Name: Generatie van 3D-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer een protocol voor de differentiatie van hiPSCs naar 3D longorganoïden met stapsgewijze inductie van endoderm en longvoorlopercellen. Deze methode modelleert menselijke longontwikkeling en ziekte in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Dit studieprotocol werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van UCSD's Human Research Protections Program (181180).
1. Definitieve endoderm-inductie uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (dag 1 - 3)
<ol><li>Ontdooi langzaam groeifactor gereduceerd (GFR)-keldermembraan (BM) matrixmedium op ijs 30 minuten voor gebruik. Verdun in koud DMEM/F12 mengsel het GFR BM-matrixmedium 1:1 zodanig dat het 50% van dit medium uitmaakt. Plaats P1000 pipetpunten in de vriezer om te koelen voor gebruik.</li>
	<li>Bestrijk elke put van een 12-putplaat met 500 μL 50% GFR-keldermembraanmatrixmedium bereid in ijskoude DMEM /F12. Zodra het gewenste aantal putten is gecoat, verwijdert u overtollig mediummengsel en/of bubbels uit putten en plaatst u de plaat op ijs of koelkast bij 4 °C gedurende 20 minuten om uit te zetten. Verplaats vervolgens de plaat 's nachts naar de couveuse bij 37 °C om te gelen en te drogen.</li>
	<li>Zodra hiPSC's 70-90% confluentie bereiken, voegt u 10 μM Rho-geassocieerde kinase (ROCK) -remmer Y-27632 toe een uur voorafgaand aan de dissociatie. Zuig de media af en was eenmaal met Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Dissocieer hiPSC's door cellosperementmedium toe te voegen (0,5 ml / put van een 12-well plaat) en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2-incubator .</li>
	<li>Verwijder platen uit de incubator en voeg 0,5 ml /12-put stamceldoorgangsmedium (tabel 1) toe aan de putten; triturate cellen voorzichtig met behulp van een P1000-tip om eencellige suspensie te verkrijgen. Breng gedissocieerde cellen over in een conische centrifugebuis van 15 ml; centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g.</li>
	<li>Zuig het medium af en resuspend de celkorrel met 1 ml mTeSR Plus-media aangevuld met 10 μM ROCK-remmer (Y-27632). Voer een celtelling uit. Voeg 2,0 x 105 hiPSC's toe in 1 ml mTeSR aangevuld met ROCK-inhibitor Y-27632 per put van een 12-well GFR-basement membraan medium gecoate plaat. Incubeer 's nachts bij 37 °C. OPMERKING: Het aantal zaaicellen moet per cellijn worden geoptimaliseerd. 24 uur na het beplaten moeten putten 50% -70% confluent zijn.</li>
	<li>Aspirateer op dag 1 de mTeSR Plus en voeg definitive endoderm (DE) inductiemedia (tabel 1) toe, aangevuld met 100 ng/ml humaan activine A en 5 μM GSK3β-remmer/Wnt-activator CHIR99021. OPMERKING: DE media met GSK3β-remmer/Wnt-activator CHIR99021 moeten binnen 20-24 uur na dag 1 DE-inductie worden verwijderd voor een succesvolle differentiatie.</li>
	<li>Op dag 2 en dag 3, overschakelen op DE-inductiemedia aangevuld met 100 ng / ml activine A alleen. OPMERKING: DE-differentiatie mag in totaal niet langer zijn dan 72 uur, anders neemt de werkzaamheid af. Op dag 4, als grote celafsterving wordt waargenomen, verlaagt u de totale blootstellingstijd van DE media met 6-12 uur.</li>
	<li>Om de DE-efficiëntie te analyseren, bevestigt u meer dan 90% CXCR4- en/of cKit-expressie via flowcytometrie of immunofluorescentieanalyse van FOXA2 en/of SOX17 (figuur 2a).</li>
</ol>2. Anterior foregut endoderm (AFE) inductie (Dag 4 - 6)
<ol><li>Verander op dag 4 de media in serumvrij basaal medium (SFBM) (tabel 1) aangevuld met 10 μM SB431542 en 2 μM dorsomorfine voor AFE-inductie. Verander AFE-media dagelijks gedurende 3 dagen (dag 4, dag 5 en dag 6).</li>
	<li>Om de AFE-efficiëntie te analyseren, bevestigt u de robuuste expressie van SOX2, TBX1 en FOXA2 via immunofluorescentiekleuring (figuur 2b).</li>
</ol>3. Longvoorlopercel (LPC) differentiatie (Dag 7 - 16)
<ol><li>Ontdooi op dag 7 het GFR-keldermembraanmatrixmedium op ijs. Zuig de AFE media af en was goed met 1x PBS. Voeg 1 ml celloslatingsoplossing toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 1 ml blusmedium (2% FBS in DMEM/F12) toe aan de putjes met celloslatingsoplossing. Houd cellen als aggregaten door zachtjes op en neer te pipetteren. Zorg ervoor dat alle cellen worden losgemaakt en overgebracht in een conische centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in quenching medium aangevuld met 10 ng / ml humaan recombinant botmorfogene eiwit-4 (BMP4), 0,1 μM all-trans retinoïnezuur (RA), 3 μM GSK3β-remmer / Wnt-activator CHIR99021 en 10 μM rock inhibitor Y-27632.</li>
	<li>Voer een celtelling uit. Voeg 2,5 x 105 cellen toe aan 100 μL koud GFR-keldermembraanmatrixmedium, meng goed en plaats de druppel in een put van een 12-putplaat. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 30-60 minuten om het medium te laten polymeriseren. Voeg 1 ml LPC-media aangevuld met 10 μM ROCK-remmer Y-27632 per put toe om ervoor te zorgen dat de mediumdruppel volledig wordt ondergedompeld en incamineer 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Verander op dag 8, 24 uur na LPC-inductie, het LPC-medium om ROCK-remmer Y-27632 te verwijderen. Vervang het LPC-medium om de dag gedurende in totaal 9-11 dagen. OPMERKING: Als het medium binnen 24 uur geel wordt, verander dan elke dag van medium.</li>
	<li>Om de LPC-efficiëntie te analyseren, bevestigt u de robuuste expressie van de intracellulaire transcriptiefactor NKX2-1 of voert u flowcytometrie uit voor oppervlaktemarkers CD47hi/CD26low15 of CPM18 (figuur 2c). Grofweg moeten de LPC-sferoïden rond en transparant zijn (figuur 2c). OPMERKING: Ga niet verder met longorganoïde differentiatie als de efficiëntie van NKX2-1 lager is dan 30%.</li>
</ol>4.3D long organoïde inductie (dag 16 - 22)
<ol><li>Op dag 17 ontdooi GFR-keldermembraanmatrixmedium op ijs. Aspirateer het LPC-inductiemedium. Voeg vervolgens 2 μg/ml dispase (1 ml) toe aan de put en resuspend het medium/dispase mengsel met een P1000 pipet. Incubeer bij 37 °C gedurende 15 min. Trituraer het mengsel opnieuw en incubeer bij 37 °C gedurende nog eens 15 minuten.</li>
	<li>Breng de dispase en cellen over in een conische centrifugebuis van 15 ml. Gebruik gekoeld PBS (2-3 ml) om de put te wassen en het dispase/celmengsel opnieuw te suspenderen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 400 x g. Verwijder het supernatant handmatig en zorg ervoor dat de medium/celkorrellaag niet wordt losgemaakt. Herhaal de gekoelde PBS-was en centrifugeer de conische centrifugebuis nog eens 5 minuten bij 400 x g.</li>
	<li>Verwijder het supernatant handmatig en voeg vervolgens 2 ml dissociatieoplossing op basis van trypsine toe aan de conische centrifugebuis. Incubeer bij 37 °C gedurende 12 min.</li>
	<li>Na incubatie resuspend cellen met een P1000 pipetpunt. Voeg vervolgens een gelijk volume blusmedia toe aan de conische centrifugebuis en draai gedurende 5 minuten op 400 x g . Aspirateer de supernatant- en resuspendcellen in blusmedium + 10 μM ROCK-remmer Y-27632. OPMERKING: Succesvolle longorganoïde inductie treedt op wanneer cellen zijn ingebed als aggregaten, niet als afzonderlijke cellen, die het pipetteren dienovereenkomstig aanpassen.</li>
	<li>Voer een celtelling uit. Bereken het volume dat nodig is om 5,0-8,0 x 104 cellen per put te verkrijgen. Aliquot de LPC-cel aggregeert in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g. Verwijder overtollig supernatant en zorg ervoor dat u de celkorrel niet roert. Laat slechts 10 μL restmedia achter.</li>
	<li>Suspensie de celkorrel opnieuw in 200 μL koud GFR-keldermembraanmatrixmedium en voeg toe aan celkweekmembraaninzetstukken (6,5 mm diameter, 0,4 μm porie, polyestermembraan). Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 30-60 minuten om het GFR-keldermembraanmatrixmedium te laten polymeriseren.</li>
	<li>Voeg 1 ml 3D-organoïde inductiemedium (tabel 1) aangevuld met fibroblastgroeifactor-7 (FGF7) (10 ng / ml), FGF10 (10 ng / ml), GSK3β-remmer / Wnt-activator CHIR (3 μM), epidermale groeifactor (EGF) (10 ng / ml) en 10 μM ROCK-remmer Y-27632 toe aan de basolaterale kamer van het membraaninzetstuk. Vervang het medium om de andere dag gedurende 6 dagen.</li>
</ol>5.3D Long organoïde vertakking (Dag 23 - 28)
<ol><li>Op dag 23 verandering naar 3D-vertakkingsmedium (tabel 1) aangevuld met FGF7 (10 ng / ml), FGF10 (10 ng / ml), GSK3β-remmer / Wnt-activator CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng / ml) en vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) / placentale groeifactor (PlGF) (10 ng / ml). Vervang het medium om de andere dag gedurende 6 dagen. OPMERKING: Op dag 6 van 3D-vertakkingsdifferentiatie zouden er meerdere vertakkende organoïden moeten zijn (figuur 2).</li>
</ol>6.3D long organoïde rijping (dag 29 - 34)
<ol><li>Op dag 29, verander naar 3D-rijpingsmedium (tabel 1), wat hetzelfde is als 3D-vertakkingsmedium, maar met de toevoeging van dexamethason (50 nM), cAMP (100 μM) en en 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), een fosfodiësteraseremmer die ook isobutylxanthine (100 μM) wordt genoemd. Vervang het medium om de andere dag gedurende 6 dagen. OPMERKING: Binnen 24 uur na 3D-rijping moeten de vertakkende organoïden uitzetten en veranderen in transparante bollen.</li>
</ol>7.3D Immunocytochemie van longorganoïden
<ol><li>Voor 3D-organoïde analyse van de hele long, fixeer GFR-keldermembraanmatrixmedium in de membraaninzetstukken met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 1 uur bij 4 °C. Insluiten in paraffine en monteren op dia's volgens standaard gepubliceerde protocollen.</li>
	<li>Voer antigeen ophalen uit voorafgaand aan het kleuren. Luchtwegmarkers omvatten KRT5, MUC5AC en SCGB3A2. Alveolaire markers omvatten SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 en HOPX (figuur 3).</li>
</ol>8. Verwijdering van hele longorganoïden uit GFR-keldermembraanmatrixmedium voor passage, FACS of cryopreservatie
<ol><li>Om de organoïden te distantiëren van het GFR-keldermembraanmatrixmedium, verwijdert u media uit de basale kamer en voegt u 2 μg / ml dispase (1 ml) toe aan de apicale kamer.</li>
	<li>Trituraleer het medium /dispase mengsel voorzichtig met een P1000 pipet en plaats gedurende 15 minuten in de couveuse. Trituraleer het mengsel opnieuw voorzichtig en incubeer nog eens 15 minuten.</li>
	<li>Voeg 1 ml gekoeld PBS (4 °C) toe en breng organoïden met het matrixmedium over in een conische centrifugebuis van 15 ml. Draai 5 min. op 400 x g . Verwijder het bovennatuurlijke middel voorzichtig, om de celkorrel niet te verstoren.</li>
	<li>Was nogmaals met 1 ml gekoelde PBS en draai gedurende 5 minuten op 400 x g . Verwijder het supernatant voorzichtig, om het medium/celmengsel niet te verstoren.</li>
	<li>Voeg 1 ml celloslatingsoplossing toe aan de conische centrifugebuis, triturateer voorzichtig het GFR-Basement membraanmatrixmedium/celmengsel. Plaats in de incubator gedurende 12 minuten voor passaging cellen als aggregaten of voor cryopreservatie), of 20 minuten voor eencellige suspensie.</li>
	<li>Voeg een gelijk volume blusmedia toe en draai gedurende 5 minuten op 400 x g . Resuspend in blusmedium + 10 μM ROCK-remmer Y-27632. OPMERKING: Bij deze stap mag geen resterend keldermembraanmedium in de buis worden gezien. Als het resterende medium overblijft, herhaalt u stap 8.5 en 8.6.</li>
	<li>Voer een celtelling uit. Bereken het volume dat nodig is voor downstream-toepassingen.</li>
</ol>

<ol><li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+development+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li>
<li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li>
<li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+and+exogenous+stem%2Fprogenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36(2016).</li>
<li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+crosstalk+in+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li>
<li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li>
<li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li>
<li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li>
<li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li>
<li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+10+%28FGF10%29+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li>
<li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Sonic+hedgehog+%28Shh%29+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li>
<li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li>
<li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51(2018).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal%2C+spatial%2C+and+phenotypical+changes+of+PDGFR%CE%B1+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li>
<li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+on+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li>
<li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li>
<li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li>
<li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450(2019).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTII-280%2C+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li>
<li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2%2B+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li>
<li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).</li>
<li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li>
<li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells%3A+universal+donor+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De succesvolle differentiatie van 3D-organoïden voor de hele long (WLO) is gebaseerd op een meerstapsprotocol van 6 weken met aandacht voor detail, inclusief tijd van blootstelling aan groeifactoren en kleine moleculen, cellulaire dichtheid na passaging en de kwaliteit van hiPSC's. Zie tabel 2 voor probleemoplossing. hiPSC's moeten ongeveer 70% -80% confluent zijn, met minder dan 5% spontane differentiatie voorafgaand aan dissociatie. Dit protocol vraagt om "mTeSR plus" medium; gewoon "mTeSR" medium is e...

De long is een gecompliceerd, heterogeen, dynamisch orgaan dat zich ontwikkelt in zes verschillende stadia - embryonale, pseudoglandulaire, canalculaire, sacculaire, alveolaire en microvasculaire rijping1,2. De laatste twee fasen treden pre- en postnataal op in de menselijke ontwikkeling, terwijl de eerste vier stadia uitsluitend plaatsvinden tijdens de foetale ontwikkeling, tenzij vroeggeboorte optreedt3. De embryonale fase begint in de endodermale kiemlaag en eindigt met het ontluiken van de luchtpijp en longknoppen. Longontwikkeling vindt gedeeltelijk plaats via signalering tussen de epitheel- en mesenchymale cellen4. Deze interacties resulteren in longvertakking, proliferatie, cellulaire lotbepaling en cellulaire differentiatie van de zich ontwikkelende long. De long is verdeeld in geleidende zones (luchtpijp naar de terminale bronchiolen) en ademhalingszones (respiratoire bronchiolen naar de longblaasjes). Elke zone bevat unieke epitheelceltypen; inclusief basale, secretoire, trilhaar-, borstel-, neuro-endocriene en ionocytcellen in de geleidende luchtwegen5, gevolgd door alveolaire type I- en II-cellen in het respiratoire epitheel6. Er is nog veel onbekend over de ontwikkeling en reactie op letsel van de verschillende celtypen. iPSC-afgeleide longorganoïde modellen maken de studie mogelijk van mechanismen die de ontwikkeling van menselijke longen stimuleren, de effecten van genetische mutaties op de longfunctie en de respons van zowel het epitheel als het mesenchym op infectieuze agentia zonder de noodzaak van primair menselijk longweefsel.
Markers die overeenkomen met de verschillende stadia van embryonale differentiatie omvatten CXCR4, cKit, FOXA2 en SOX17 voor definitief endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 en SOX2 voor anterieur foregut endoderm (AFE)8 en NKX2-1 voor vroege longvoorlopercellen9. Bij embryonale longontwikkeling verdeelt het voorgut zich in de dorsale slokdarm en ventrale luchtpijp. De knoppen van de rechter- en linkerlong verschijnen als twee onafhankelijke uitstulpingen rond de tracheale knop10. Tijdens vertakkende morfogenese produceert het mesenchym rond het epitheel elastisch weefsel, gladde spieren, kraakbeen en vasculatuur11. De interactie tussen het epitheel en mesenchym is essentieel voor een normale longontwikkeling. Dit omvat de afscheiding van FGF1012 door het mesenchym en SHH13 geproduceerd door het epitheel.
Hier beschrijven we een protocol voor de gerichte differentiatie van hiPSC's in driedimensionale (3D) hele longorganoïden (WLO). Hoewel er vergelijkbare benaderingen zijn die isolatie van longvoorlopercellen omvatten via sortering in het LPC-stadium om alveolaire-achtige 14,15 (distale) organoïden of airway16 (proximale) organoïden te maken, of ventraal-anterieure foregut-sferoïden te genereren om menselijke longorganoïden te maken die alveolaire cel- en mesenchymale markers tot expressie brengen en knoptipvoorloperorganoïden17 , is de kracht van deze methode de opname van zowel longepitheel- als mesenchymale celtypen om longvertakkingsmorfogenese, rijping en expansie in vitro te patroon en te orkestreren.
Dit protocol maakt gebruik van kleine moleculen en groeifactoren om de differentiatie van pluripotente stamcellen te sturen door middel van definitief endoderm, anterieur voorgut endoderm en longvoorlopercellen. Deze cellen worden vervolgens geïnduceerd in 3D-organoïden voor de hele long door middel van belangrijke ontwikkelingsstappen, waaronder vertakking en rijping. De samenvatting van het differentiatieprotocol is weergegeven in figuur 1a met representatieve brightfieldbeelden van endodermale en organoïde differentiatie in figuur 1b. Figuur 1c,d toont de genexpressiedetails van endodermale differentiatie en de genexpressie van zowel de proximale als distale populaties van longepitheelcellen na voltooiing van de differentiatie.

<table><tbody><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 well plates</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12-well inserts, 0.4um, translucid</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>ascorbinezuur</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 zonder retinoïnezuur</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7,5% oplossing</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&rsquo;s Modified Dulbecco&rsquo;s Medium (IMDM) + Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/case)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>Groeifactoren/Kleine moleculen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activine A</td><td>R&amp;D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>All-trans retinoïnezuur (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R&amp;D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R&amp;D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF/PIGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>297-VP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Primaire antilichamen</td><td></td><td></td><td>Verdunningssnelheid</td></tr><tr><td>CXCR4-PE</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-398703</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.145833333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0.215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0.25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (volwassen)</td><td>7 Hills</td><td>48604</td><td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td></tr><tr><td>SPC (volwassen)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td></tr></tbody></table>

generatie van 3d-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

De ontwikkeling en ziekte van menselijke longen is moeilijk te bestuderen vanwege het gebrek aan biologisch relevante in vitro modelsystemen. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) kunnen stapsgewijs worden gedifferentieerd in 3D meercellige longorganoïden, gemaakt van zowel epitheliale als mesenchymale celpopulaties. We reconstrueren embryonale ontwikkelingssignalen door tijdelijk een verscheidenheid aan groeifactoren en kleine moleculen te introduceren om efficiënt definitief endoderm, anterieur voorgut endoderm en vervolgens longvoorlopercellen te genereren. Deze cellen worden vervolgens ingebed in groeifactor gereduceerd (GFR) -keldermembraanmatrixmedium, waardoor ze zich spontaan kunnen ontwikkelen tot 3D-longorganoïden als reactie op externe groeifactoren. Deze hele longorganoïden (WLO) ondergaan vroege longontwikkelingsstadia, waaronder vertakkende morfogenese en rijping na blootstelling aan dexamethason, cyclisch AMP en isobutylxanthine. WLO's bezitten luchtwegepitheelcellen die de markers KRT5 (basaal), SCGB3A2 (club) en MUC5AC (bokaal) tot expressie brengen, evenals alveolaire epitheelcellen die HOPX (alveolair type I) en SP-C (alveolair type II) tot expressie brengen. Mesenchymale cellen zijn ook aanwezig, waaronder gladde spier actine (SMA) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor A (PDGFRα). iPSC-afgeleide WLO's kunnen vele maanden in 3D-kweekomstandigheden worden gehandhaafd en kunnen worden gesorteerd op oppervlaktemarkers om een specifieke celpopulatie te zuiveren. iPSC-afgeleideWLO's kunnen ook worden gebruikt om de ontwikkeling van menselijke longen te bestuderen, inclusief signalering tussen het longepitheel en mesenchym, om genetische mutaties op de functie en ontwikkeling van menselijke longcellen te modelleren en om de cytotoxiciteit van infectieuze agentia te bepalen.

24 uur na plating, dag 1, moeten iPSC's 50% -90% confluent zijn. Op dag 2 moet DE 90%-95% confluent zijn. Tijdens DE-inductie is het gebruikelijk om significante celdood te observeren op dag 4, maar gehechte cellen behouden een compacte kasseienmorfologie (figuur 2b). Stop met differentiatie als de meerderheid van de aanhangende cellen loskomt en overweeg de blootstelling aan DE-media met activine A met 6-12 uur te verkorten. Tijdens AFE-inductie is de celdood minimaal en blijven cellen aanh...

Het artikel beschrijft stapsgewijze gerichte differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar driedimensionale hele longorganoïden die zowel proximale als distale epitheellongcellen bevatten, samen met mesenchym.

Generatie van 3D-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Dit protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen om ze te differentiëren in longcellen om menselijke longziekte en ontwikkeling in een schaal te modelleren. Dit protocol is belangrijk omdat het moeilijk is om primair menselijk longweefsel te verkrijgen en te kweken. De belangrijkste voordelen van het onderscheiden van longcellen van pluripotente stamcellen is het hebben van een constante toevoer van specifieke longcellen om de ontwikkeling en ziekte van menselijke longen te bestuderen.Deze cellen kunnen gedurende lange tijd in celkweek worden gehouden, kunnen worden gecryopreserveerd voor toekomstige toepassingen en kunnen genetisch worden gemanipuleerd om genmutaties te bestuderen. De procedure wordt gedemonstreerd door Rachel McVicar, een promovenda uit mijn laboratorium. Voordat u met het experiment begint, ontdooit u langzaam een groeifactor verlaagd, of GFR, keldermembraanmatrixmedium op ijs en verdunt u het in een gelijk volume koude DMEM F12.Plaats P1000 tips in de vriezer om af te koelen voor gebruik. Bestrijk vervolgens elke put van een plaat met 12 putten met 500 microliter van het 50% GFR keldermembraanmatrixmedium en verwijder overtollig mediummengsel en bubbels uit de putten. Plaats de putplaten bovenop nat ijs of een koelkast op vier graden Celsius om 20 minuten uit te zetten en verplaats de plaat vervolgens een nacht naar de incubator van 37 graden Celsius.Wanneer hoge PSE's 70% confluentie bereiken, voeg dan 10 micromolaire ROCK-remmer Y27632 toe aan door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en wacht een uur voorafgaand aan dissociatie. Adem de media op en was de cellen eenmaal met PVS. Dissocieer IPSC's door 500 microliter cellospermedium per put toe te voegen en incubaleer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius in een incubator van 5% koolstofdioxide.Voeg na de incubatie 500 microliter stamcelpassageing medium per put toe. Pipetteer cellen voorzichtig met behulp van een P1000-tip om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Breng vervolgens de gedissocieerde cellen over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten op 300 maal G.Na het centrifugeren van het medium, aspiraleer het medium en resuspend de celkorrel met één milliliter mTeSR Plus-media aangevuld met 10 micromolaire ROCK-remmer.Voeg na het tellen van de cellen twee keer 10 toe aan de vijfde IPSC's aan elke put van een 12 well GFR medium coated plaat en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Aspirateer de volgende dag de mTeSR Plus voordat u definitieve endoderm of DE inductiemedia toevoegt. Vervang op dag twee en drie de DE-inductiemedia.Begin op dag vier met AFE-inductie door DE-inductiemedia te vervangen door serumvrij basaal medium. Verander het AFE-medium dagelijks gedurende drie dagen voordat u de AFE-efficiëntie aan het einde van dag zes analyseert. Ontdooi op dag zeven het GFR-keldermembraanmatrixmedium op ijs voor later gebruik.Ga tegelijkertijd verder met longvoorloperceldifferentiatie door de AFE-media aan te zuigen en de putten met PVS te wassen. Voeg een milliliter celloslatingsoplossing toe aan de put en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na incubatie één milliliter blusmedium toe aan de Wells-bevattende celloslatingsoplossing.Bewaar cellen als aggregaten door voorzichtig op en neer te pipetteren. Zorg ervoor dat alle cellen zijn losgemaakt, maar voor het overbrengen in een conische buis van 15 milliliter voor centrifugatie op 300 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in LPC-inductiemedia.Tel de cellen en voeg 2,5 keer 10 toe aan de vijfde cellen tot 100 microliter koud GFR-keldermembraanmatrixmedium en meng goed. Plaats een druppel in een put van een bord met 12 putten en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten. Voeg vervolgens één milliliter LPC-media per put toe, zorg ervoor dat de mediumdruppel volledig onder water staat en 's nachts bij 37 graden Celsius incubeert.Verander op dag acht het LPC-medium om ROCK-remmer Y27632 te verwijderen. Blijf de media om de dag veranderen en analyseer de LPC-efficiëntie aan het einde van dag 16. Was op dag 17 de putjes en voeg 500 microliter van twee microgram per milliliter dispase toe.Pipetteer het dispase-mengsel met een P1000-pipet en incubeer gedurende 15 minuten, pipetteer vervolgens het mengsel en incubeer nog eens 15 minuten. Voeg na incubatie een milliliter van de blusmedia toe aan de dispase bevattende putten en breng de cellen over in conische buizen. Centrifugeer en resuspend de pellet in één milliliter gekoeld PVS en herhaal vervolgens de centrifugatie.Breng de pellet vervolgens opnieuw op in één milliliter celloslatingsmedium. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 12 minuten, voeg vervolgens een gelijk volume blusmedia toe en centrifugeer opnieuw. Resuspend de pellet in één milliliter blusmedia en 10 micromolaire ROCK-remmer Y27632.Voer een celtelling uit om het volume te berekenen dat nodig is om acht keer 10 tot de vierde cel per put te verkrijgen. Vervolgens aliquot vereist volume LPC-celaggregaten in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 300 keer G.Verwijder overtollig supernatant zonder de celkorrel te roeren, waardoor 10 microliter restmedia overblijft. Resuspend de celkorrel in 200 microliter koud GFR keldermembraanmatrixmedium en breng de cellen over naar celkweekmembraaninzetstukken.Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten. Voeg na incubatie een milliliter 3D-organoïde-inductiemedium toe aan de basolaterale kamer van de insert en vervang deze om de andere dag gedurende zes dagen door een vers medium. Schakel op dag 23 het medium over naar het 3D-vertakkende medium en verander het medium vervolgens om de dag gedurende zes dagen.Schakel op dag 29 over op 3D-rijpingsmedium en blijf het medium de komende zes dagen om de dag vervangen. Op dag vier van DE-inductie vertonen aangehechte cellen een compacte kasseienmorfologie. De definitieve endodermmarkers CXCR4 en SOX17 bedekt met kernen werden uitgedrukt, wat de endodermale differentiatie bevestigde.Anterieure foregutinductie werd bevestigd op dag zeven met de morfologie die nauwer verdichte cellen liet zien en de markers FOXA2 en SOX2 bedekt met kernen. De generatie van 3D-longvoorlopercellen werd bevestigd met 3D-sferoïden en de endogene expressie van NKX2-1 GFP in een reporter cellijn. Na een differentiatie van drie weken in hele longorganoïden, werden de longmarkers geanalyseerd door immunocytochemie.Markers voor vertakkende morfogenese SOX2 en SOX9 bedekt door kernen werden waargenomen in de organoïden. Proximale longmarkers P63 en KRT5, beide markers van basale cellen, werden met succes gedetecteerd samen met SCGB3A2, een marker voor clubcellen. Distale longmarkers geïnduceerden Pro SPC- en SPB-markers voor Alveolaire Type II-cellen.En HOPX-markers van Alveolaire Type I-cellen. Bovendien werden NKX2-1 en ZO1 uitgedrukt bedekt met kernen. De Mesenchyme longcelmarkers PGFR Alpha, een marker voor fibroblasten, samen met SOX9, vertegenwoordigden distaal mesenchym.Vimentine werd ook tot expressie gebracht en was verspreid over de longen. Na deze procedure kunnen de longorganoïden worden belegd met geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide endotheel- en immuuncellen. Longontwikkeling en -ziekte vindt plaats door een signalering tussen de epitheliale en mesenchymale celpopulaties, maar ook van endotheelcellen en macrofagen.Een 3D-longweefselmodelsysteem is klinisch relevant voor het bestuderen van menselijke ziekten en therapieën.

generation-3d-whole-lung-organoids-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol richt efficiënt muis embryonale stamcellen afgeleide definitieve endoderm aan de luchtwegen rijpen epitheelcellen. Deze differentiatie techniek maakt gebruik van 3-dimensionale cellen ontdane long scaffolds rechtstreekse long lijn specificatie, in een gedefinieerd serumvrij cultuurmedium setting.

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van menselijke precisie-cut-Long agarose gevulde segmenten van patiënten weefsel gereseceerd die geschikt zijn voor het genereren van 3D Long weefselcultures naar model menselijke longziekten in de biologische en biomedische studies.

Generatie van menselijke 3D longweefsel culturen (3D-LTCs) voor ziekte modelleren

Dit protocol maakt het mogelijk om menselijke pluripotente cellen te differentiëren tot darmorganoïden. Het protocol bootst de normale menselijke ontwikkeling na door cellen te differentiëren in een populatie van definitief endoderm, endoderm van de dikke darm en vervolgens darmepitheel. Dit maakt het protocol geschikt voor het bestuderen van zowel darmontwikkeling als toepassingen voor ziektemodellering.

Generatie van hiPSC-afgeleide darmorganoïden voor ontwikkelings- en ziektemodelleringstoepassingen

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor weefseldissociatie en cellulaire fractioneringsbenaderingen die verrijking van levensvatbare epitheelcellen uit proximale en distale gebieden van de menselijke long mogelijk maken. Hierin worden deze benaderingen toegepast voor de functionele analyse van longepitheelvoorlopercellen door het gebruik van 3D organoïdencultuurmodellen.

Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur

Hier beschrijven we een protocol om ontwikkelingsrelevante menselijke hartorganoïden (hHO's) efficiënt te maken met behulp van menselijke pluripotente stamcellen door zelforganisatie. Het protocol is gebaseerd op de sequentiële activering van ontwikkelingssignalen en produceert zeer complexe, functioneel relevante menselijke hartweefsels.

Het genereren van zelfassemblerende organoïden voor het menselijk hart afgeleid van pluripotente stamcellen

Het protocol presenteert een methode om menselijke longorganoïden af te leiden uit primaire longweefsels, de longorganoïden uit te breiden en proximale differentiatie te induceren om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren die het menselijke luchtwegepitheel getrouw fenokopie.

Het opzetten van menselijke longorganoïden en proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen voor het genereren en karakteriseren van muriene orale-oesofageale 3D-organoïden die normale, preneoplastische en plaveiselcelcarcinoomlaesies vertegenwoordigen die worden geïnduceerd via chemische carcinogenese.

Modellering van oraal-oesofageaal plaveiselcelcarcinoom in 3D-organoïden

Dit protocol presenteert een methode voor het genereren van vasculaire organoïden met behulp van menselijke pluripotente stamcellen.

Vasculaire organoïdegeneratie uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen van de patiënt afgeleid fibroblast-achtige synoviocyten, met behulp van een lentivirale systeem zonder feeder-cellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van fibroblast-achtige synoviocyten Geïsoleerd van de gewrichten van patiënten met reumatoïde artritis

Het doel van dit protocol is om het protocol te laten zien voor het herprogrammeren van in melanoom geïnfiltreerde tumorlymfocyten in geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Leer een protocol voor de differentiatie van hiPSCs naar 3D longorganoïden met stapsgewijze inductie van endoderm en longvoorlopercellen. Deze methode modelleert menselijke longontwikkeling en ziekte in vitro.

Generatie van 3D-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte (Video) | JoVE Journal

Generatie van 3D-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte

Meer video's verkennen