Onderzoek naar ^m6A en ^m5C epitranscriptomen bij virale infectie: een voorbeeld met HIV

Hallo, in deze video laten we je zien hoe je de m6A- en m5C-epitranscriptomen kunt verkennen bij virale infectie. Om het experiment te starten, heb je 50 miljoen cellen nodig voor de niet-geïnfecteerden en 50 miljoen voor de geïnfecteerde aandoening. Om bij analyse een dataset van hoge kwaliteit te verkrijgen, moet u een universele infectie bereiken.

Hier infecteren we deze cellen met een hiv-gebaseerde vector en meten we de viraal gecodeerde GFP door FACS. In dit geval hadden we 80% van de geïnfecteerde cellen en gingen we verder met de workflow, beginnend met totale RNA-extractie. Dus verdeelden we de cellen in aliquots van elk 10 miljoen en lyseerden ze in 1 ml Trizol.

Vervolgens voegden we 200 microliter chloroform toe aan het cellysaat en mengden we door inversie. Op dit punt laten we het lysaat drie minuten bij kamertemperatuur zitten en centrifugeren we vervolgens alle monsters op hoge snelheid gedurende 15 minuten bij vier graden. Je verwacht een fasescheiding in drie verschillende fasen, zoals hier wordt getoond.

RNA zit in de bovenste fase, dus breng de waterige fase voorzichtig over in een nieuwe buis door erop te letten dat de organische laag niet wordt overgedragen. Voeg op dit punt 0,5 ml isopropanol toe aan de waterige fase en meng voorzichtig door inversie. Monsters kunnen vervolgens een uur bij 80 graden worden geïncubeerd om RNA-neerslag te garanderen.

Bij centrifugeren op hoge snelheid zou je een mooie RNA-pellet moeten kunnen zien zoals hier te zien is. Gooi het supernatant voorzichtig weg door inversie of door pipetteren, let op het niet verstoren van de pellet. Was vervolgens de RNA-pellet met één ml 75% ethanol van moleculaire kwaliteit.

En vortex het monster kort. Zorg er bij het centrifugeren voor dat je een mooie witte RNA-pellet terugkrijgt. Gooi het supernatant weg en laat de RNA-pellet 15 minuten drogen bij kamertemperatuur.

Resuspend elke pellet in 20 microliter water en bundel alle monsters uit dezelfde toestand samen. Totaal RNA is nu klaar voor mRNA-isolatie door poly-A-selectie. Bereid voor elk monster van 75 microgram RNA 200 microliter oligo-DT magnetische kralen en was ze in één ml bindingsbuffer.

Plaats de buis op een magnetische standaard en laat de kralen zich tijdens één mix aan de magneet binden. Gooi het supernatant weg en herhaal de procedure voor een tweede wasbeurt. Verwijder vervolgens de kralen uit de magnetische standaards en resuspend ze voorzichtig in 100 microliter bindingsbuffer.

Bereid op dit punt het RNA-monster voor door ze te delen in 75 microgram RNA per aliquot geresuspendeerd in 100 microliter water. Voeg 100 microliter bindingsbuffer toe en incubeer gedurende twee minuten op 65 graden. Draai vervolgens de monsters naar beneden en incubeer op ijs.

Voeg vervolgens 100 microliter gewassen magnetische kralen toe aan elk RNA-monster en laat de binding op een roterend wiel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur toe. Plaats de buis na incubatie terug in een magnetisch rek en laat ze een minuut incuberen. Herstel vervolgens het supernatant in een verse buis en houd het opzij voor een tweede isolatieronde.

Was de kralen twee keer met 200 microliter wasbuffer en ga dan verder met elutie. Om poly-A geselecteerd RNA uit de magnetische kralen te elueren, voegt u 20 microliter ijskoude TRIS HCl toe aan elk monster en pipetteer u zorgvuldig. Incubeer vervolgens je monsters op 80 graden gedurende twee minuten om het RNA van de kralen vrij te maken.

Breng het supernatant met poly-A geselecteerd RNA over naar een nieuwe buis, waarbij u voorzichtig bent met het vermijden van overdracht van kralen. De elutiestap en de isolatiestap moeten tweemaal worden herhaald om de mRNA-opbrengst te verhogen. mRNA is nu klaar om de meRIP-Seq-pijplijn binnen te gaan bij de fragmentatiestap of direct naar bisulfietconversie te gaan.

De eerste stap om de meRIP-Seq-pijplijn binnen te gaan, bestaat uit mRNA-fragmentatie. Hiervoor heb je vijf microgram mRNA nodig, verdeeld in aliquots van 18 microliter in buisjes van 0,2 ml. Om consistente gegevens te garanderen, is het van cruciaal belang om snel en met slechts weinig monsters op dat moment te werken.

Voor dit experiment is fragmentatie geoptimaliseerd om fragmenten van een grootte tussen 115 en 200 nucleotiden te verkrijgen. Voeg vervolgens twee microliter fragmentatiereagens toe aan elke buis met 18 microliter mRNA, waarbij u voorzichtig bent bij het afzetten van de druppel op de buiswand. Draai alle monsters naar beneden om tegelijkertijd contact tussen het reagens en het RNA mogelijk te maken en incubateer gedurende 15 minuten op 70 graden.

Zodra de incubatie voorbij is, stopt u de reactie door twee microliter van 0,5 M EDTA toe te voegen. Op dit punt kunt u uw gefragmenteerde mRNA zuiveren met de methode van uw keuze en doorgaan met een RNA-kwaliteitscontrole door fragmentanalysator. Deze stap is optioneel, maar hiermee kunt u de grootte van het fragment beoordelen voordat RNA-neerslag wordt ingeschakeld.

Zoals je hier in de vierde baan kunt zien, verkrijgen we voor beide ons monsterfragment van ongeveer 150 nucleotide elk. Daarna zijn we verder gegaan met meRIP-Seq. De eerste stap bestaat uit paar A / G magnetische kralen met anti-m6A-antilichamen of IgG-controles.

Breng voor elk reactieplan 25 microliter magnetische kralen over in een nieuwe buis. Houd er rekening mee dat u ten minste één m6A-specifieke voorwaarde en één controlevoorwaarde nodig heeft. Was elke 25 microliter kralen met 250 microliter IP-buffer.

Reuspend de kralen voorzichtig door op en neer te pipetteren en plaats de buis gedurende één minuut op het magnetische rek om de parelscheiding mogelijk te maken. Verwijder en gooi het supernatant weg, let op het niet aanzuigen van de magnetische kralen en herhaal de wasstap eenmaal. Resuspend de magnetische kralen vervolgens in 100 microliter IP-buffer per elke 25 microliter van het oorspronkelijke volume kralen.

Bereid en label één buis per voorwaarde. In ons geval hebben we twee buizen voor de geïnfecteerde aandoening, een voor m6A en een voor IgG-controle en twee buizen voor de niet-geïnfecteerde aandoening. Voeg vervolgens 100 microliter gewassen kralen toe aan elke buis.

Kralen zijn nu klaar om te worden gekoppeld aan specifieke antilichamen of IgG-controles. Voeg vijf microgram specifiek anti-m6A-antilichaam of anti-IgG-controleantilichaam toe aan elke buis met 100 microliter gewassen magnetische kralen. Laat antilichaam-kralenconjugatie toe door de buis 30 minuten op een roterend wiel te incuberen.

Ga ondertussen verder met de monstervoorbereiding. Voor elke geplande toestand, m6A-specifieke of IgG-controle, is uw uitgangsmateriaal 2,5 microgram gefragmenteerd mRNA geresuspendeerd 100 microliter water. Om een eindreactievolume van 500 microliter te hebben, voegt u 295 microliter water toe aan elk monster.

Voeg vervolgens vijf microliter RNAaseremmer geconcentreerd op 40 eenheid per microliter toe voor een totale hoeveelheid van 200 eenheden per monster en meng voorzichtig. Voeg ten slotte 100 microliter 5X geconcentreerde IP-buffer toe aan elke buis. Monsters zijn nu klaar voor de immuunprecipitatiereactie.

Haal de magnetische kralen in combinatie met antilichamen uit het roterende wiel en draai ze naar beneden. Voeg vervolgens 500 microliter van de eerder bereide monsters toe aan elke 100 microliter kralen in combinatie met de specifieke antilichamen. Meng voorzichtig door meerdere keren op en neer te pipetteren om de kralen volledig opnieuw te verdelen.

Incubeer ze of uw meRIP-reactie op een roterend wiel bij vier graden gedurende twee uur. Zodra de incubatie voorbij is, draai je elke buis naar beneden en plaats je ze gedurende één minuut op een magnetisch rek om de kraalscheiding mogelijk te maken. Verwijder vervolgens de ongebonden fractie en plaats deze op een verse buis en bewaar deze indien nodig voor verdere analyse.

Verwijder de magneet uit het rek en voer alle monsters opnieuw op in 500 microliter IP-buffer. Resuspend elk monster zorgvuldig door op en neer te pipetteren. Plaats de magneet op het rek, incubeer gedurende één minuut en verwijder vervolgens voorzichtig het bovennatuurlijke middel.

Herhaal de was twee keer en ga dan verder met de elutie. Bereid voor elk paar monsters, m6A-specifiek en controle, 225 microliter elutiebuffer met 20 millimolair gezuiverd m6A. Voeg vervolgens 100 microliter elutiebuffer per monster toe.

Incubeer alle monsters een uur bij vier graden op een rocker. Verzamel vervolgens alle m6A verrijkte RNA-monsters in een verse buis en ga verder met een tweede ronde elutie. Zuiver het m6A verrijkte RNA met de methode van uw keuze En dan zijn op dit punt monsters klaar voor bibliotheekvoorbereiding en sequencing.

Om de m5C-modificatie te onderzoeken, gebruiken we bisulfietconversie. Start het experiment met 500 nanogram poly-geïdenyleerd RNA. Hoewel optioneel, zal het toevoegen aan uw monster van 500 picogram van poly-A uitgeput RNA om ribosomale representatie en 0,5 microliter commercieel beschikbare synthetische sequentie te garanderen, u in staat stellen om de bisulfietconversiesnelheid bij sequencing te beoordelen.

Pas uw monster aan tot een eindvolume van 20 microliter in water en voeg vervolgens 130 microliter RNA-conversiereagens toe aan elk monster. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en draai alle monsters naar beneden om ervoor te zorgen dat er geen druppels meer aan de zijkant van de buizen zitten. Incubeer alle monsters in een PCR-machine gedurende drie cycli van denaturatie 70 graden gedurende vijf minuten en bisulfietconversie bij 54 graden gedurende 45 minuten.

Voer in-kolom deaminering uit door direct op een lege kolom 250 microliter RNA-bindingsbuffer, 150 microliter van uw bisulfiet geconverteerd monster toe te voegen. Meng het monster door op en neer te pipetteren, maar let op dat u de kolomfilters niet aanraakt. Voeg 400 microliter 95-100% ethanol toe aan het monster RNA-bindingsbuffermengsel direct in de kolom.

Sluit de dop en meng onmiddellijk door inversie. Draai uw monster gedurende 30 seconden en gooi de doorstroming weg. Was uw kolom met wasbuffer en voeg vervolgens 200 microliter ontzwavelingsoplossing toe aan het midden van elke kolom.

Incubeer al uw monster gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Draai het monster gedurende 30 seconden en ga dan verder met twee wasrondes. Voeg 400 microliter wasbuffer toe aan elk monster, centrifugeer gedurende 30 seconden op volle snelheid en gooi de doorstroming weg.

Plaats de kolom in een nieuwe lege buis en eluteer het bisulfiet omgezete RNA in 20 microliter water. Controleer de efficiëntie van bisulfietconversie met RT-qPCR en ga vervolgens verder met bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Na bio-informatica-analyse, hier is een voorbeeld van resultaten die u kunt verkrijgen met deze workflow.

Hier vergelijken we het epitranscriptoom van HIV-geïnfecteerde cellen versus niet-geïnfecteerde cellen. 24 uur na infectie. In het A-paneel kunt u de resultaten zien die we verkrijgen bij het verkennen van het m6A-epitranscriptoom.

In deze grafiek plotten we de m6A verrijkte reads op meRIP-Seq analyse. We kunnen mooi zien dat een zinken vinger 24 uur na infectie gehypermethyleerd is. We voerden hetzelfde type analyse uit voor het m5C-epitranscriptoomonderzoek in panel B.In deze grafiek wordt elke niet-gemethyleerde cytosine in rood weergegeven, terwijl het aandeel cytosine dat m5C-gemethyleerd is, in blauw wordt weergegeven.

Zoals je kunt zien, PHLPP1, alle drie cytosines die 24 uur na hiv-infectie hyper-gemethyleerd zijn. Over het algemeen maakt deze workflow het mogelijk om zowel het M6A- als m5C-epitranscriptoom van geïnfecteerde cellen te onderzoeken en kan het ook als zodanig op virale deeltjes worden toegepast. Inzicht in virale infecties die in staat zijn om het epitranscriptomische landschap van de gastheer te wijzigen, geeft ons toegang tot een nieuwe laag van regulatie.

Het onderzoek van differentiële gemethyleerde transcripten bij virale infectie zal natuurlijk een waardevolle bron zijn voor nieuwe therapeutische interventies. Op de onderstaande link vindt u onze open access bron voor het onderzoek van differentieel gemethyleerd transcript op HIV-infectie in de loop van de tijd.