Name: Gebruik van trowell-type orgaancultuur om de regulatie van tandheelkundige stamcellen te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Leer hoe u Trowell-type orgaancultuur gebruikt om tandheelkundige stamcellen in de muizenincisief te bestuderen. Deze methode maakt live imaging en screening van regulerende moleculen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door de Jane and Aatos Erkko Foundation.

Dit protocol omvat het gebruik van dieren en alle procedures zijn goedgekeurd door ethische commissies voor het gebruik en de verzorging van dieren en de dierenfaciliteit aan de Universiteit van Helsinki.
1. Bereiding van de orgelcultuurschaal
<ol><li>Voer alle procedures uit in een laminaire stromingskap. Reinig werkoppervlakken met 70% ethanol en gebruik instrumenten en oplossingen van autoclaved glas. Steriliseer een schaar en andere metalen apparatuur in een sterilisator met glaskralen.</li>
	<li>Bereid filters voor die normaal in 70% ethanol worden bewaard door ze drie keer in 1x PBS te wassen om ethanol te verwijderen (figuur 1). Snijd filters in rechthoekige stukken (3 x 3-5 x 5 mm). LET OP: Gewassen filterstukken kunnen meerdere dagen bewaard worden in 1x PBS bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid het kweekmedium (1:1 DMEM:F12 aangevuld met 1% [v/v] 200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide in 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/ml ascorbinezuur en 0,2% [v/v] penicilline [10.000 I.U./ml] en streptomycine [10.000 μg/ml]). Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Plaats de metalen roosters van 30 mm (met gaten met een diameter van 1-2 mm die weefselbeeldvorming mogelijk maken) in een petrischaaltje van 35 mm. Voeg voldoende media toe om het rasteroppervlak te bereiken zonder luchtbellen te produceren. Verwarm de bereide kweekschaal voor op 37 °C totdat het weefsel geïsoleerd en klaar is voor kweek (in een standaard incubator met 5% CO2 en 90%-95% luchtvochtigheid).</li>
</ol>2. Snijtandsectie en isolatie van het proximale uiteinde
<ol><li>Offer de dieren volgens een goedgekeurd dierverzorgingsprotocol.</li>
	<li>Onthoofd de muis en ontleed de onderkaak. Om dit te doen, verwijdert u eerst de huid om de onderkaak bloot te leggen en snijdt u door de kauwspieren om deze te scheiden van de maxilla en de rest van het hoofd.</li>
	<li>Zodra de onderkaak is geïsoleerd, verwijdert u de tong en zoveel mogelijk zacht weefsel.</li>
	<li>Verzamel alle kaken en bewaar ze in een petrischaal met PBS op ijs, omdat dit de levensvatbaarheid van de weefsels verbetert.</li>
	<li>Breng één onderkaak over op een glazen petrischaal en gebruik wegwerpbare 20/26 G hypodermische naalden om de snijtand onder een stereomicroscoop te ontleden. Splits de onderkaak op de middellijn en snijd door de symfyse. Reinig het zachte en spierweefsel weg van het botoppervlak voor een betere visualisatie. OPMERKING: Een glazen petrischaal is essentieel, omdat dit de naalden niet zal stompen.</li>
	<li>Kaken verkregen van dieren jonger dan 10 dagen zijn zachter en kwetsbaarder, gebruik daarom wegwerpbare 20/26 G hypodermische naalden om elke helft van de onderkaak in de lengterichting te openen om de snijtand bloot te leggen. Voor muizen ouder dan 10 dagen, gebruik een pincet om de onderkaak vast te pakken en het bot te breken om de tand bloot te leggen.</li>
	<li>Maak de snijtand voorzichtig los van het omliggende bot en snijd het proximale uiteinde af, dat de cervicale lus bevat.</li>
	<li>Snijd het proximale uiteinde en verwijder het gemineraliseerde glazuur en dentinematrix.</li>
	<li>Bewaar de verzamelde proximale uiteinden in Dulbecco's PBS op ijs totdat ze klaar zijn voor cultuur.</li>
</ol>3. Cultuur
<ol><li>Plaats voorzichtig een filterrechthoek op de bovenkant van een rooster in een voorverwarmde kweekschaal.</li>
	<li>Gebruik een stereomicroscoop om de weefselstukken goed te oriënteren.</li>
	<li>Plaats in een standaard incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 90%-95% luchtvochtigheid.</li>
	<li>Vervang het medium om de dag en vervang het door een vers medium, waarbij de vorming van luchtbellen zorgvuldig wordt vermeden. Monitor de weefselgroei en fotografeer dagelijks met behulp van een camera die op de stereomicroscoop is aangesloten.</li>
</ol>4. Oplosbare factoren toevoegen aan de kweek
<ol><li>Vul het kweekmedium aan met oplosbare factoren en moleculen van belang om hun effect op de regulatie van SC's te bestuderen. OPMERKING: Het toedieningsprotocol voor elk molecuul (groeifactoren, signaalmoleculen, blokkerende antilichamen, farmacologische verbindingen zoals remmers of activatoren, vectoren, enz.) hangt af van de halfwaardetijd en oplosbaarheid. Deze parameters bepalen ook de juiste controle die moet worden gebruikt.</li>
</ol>5. Moleculaire en histologische analyses
<ol><li>Verwijder het kweekmedium.</li>
	<li>Voeg voorzichtig ijskoude methanol toe aan de weefsels om loslating van de filters te voorkomen.</li>
	<li>Laat methanol 5 min staan.</li>
	<li>Breng filters die weefselexplantaten dragen over naar bemonsteringsbuizen.</li>
	<li>Bevestig de explantaten in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10-24 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Ga verder met gevestigde protocollen voor histologische verwerking (paraffine, bevroren, enz.) of immunostainings.</li>
</ol>6. Kweek van plakjes weefsel
OPMERKING: Er zijn verschillende variaties op dit protocol, die allemaal even succesvol zijn en een kwestie van persoonlijke keuze zijn, afhankelijk van de snelheid en de vaardigheid van de gebruiker. Deze verwijzen naar de buffer die wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van weefsel te verzamelen en te behouden. Hiervoor kan Krebs buffer, PBS aangevuld met 2% glucose en antibiotica, of PBS worden gebruikt. Als Krebs buffer wordt gebruikt, moet deze 1 dag van tevoren worden gemaakt en op 4 °C worden bewaard.
<ol><li>Bereid vóór het experiment 4% -5% laagsmeltpunt agarose voor door 2-2,5 g laagsmeltpunt agarose op te lossen in 50 ml kokende 2% glucose / PBS, waarna de oplossing in een waterbad van 45 ° C moet worden geplaatst.</li>
	<li>Zet het vibratoom op, was met 70% ethanol en vul met ijskoude 2% glucose / PBS aangevuld met antibiotica (100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine).</li>
	<li>Ontleed de proximale uiteinden van de snijtand en verzamel ze in de ijskoude 2% glucose / PBS aangevuld met antibiotica.</li>
	<li>Plaats één proximaal uiteinde van de snijtand in de mal met 4%-5% laagsmeltpunt agarose. Richt het stuk onder een stereomicroscoop in de gewenste richting en laat het op ijs staan zodat de agarose uithardt.</li>
	<li>Knip het verharde agaroseblok bij en plaats het in het vibratoom. Snijd dikke plakken (150-300 μm).</li>
	<li>Verzamel de plakjes in een petrischaaltje met ijskoude 2% glucose/PBS aangevuld met antibiotica.</li>
	<li>Gebruik een spatel om de dikke plakken over te brengen op een filterrechthoek die op het voorverwarmde rooster is geplaatst, zoals bereid in punt 1.3.</li>
	<li>Incubeer de dikke plakken in de incubator en ga verder met beeldvorming (figuur 2).</li>
</ol>

<ol><li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li>
<li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li>
<li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li>
<li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
<li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li>
<li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li>
<li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+limits+tooth+number%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li>
<li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li>
<li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues%3A+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li>
<li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li>
<li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

In vitro orgaankweek is op grote schaal gebruikt om inductief potentieel en epitheliaal-mesenchymale interacties te bestuderen die orgaangroei en morfogenese regelen. Het Thesleff-laboratorium heeft aangetoond hoe de Saxén-modificatie van de Trowell-type orgaancultuur kan worden aangepast en gebruikt om de ontwikkeling van tanden tebestuderen 14. De reproduceerbare omstandigheden en vooruitgang in fluorescerende verslaggevers hebben dit een nuttige methode gemaakt voor het monitoren van t...

Muizensnijtanden groeien continu door levenslang behoud van de stamcellen (SC) die de onophoudelijke productie van tandcomponenten ondersteunen. Deze omvatten epitheliale SC's, die glazuurproducerende ameloblasten genereren, en mesenchymale stamcellen (MSC's), die dentineproducerende odontoblasten genereren, naast andere cellen1. De epitheliale SC's in de continu groeiende snijtanden werden aanvankelijk geïdentificeerd als labelkerende cellen 2,3 en sindsdien is aangetoond dat ze een aantal bekende stamgenen tot expressie brengen, waaronder Sox24. Deze cellen delen gemeenschappelijke kenmerken met epitheliale SC's in andere organen en bevinden zich in de SC-niche die de cervicale lus aan de labiale kant van de snijtand wordt genoemd. De niche is een dynamische entiteit die bestaat uit cellen en extracellulaire matrix die SC-activiteit5 regelen. Afstammingsonderzoeken hebben aangetoond dat Sox2+ epitheliale SC's het hele epitheliale compartiment van de tand kunnen regenereren en dat ze cruciaal zijn voor successietandvorming 6,7. MSC's met dentine herstellend of regeneratief potentieel worden grotendeels van buiten het orgaan gerekruteerd via bloedvaten en zenuwen 8,9,10,11, waardoor een geschikt model wordt geboden om werving, migratie en huisvesting van de MSC-populatie te bestuderen.
Het is niet altijd haalbaar om SC's in vivo te bestuderen, omdat veel van de genetische en /of farmacologische manipulaties de homeostase van organen kunnen beïnvloeden en / of dodelijke gevolgen kunnen hebben. Daarom biedt orgaancultuur een uitstekend hulpmiddel om de regulatie van SC's en hun niches in vitro te bestuderen. Het orgaankweeksysteem dat gebruik maakt van een metalen raster werd aanvankelijk ontwikkeld door Trowell12 om orgaanontwikkeling te bestuderen en is verder aangepast door Saxen13 om inductieve signalen in de nierontwikkeling te bestuderen. Sindsdien is deze in vitro methode om het geheel of een deel van het orgaan te kweken met succes toegepast op verschillende gebieden. Op het gebied van tandontwikkeling is deze methode op grote schaal gebruikt om de epitheliaal-mesenchymale interacties te bestuderen die de tandontwikkelingregelen 14 en de successietandvorming15. Het werk van het Thesleff-laboratorium heeft het nut van dit systeem aangetoond voor temporele analyse van tandgroei en morfogenese, voor analyse van het effect van verschillende moleculen en groeifactoren op tandgroei, en voor time-lapse live beeldvorming van tandontwikkeling 16,17. Meer recent is deze methode gebruikt om de regulatie van snijtandSC's en hun niche18,19 te bestuderen, die hier in detail wordt beschreven.

<table><tbody><tr><td>1-mL plastic syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable 20/26 gauge hypodermic needles</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>F-12</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS South American (CE)</td><td>LifeTechn.</td><td>10270106</td><td>verdeel in aliquoten, bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer</td><td>Simon Keller Ltd</td><td>4AJ-6285884</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter</td><td>MerckMillipore</td><td>VCTP02500</td><td>Bewaar in 70% ethanol bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>L-Ascobic Acid</td><td>Sigma</td><td>A4544-25g</td><td>verdund 100 mg/ml in MilliQ, filter gesteriliseerd en verdeeld in 20&mu;l aliquoten, bewaar in het donker, -20&deg;C</td></tr><tr><td>Low melting agarose</td><td>TopVision</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>Metal grids</td><td></td><td></td><td>Commercieel verkrijgbaar, of zelf gemaakt van roestvrijstalen gaas (corrosiebestendig, maaswijdte 0,7 mm). Snijd een schijf met een diameter van ongeveer 30 mm en buig de randen om een hoogte van 3 mm te geven. Gebruik spijkers om gaten te maken.</td></tr><tr><td>Micro forceps</td><td>Medicon</td><td>07.60.03</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, Soda-Lime glass</td><td>DWK Life Sciences</td><td>9170442</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 35 mm, with vent</td><td>Duran</td><td>237554008</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 90 mm, no vent classic</td><td>Thermo Fisher</td><td>101RT/C</td><td></td></tr><tr><td>Small scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van trowell-type orgaancultuur om de regulatie van tandheelkundige stamcellen te bestuderen

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Orgaanontwikkeling, functie en regeneratie zijn afhankelijk van stamcellen, die zich bevinden in discrete anatomische ruimtes die stamcelniches worden genoemd. De continu groeiende muizensnijtand biedt een uitstekend model om weefselspecifieke stamcellen te bestuderen. De epitheliale weefselspecifieke stamcellen van de snijtand bevinden zich aan het proximale uiteinde van de tand in een nis die de cervicale lus wordt genoemd. Ze zorgen voor een continue instroom van cellen om de constante slijtage van de zelfslijpende punt van de tand te compenseren. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de isolatie en cultuur van het proximale uiteinde van de muizensnijder die stamcellen en hun niche herbergt. Dit is een gemodificeerd Trowell-type orgaankweekprotocol dat in vitro kweek van weefselstukken (explantaten) mogelijk maakt, evenals de dikke weefselplakken op de vloeistof / lucht-interface op een filter ondersteund door een metalen rooster. Het hier beschreven orgaankweekprotocol maakt weefselmanipulaties mogelijk die in vivo niet haalbaar zijn, en in combinatie met het gebruik van een fluorescerende verslaggever (s), biedt het een platform voor de identificatie en tracking van discrete celpopulaties in levende weefsels in de loop van de tijd, inclusief stamcellen. Verschillende regulerende moleculen en farmacologische verbindingen kunnen in dit systeem worden getest op hun effect op stamcellen en hun niches. Dit biedt uiteindelijk een waardevol hulpmiddel om stamcelregulatie en -onderhoud te bestuderen.

De epitheliale SC's bevinden zich in een niche die de cervicale lus wordt genoemd, die zich aan het proximale uiteinde van de snijtand bevindt (figuur 3A). Cervicale lussen zijn morfologisch verschillende structuren die bestaan uit binnenste en buitenste glazuurepitheel die het stellaire reticulum omhullen, een kern van losjes gerangschikte epitheelcellen (figuur 3B,C). Er zijn twee cervicale lussen in elke snijtand (figuur ...

De Trowell-type orgaankweekmethode is gebruikt om complexe signaleringsnetwerken te ontrafelen die de tandontwikkeling regelen en, meer recent, voor het bestuderen van regulatie die betrokken is bij stamcellen van de continu groeiende muizensnijder. Fluorescerende reporter diermodellen en live-imaging methoden vergemakkelijken diepgaande analyses van tandheelkundige stamcellen en hun specifieke niche micro-omgeving.

Gebruik van trowell-type orgaancultuur om de regulatie van tandheelkundige stamcellen te bestuderen

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

De Trowell-type orgaankweek wordt gebruikt om weefselexplantaten te kweken. Hier laten we zien hoe je deze methode kunt gebruiken om de stamcellen in continu groeiende tanden te bestuderen. Met deze techniek kunnen we de stamcellen en hun gedrag in de niche bestuderen en het effect van verschillende moleculen op de overleving en het onderhoud van stamcellen screenen.Deze methode kan worden toegepast om ook de stamcellen van andere organen te bestuderen, zoals huid of borstklier. Begin met het plaatsen van metalen roosters van 30 millimeter met gaten met een diameter van één tot twee millimeter in een petrischaaltje van 35 millimeter. Vul de plaats met media totdat de media het rasteroppervlak bereiken.Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius totdat het weefsel is geïsoleerd en klaar is om te kweken. Verwijder na het onthoofden van de muis de huid om de onderkaak bloot te leggen en snijd door de kauwspieren om de onderkaak van de maxilla en de rest van het hoofd te scheiden. Zodra de onderkaak is geïsoleerd, verwijdert u de tong en het maximale zachte weefsel.Splits de onderkaak aan de middellijn door de symfyse door te snijden. Plaats de onderkaak in de petrischaal met PB

use-trowell-type-organ-culture-to-study-regulation-dental-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door...

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

De voortdurend groeiende muis snijtand is een model voor het bestuderen van de vernieuwing van tandweefsel van tandheelkundige epitheliale stamcellen (DESCs). Een robuust systeem voor consistente en betrouwbare wijze verkrijgen van deze cellen van de snijtanden en de uitbreiding van deze in vitro wordt hier gemeld.

Isolatie en Cultuur van Dental epitheliale stamcellen van de volwassen muis Incisor

Dit protocol beschrijft de voorbijgaande genetische manipulatie van tandheelkundige stamcellen gewonnen uit de menselijke tandheelkundige follikel. De toegepaste niet-virale wijziging strategie kan een basis voor de verbetering van de cel van de stam van de therapeutische producten geworden.

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

Wij bieden protocollen voor evaluatie van mesenchymale stamcellen van tandmerg geïsoleerd en prostaatkanker cel interacties op basis van directe en indirecte co kweekmethoden. Voorwaarde medium en trans-well membranen zijn geschikt voor het analyseren van indirecte paracrine activiteit. Zaaien differentieel is gekleurd cellen samen een passend model voor directe cel-cel interactie.

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

We beschrijven de isolatie, dispersie en beplating van tandheelkundige pulp (DP) primaire cellen met trigeminale (TG) neuronen gekweekt bovenop bovenliggende transwell filters. Cellulaire reacties van DP-cellen kunnen worden geanalyseerd met immunofluorescentie of RNA/eiwitanalyse. Immunofluorescentie van neuronale markers met confocale microscopie maakt de analyse van neurite outgrowth reacties mogelijk.

Een co-cultuur methode om Neurite Outgrowth studie in reactie op tandheelkundige pulp paracrine signalen

Dit protocol presenteert een methode voor de kweek en 3D-groei van ameloblastachtige cellen in microzwaartekracht om hun langwerpige en gepolariseerde vorm en glazuurspecifieke eiwitexpressie te behouden. Kweekomstandigheden voor de kweek van parodontale engineeringconstructies en longorganen in microzwaartekracht worden ook beschreven.

Voortplanting van tandheelkundige en respiratoire cellen en organen in microzwaartekracht

We presenteren een protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen, uitgaande van menselijke tand. De organoïden zijn robuust uitbreidbaar en recapituleren de epitheelstamcellen van de tand, inclusief hun ameloblastdifferentiatiecapaciteit. Het unieke organoïde model biedt een veelbelovend hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige (stamcel) biologie te bestuderen met perspectieven voor tandregeneratieve benaderingen.

Organoïden van menselijke tand vestigen als een krachtig hulpmiddel voor mechanistisch onderzoek en regeneratieve therapie

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding voor het opzetten van een primaire cultuur van stamcellen van tandpulp met behulp van de explantatiecultuurmethode en karakterisering van deze cellen op basis van ICSCRT-richtlijnen. De cellen die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen worden beschouwd als mesenchymale stamcellen voor verdere toepassingen.

Primaire cultuur van stamcellen van tandpulpa

Dit protocol legt de nadruk op de extractie, kweek en conservering van multipotente stamcellen uit tandpulp door middel van enzymatische vergisting. Bovendien toont het hun potentieel aan om te differentiëren in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten, wat het belang van precisie en consistentie in het proces benadrukt.

Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden

Ex vivo live beeldvorming is een krachtige techniek voor het bestuderen van de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties in levende weefsels. Hier presenteren we een protocol dat twee-fotonmicroscopie implementeert om tandepitheelcellen live te volgen in gekweekte snijtanden van hele volwassen muizen.

Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken

Leer hoe u Trowell-type orgaancultuur gebruikt om tandheelkundige stamcellen in de muizenincisief te bestuderen. Deze methode maakt live imaging en screening van regulerende moleculen mogelijk.

Gebruik van trowell-type orgaancultuur om de regulatie van tandheelkundige stamcellen te bestuderen

Meer video's verkennen