt het uitvoeren van fluorescentie-minus-één (FMO) controle aanbevolen naast de controles met één kleur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de monsters en de controles met rotatie in het donker gedurende 1 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg DAPI op 1:1000 toe aan alle monsters en controles en ga verder met sorteren.</li>
</ol>5. Fluorescentie-geactiveerde kernen sorteren (FANS)
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een institutionele flowcytometriefaciliteit te gebruiken met hulp van getraind personeel, tenzij u al bekwaam bent in flowcytometrie / sorteertechnieken.
<ol><li>Poort zoals hieronder weergegeven.<ol>
<li>Ten eerste, en voor elk monster, gate by forward scatter (FSC-A) vs. zijdelingse verstrooiing (SSC-A) om deeltjes op te nemen in het juiste groottebereik voor kernen, dus met uitzondering van rode bloedcellen en puin (figuur 1A). OPMERKING: Een zeer schoon kernpreparaat kan onderscheid maken tussen een kleinere puincluster en een kerncluster.</li>
		<li>Vervolgens, en voor elk monster, poort door FSC-A vs. FSC-W (of FSC-A vs. FSC-H) en SSC-A vs. SSC-W (of SSC-A vs. SSC-H) om alleen singletkernen op te nemen (figuur 1B).</li>
		<li>Vervolgens, en voor elke steekproef, poort door DAPI om intacte kernen singlets (DAPI-high gated populatie), exclusief puin (DAPI-laag, links van gated populatie) en doublets (rechts van gated populatie) op te nemen (figuur 1C).</li>
		<li>Stel verdere gating in op basis van fluorescentiecontroles, visueel bepaald als afzonderlijke clusters op FACS-plots.<ol>
<li>Voer alleen DAPI-controle uit om achtergrondkleuring van populaties te bepalen, in afwezigheid van antilichamen (figuur 1D en figuur 2A).</li>
			<li>Voer de regeling alleen NeuN-AF555 uit om de afsnijding voor NeuN+ kleuring in het kanaal voor AF555 te bepalen (figuur 2B).</li>
			<li>Voer pax6-APC-only controle uit om de cutoff voor PAX6+ kleuring in het APC-kanaal te bepalen (figuur 2C).</li>
			<li>Voer extra besturingselementen voor één kleur uit als u meer antilichamen gebruikt (figuur 2D, E). OPMERKING: Als u meer dan twee antilichamen gebruikt, wordt een FMO-controle aanbevolen om eventuele verschuivingen in populaties te visualiseren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zodra alle besturingselementen zijn uitgevoerd, trekt u de poorten voor NeuN + - en PAX6 + -collecties boven de vastgestelde drempels.<ol>
<li>Gate de NeuN + -populatie om neuronen te verzamelen (figuur 1E en figuur 2F).</li>
			<li>Gate de PAX6+ populatie van de NeuN-populatie om astrocyten te verzamelen (figuur 1E, F en figuur 2F).</li>
			<li>Poort en verzamel extra gliale populaties (zoals oligodendrocytenvoorlopercellen, zoals hier weergegeven door OLIG2 +) van de NeuN-PAX6-populatie (figuur 1F). OPMERKING: In het geval dat het bepalen van geschikte gating cutoffs moeilijk is met de flowcytometriesoftware vanwege onduidelijke populaties, kan het nuttig zijn om het aantal gebeurtenissen dat wordt gevisualiseerd te wijzigen (het aantal gebeurtenissen op de FANS-plot verhogen of verminderen).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verzamel monsters op de juiste manier op basis van de beoogde downstream-analyse.</li>
</ol>6. Verzameling van FANS-populaties voor downstream moleculaire analyses
<ol><li>Verzamel voor bulk RNA-sequencing 50.000-500.000 kernen in PBS (zie ook rubriek 7.1).<ol>
<li>Voeg 2 ml sucroseoplossing, 50 μL 1 M CaCl2 en 30 μL 1 M Mg(CH3COO)2 toe en vul met PBS tot 10 ml.</li>
		<li>Omkeren en incuberen op ijs gedurende 15 minuten, en vervolgens centrifugeren bij 900 × g gedurende 10-15 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Aspirateer het supernatant, resuspendeer in 1 ml RNA-extractiereagens, vortex, vries op droogijs en bewaar bij -80 °C.</li>
		<li>U kunt de monsters ook rechtstreeks in 200 μL van het RNA-extracterende reagens verzamelen. Voeg het RNA-extracterende reagens toe tot 1 ml na het sorteren, met behoud van een verhouding van 1:1 van het reagens tot het gesorteerde monster. Vortex, vries in op droogijs en bewaar bij -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor bulktest voor transposase-toegankelijk chromatine met behulp van sequencing (ATAC-seq), verzamel 50.000-75.000 kernen in PBS in een microcentrifugebuis bedekt met 5% runderserumalbumine (BSA). Vries kernen in op droogijs/-80 °C of gebruik ze onmiddellijk voor ATAC-bereiding.</li>
	<li>Verzamel voor sn RNA-seq of ATAC-seq kernen in 0,04% BSA in PBS (zie ook rubriek 7.2).</li>
</ol>7. Pre-bibliotheek voorbereidingstips
<ol><li>Bulk nucleaire RNA sequencing bibliotheekvoorbereiding<ol>
<li>Na het verzamelen in RNA-extractiereagens, voert u standaard fenol / chloroform RNA-extractie uit door fenol / chloroform toe te voegen en RNA uit de bovenste waterige laag neer te slaan met ethanol, gevolgd door DNase-vertering op buis (15 min).</li>
		<li>Voer RNA-reiniging uit en concentreer in een laatste volume van 15 μL water. OPMERKING: Met behulp van deze methode is het representatieve herstel van 300 mg volwassen cortexmonster ~ 300.000 NeuN + -kernen (15-20 ng / μL totaal RNA na opschoning en concentratie) en ~ 250.000 PAX6 + kernen (10-12 ng / μL totaal RNA na opschoning en concentratie). Deze representatieve opbrengst kan sterk variëren op basis van monsterkwaliteit, gating stringency en RNA-herstel.</li>
		<li>Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) uitvoeren voorafgaand aan sequencing om de verrijking van astrocyten te bevestigen op basis van hoge differentiële expressie van canonieke astrocytenmarkers (GFAP, SOX9), 10-formyltetrahydrofolaatdehydrogenase (ALDH1L1)) en uitputting van neuronale en andere cellijnmarkers (figuur 1G). OPMERKING: Verzameling van de dubbelnegatieve populatie (NeuN-PAX6-) maakt een nauwkeurigere, meerlagige qPCR-kwaliteitscontroleanalyse mogelijk voor de relatieve verrijking van astrocyten (figuur 2H).</li>
		<li>Genereer RNA-seq-bibliotheken met behulp van een kit die wordt aanbevolen voor lage RNA-integriteitswaarden, zoals verwacht van postmortale monsters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Single-nucleus sequencing bibliotheekvoorbereiding<ol>
<li>Voer sn-sequencing uit via een institutionele sequencingkern.</li>
		<li>Gebruik voor verwerking en sequencing op basis van nanofluïdica de aanbevolen concentratie van 1 × 106 cellen/ml in ten minste 60 μL 1x PBS + 0,04% BSA voor single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq) en 3 × 106 cellen/ml in ten minste 20 μL van 1x PBS + 0,04% BSA voor single-nucleus Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (snATAC-seq).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914(2008).</li>
<li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li>
<li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70(2015).</li>
<li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenesis-controlling+factor%2C+Pax6%2C+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li>
<li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li>
<li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6%3A+25th+anniversary+and+more+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li>
<li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li>
<li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue%3A+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li>
<li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+%CE%B1A%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Experimenteel ontwerp volgens het geschetste protocol moet worden afgerond na overweging van verschillende biologische en technische factoren. Beginnende weefselmonsters zijn vers ingevroren, zonder te zijn gefixeerd, en hebben bij voorkeur een kort postmortaal verzamelinterval om het herstel van kernen te maximaliseren. Op basis van ervaring zorgt een PMI van maximaal 24 uur voor adequaat kernherstel; een PMI van 12 uur of minder heeft echter de voorkeur om het herstel van intacte kernen te optimaliseren. Bijkomende fac...

De moleculaire complexiteit van menselijke astrocyten blijft slecht gedefinieerd in primair weefsel, waardoor betere hulpmiddelen nodig zijn voor hun isolatie en karakterisering met hoge resolutie, zowel in gezondheid als ziekte. Scheiding van intacte menselijke neuronen en glia uit hun niche is moeilijk gebleken vanwege de beperkte toegang tot verse hersenweefselmonsters, de sterk onderling verbonden aard van gliale en neuronale processen en onvermijdelijke cellulaire activering tijdens de verwerking, die allemaal de moleculaire karakterisering van deze celtypen ex vivo beperken 1 . Fluorescentie-geactiveerde kernensortering (FANS) is naar voren gekomen als een alternatief voor het sorteren van levende cellen, waardoor de dissociatie en immunotagging van kernpopulaties uit bevroren weefsel mogelijk wordt. In het afgelopen decennium is FANS op grote schaal gebruikt voor het isoleren en moleculair karakteriseren van menselijke neuronale (NeuN +) kernpopulaties in een verscheidenheid aan hersenspecimens en anatomische regio's 1,2,3,4.
Vergelijkbare methoden voor het isoleren van specifieke gliakernen subpopulaties uit de menselijke cortex zijn echter beperkt, wat leidt tot een relatief gebrek aan verfijning in het begrip van astrocytencomplexiteit in zowel normale als zieke weefsels. Hiertoe werd een eerder gepubliceerd protocol aangepast voor het isoleren van menselijke neuronale populaties met behulp van FANS4, en een methode werd gevalideerd om te verrijken voor astrocyten (en voor oligodendrogliale voorlopers) met behulp van een drievoudige antilichaamcombinatie, waarbij astrocyten werden gevangen in zowel rust- als reactieve omstandigheden5. Om specifiek te verrijken voor astrocyten in de NeuN-fractie, werden antilichamen gebruikt tegen een van de twee transcriptiefactoren waarvan bekend is dat ze differentieel tot expressie komen tussen astrocytenpopulaties, PAX6 of SRY-box transcriptiefactor 9 (SOX9) 6,7. PAX6 komt sterk tot expressie tijdens de vroege foetale ontwikkeling binnen radiale glia-achtige voorlopercellen in germinale zones en draagt bij aan zowel neurogenese als gliogenese 8,9,10,11 en aan retinale neuronale specificatie 12. Bij de volwassene is PAX6 differentieel overexpressie in rustende menselijke astrocyten6 en vertoont eiwitco-expressie met gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) in menselijke epilepsieweefselastryoten13.
Dit protocol beschrijft de gelijktijdige isolatie van neocorticale neuronale en astrocyten-verrijkte kernpopulaties door FANS. Vers (niet-gefixeerd) snap-bevroren (d.w.z. vers ingevroren) postmortaal weefsel verzameld uit de volwassen cortex wordt eerst mechanisch en chemisch gedissocieerd. Na lysis en ultracentrifugatie in een sucrosegradiënt worden de cytoplasmatische en extracellulaire componenten weggegooid terwijl de kernen worden behouden. Kernen worden vervolgens gelabeld met fluorescerend geconjugeerde nucleaire antilichamen die overeenkomen met de gewenste doellijnen en gesorteerd met behulp van VENTILATOREN. Volgens deze benadering wordt verrijking van astrocyten aangetoond in de verzamelde PAX6+NeuN-populaties, gevalideerd door zowel een gericht qPCR-paneel als door downstream nucleaire RNA-sequencing.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>70013073</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td><td>Millipore</td><td>MAB377A5MI</td><td>muis anti-NeuN geconjugeerd aan een fluorescerende verbinding AF555 (excitatie, 553 nm; emissie, 568 nm)</td></tr><tr><td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td><td>Millipore</td><td>MABN50A4MI</td><td>muis anti-OLIG2 geconjugeerd aan een fluorescerende verbinding AF488 (excitatie, 499 nm; emissie, 520 nm)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Fisher</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Tellingkamer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110V</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride Anhydraat</td><td>Fisher</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>Celzeveners, 40 µM</td><td>SP Scienceware</td><td>136800040</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Bibliotheek Kit</td><td>Illumina, Nextera</td><td>FC-121&ndash;1030</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Weefselmolen</td><td>WHEATON</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>FACS Sorteerder</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Magnesium Acetaat Tetrahydraat</td><td>Fisher</td><td>M13-500</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td><td>Novus</td><td>NBP234705J</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrator</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontaminatieoplossing</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Gestranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Zoogdier</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635005</td><td>Fragmentatietijd van 2,5 minuten, zoals aanbevolen voor lage RIN RNA-waarden.</td></tr><tr><td>Sucrose, kristal gecertificeerd, ACS, 500 mg</td><td>Fisher</td><td>S5500</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Zwaaiende-Buckerotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1M Oplossing, pH 8,0, Moleculaire Biologie Kwaliteit, Ultrapuur</td><td>Thermo Scientific</td><td>J22638AE</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td>niet-ionogene oppervlakteactieve stof in lysisbuffer</td></tr><tr><td>TRIzol LS Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>reagens voor isolatie van RNA</td></tr><tr><td>Trypan Blauw Oplossing, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter Optima XE-100</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuizen PP 9/16 X 3-1/2</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Gedestilleerde Water (RNAse-, DNAse-vrij)</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>aangeduid als gedestilleerd water</td></tr><tr><td>Ultrapuur EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van volwassen menselijke astrocytenpopulaties uit versgevroren cortex met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernensortering

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

De complexiteit van menselijke astrocyten blijft slecht gedefinieerd in primair menselijk weefsel, waardoor betere hulpmiddelen nodig zijn voor hun isolatie en moleculaire karakterisering. Fluorescentie-geactiveerde kernensortering (FANS) kan worden gebruikt om menselijke neuronale kernen (NeuN +) populaties met succes te isoleren en te bestuderen uit bevroren archiefweefsel, waardoor problemen in verband met het omgaan met vers weefsel worden vermeden. Pogingen om astroglia op dezelfde manier te isoleren van het niet-neuronale (NeuN-) element ontbreken echter. Een recent ontwikkelde en gevalideerde immunotaggingstrategie maakt gebruik van drie transcriptiefactorantistoffen om tegelijkertijd verrijkte neuronale (NeuN+), astrocyten (gepaard boxeiwit 6 (PAX6)+NeuN-) en oligodendrocytenvoorloper (OLIG2+NeuN-) kernpopulaties te isoleren uit niet-zieke, verse (niet-gefixeerde) snap-bevroren postmortaal humaan humaan humaan neocortexweefsel.
Deze techniek bleek nuttig te zijn voor de karakterisering van celtypespecifieke transcriptoomveranderingen in primaire pathologische epilepsie neocortex. Transcriptomische analyses bevestigden dat PAX6+NeuN-gesorteerde populaties robuust verrijkt zijn voor pan-astrocytenmarkers en astrocyten vangen in zowel rust- als reactieve omstandigheden. Dit artikel beschrijft de FANS-methodologie voor de isolatie van met astrocyten verrijkte kernpopulaties uit vers ingevroren menselijke cortex, inclusief weefseldissociatie in single-nucleus (sn) suspensie; immunotagging van kernen met anti-NeuN en anti-PAX6 fluorescerend geconjugeerde antilichamen; FANS gating strategieën en kwaliteitscontrole statistieken voor het optimaliseren van gevoeligheid en specificiteit tijdens het sorteren en voor het bevestigen van astrocytenverrijking; en aanbevolen inkoop voor downstream transcriptoom- en chromatine-toegankelijkheidssequencing bij bulk- of sn-resolutie. Dit protocol is van toepassing op niet-necrotische, vers ingevroren, menselijke corticale monsters met verschillende pathologieën en aanbevolen postmortale weefselverzameling binnen 24 uur.

Kernen werden verzameld uit vers (niet-gefixeerd) snap-bevroren temporale neocortexweefsel met een postmortale verzameltijd van 12 uur. Na weefseldissociatie in kernensuspensie werden monsters geïncubeerd met antilichamen tegen NeuN, PAX6 en OLIG2 en gesorteerd volgens de gating in figuur 1 en figuur 2. Kernen werden verzameld uit NeuN+, PAX6+NeuN-, en OLIG2+NeuN- gesorteerde populaties (figuur 1E, F en <strong clas...

We hebben een methode ontwikkeld die menselijke astrocytenpopulaties verrijkt en isoleert van vers ingevroren weefsel voor gebruik in downstream moleculaire analyses.

Isolatie van volwassen menselijke astrocytenpopulaties uit versgevroren cortex met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernensortering

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Dit protocol kan wetenschappers helpen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de moleculaire functie van menselijke astrocyten in hun oorspronkelijke niche. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de isolatie en verrijking van een specifiek celtype mogelijk maakt, volwassen astrocyten uit bulk menselijke hersenweefselmonsters met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernensortering. Deze methodologie kan worden toegepast op het isoleren van andere celtypen van de menselijke neocortex, zoals neuronen en oligodendrocytenvoorlopercellen met behulp van andere geschikte fluorescerend-geconjugeerde antilichamen.Begin met het ontleden van ongeveer 200 tot 400 milligram weefsel uit een vers bevroren menselijk volwassen cortexweefselmonster. Plaats het weefsel in een zeven milliliter glazen weefseldouncer met vier milliliter ijskoude lysisbuffer op ijs en maal het weefsel ongeveer 50 keer. Breng het homogenaat over in een 12-milliliter ultracentrifuge polypropyleen buis.Gebruik een pipet van vijf milliliter om 6,5 milliliter ijskoude sucrosebuffer toe te voegen aan de bodem van de ultracentrifugebuis zonder de interface tussen de sucrose en het weefselhomogenaat te v

isolation-adult-human-astrocyte-populations-from-fresh-frozen-cortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, we describe the method to obtain a pure preparation of astrocytes from newly born mice.

Astrocyte Isolation: A Method to Obtain Pure Preparation of Mouse Cortical Astrocytes

The video demonstrates a simple method to culture murine astrocytes in isolation from other brain cells. During culturing, by using astrocyte-specific media and inhibiting the adherence of non-astrocytic cells, the method selectively cultures astrocytes. These cultured astrocytes exhibit stellate morphology with fine processes.

A Simple Technique to Isolate and Culture Murine Astrocytes

This video demonstrates the procedure for isolating and sorting nuclei from fresh-frozen human brain tissue using fluorescence-activated nuclei sorting (FANS), which enables the study of different cell populations for various neurological applications.

Isolating Cell Populations from Brain Tissue Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Astrocyten zijn erkend als veelzijdige cellen die deelnemen in de fundamentele biologische processen die essentieel zijn voor de normale ontwikkeling van de hersenen en functies binnen het centraal zenuwstelsel repareren. Hier presenteren we een snelle procedure voor pure muis astrocyten culturen te verkrijgen om de biologie van deze belangrijke klasse van het centrale zenuwstelsel cellen te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Het AWESAM protocol beschreven hier is optimaal voor het kweken van lymfkliertest astrocyten los van andere hersencellen in een snelle, eenvoudige en goedkope manier. AWESAM astrocyten vertonen spontane Ca2 + signalering, morfologie en gene expressieprofielen vergelijkbaar met de astrocyten in vivo.

Kweken In Vivo-graag lymfkliertest astrocyten met behulp van de snelle, eenvoudige en goedkope AWESAM-Protocol

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om sterk verrijkte culturen van astrocyten te genereren die zijn afgeleid van verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van postnatale muizen en hun directe omzetting in functionele neuronen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Isolatie en directe neuronale herprogrammering van muisastryoten

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

Leer astrocyten isoleren uit versgevroren menselijke hersencortex met FANS-techniek. Deze methode levert hoogzuivere celpopulaties voor transcriptoom- en chromatintoegankelijkheidsanalyses.

Isolatie van volwassen menselijke astrocytenpopulaties uit versgevroren cortex met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernensortering (Video) | JoVE Journal

Isolatie van volwassen menselijke astrocytenpopulaties uit versgevroren cortex met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernensortering

Meer video's verkennen