Een gegeneraliseerde methode voor het bepalen van de vrij oplosbare fenolzuursamenstelling en antioxidantcapaciteit van granen en peulvruchten

Een gegeneraliseerde methode voor het bepalen van de vrij oplosbare fenolzuursamenstelling en antioxidantcapaciteit van granen en peulvruchten. Volle granen, waaronder granen en peulvruchten, vormen een aanzienlijk deel van de menselijke voeding. Hun voedingsrelevantie voor de mens is al lang erkend.

Meer recent zijn echter hun antioxiderende beschermende gezondheidsvoordelen gemeld. Fenolzuren in de buitenste graanlagen van granen en de zaadlaag van peulvruchten dragen bij aan de antioxiderende eigenschappen van volle granen. Ze ruimen vrije radicalen op die oxidatieve schade aan biomoleculen veroorzaken.

De twee klassen van fenolzuren in volle granen zijn hydroxybenzoëzuren en hydroxycinnamic zuren. Deze studie biedt een eenvoudige methode voor het extraheren van volkoren fenolzuren en het bepalen van hun in vitro antioxidantcapaciteit. Gebruik vijf volkorenmonsters voor deze studie, durumtarwe, gele maïs, black-eye cowpea-boon, sojaboon en rode nierboon.

Weeg nauwkeurig 100 milligram van het volkorenmeelmonster rechtstreeks in een amberkleurige microcentrifugebuis met een capaciteit van twee milliliter. De donkere kleur van de buis helpt blootstelling van het mengsel aan licht te voorkomen. Voeg één milliliter 80% waterige methanol toe aan elk van de buizen met voorbeelden.

Vortex kort om de methanoloplossing en het monster te mengen. Soniceer de monsters gedurende 60 minuten om de vrij oplosbare fenolverbindingen te extraheren. Plaats een deksel over de monsters voor de duur van de ultrasoonapparaat voor extra bescherming tegen licht.

Centrifugeer na ultrasoonapparaat de mengsels gedurende vijf minuten op 20.000 keer G om de vaste residuen te bezinken, waardoor het supernatant bovenop blijft. Vrije fenolverbindingen zullen na centrifugeren aanwezig zijn in het supernatant. Het supernatant moet worden gefilterd voordat het in het HPLC-instrument wordt geïnjecteerd.

Om het supernatant te filteren, verwijdert u de zuiger van een spuit van 3 ml en bevestigt u een spuitfilter. Het filter mag een poriegrootte hebben die niet groter is dan 0,22 micrometer. Pipetteer ongeveer 0,4 milliliter van het supernatant in de bovenkant van de spuit.

Plaats de zuiger opnieuw en duw de vloeistof door het filter in een HPLC-injectieflacon met een injectieflacon. Zodra het instrument is ingesteld om de methode uit te voeren die in het manuscript voor HPLC-analyse wordt beschreven, laadt u de injectieflacons in de carrousel om overeen te komen met de steekproeflijst. Verkrijg HPLC-chromatogrammen op 320 nanometer en 280 nanometer, met verschillende pieken die verschillende fenolverbindingen vertegenwoordigen.

Kwantificeer hydroxycinnaminezuren met behulp van geschikte standaardcurven op 320 nanometer, omdat ze een maximale absorptie hebben bij deze golflengte. Kwantificeer volgens hetzelfde principe hydroxybenzoëzuren op 280 nanometer. Gebruik Trolox, een in water oplosbaar analoog van vitamine E, als standaard om de in vitro antioxidantcapaciteit van de volkorenextracten te schatten.

Weeg nauwkeurig een milligram Trolox in een Falcon-buis. Los op met vier milliliter 50% waterige methanol om een voorraadoplossing van één millimol per liter te bereiden, wat hetzelfde is als 1000 micromol per liter. Bereid zes concentraties Trolox voor die 50, 100, 200, 400, 600 en 800 micromol per liter zijn om standaardcurven uit te zetten voor de schatting van dpph-radicale opruimcapaciteit en Trolox'equivalent antioxidantcapaciteit, TEAC.

Bereid op dezelfde manier 6,25, 12,5, 25 en 50 micromol per liter Trolox-concentraties voor het schatten van het absorptievermogen van zuurstofradicalen, ORAC. Maak het totale volume van elke concentratie samen tot 500 microliter, zoals weergegeven in tabel één. Verdun de monsterextracten met methanol voorafgaand aan de analyse.

Hier werden gele maïs- en cowpea-extracten twee keer verdund. De tarwe- en nierbonenextracten werden vijf keer verdund, terwijl het soja-extract 10 keer werd verdund met methanol. Weeg 8,23 milligram ABTS af in een schone amberkleurige microcentrifugebuis met een capaciteit van twee milliliter.

Weeg vervolgens 1,62 milligram kaliumpersulfaat in een schone, amberkleurige microcentrifugebuis met een capaciteit van twee milliliter. Los elk van de gewogen chemicaliën op in één milliliter gedestilleerd water door vortexing. Dit resulteert in een 16 millimolaire ABTS-oplossing en een zes millimolaire kaliumpersulfaatoplossing.

Bereid de ABTS-stamoplossing door de ABTS- en kaliumpersulfaatoplossingen in gelijke volumes te mengen. De oplossing verandert onmiddellijk in een donkere kleur. Laat dit mengsel 12 tot 16 uur in het donker incuberen.

Verdun de ABTS-stamoplossing 30 keer met 200 millimolaire fosfaat-gebufferde zoutoplossing om de ABTS-werkoplossing te vormen. Voeg hiervoor 58 milliliter van 200 millimolar PBS toe aan twee milliliter van de ABTS-werkoplossing. De werkoplossing bevat 0,27 millimolair ABTS en 0,1 millimolair kaliumpersulfaat.

Plaats voor de analyse 10 microliter van elk verdund extract in een microplaat van 96 putten. Voeg 190 microliter ABTS-werkoplossing toe aan elke put en incubeer gedurende 60 minuten. Meet de absorptie van de reactiemengsels op 750 nanometer in een microplaatlezer.

Gebruik de Trolox-normen in concentraties variërend van 100 tot 800 micromol per liter om een kalibratiecurve uit te zetten. De DPPH antioxidant assay vereist een radicaal-genererende verbinding, DPPH. Weeg 1,2 milligram DPPH af in een lege centrifugebuis met een capaciteit van 15 milliliter.

Los de DPPH op in methanol om een 60 micromolaire oplossing te bereiden. De DPPH-test test het vermogen van de monsterextracten om vrije radicalen geproduceerd door DPPH op te ruimen. Voeg vijf microliter monsterextract toe aan de microplaatputten.

Voeg vervolgens 195 microliter 60 micromolaire DPPH methanoloplossing toe en incubeer gedurende 60 minuten. Meet de absorptie op 515 nanometer. Gebruik de Trolox-standaarden om een kalibratiecurve uit te zetten.

Figuur één toont de structuur van hydroxybenzoëzuren in de volle granen. In deze huidige studie was vanillinezuur het enige hydroxybenzoëzuur dat werd geïdentificeerd. Figuur twee toont de structuur van hydroxycinnaminezuren in volle granen.

In de huidige studie werden p-coumarinezuur, cafeïnezuur en ferulazuur geïdentificeerd in de monsters. Tabel twee toont de fenolzuren die in de monsters zijn geïdentificeerd. Zoals eerder vermeld, was vanillinezuur het enige hydroxybenzoëzuur dat in de monsters werd geïdentificeerd.

Het werd alleen geïdentificeerd in het cowpea-extract. Het hydroxycinnamic acid cafeïnezuur werd alleen geïdentificeerd in nierboonen, terwijl p-coumerinezuur werd geïdentificeerd in gele maïs, cowpea en sojabonen. Ferulazuur werd in alle monsters geïdentificeerd en was het overheersende fenolzuur in de monsters.

De totale concentratie van de fenolzuren in volgorde van grootste tot minste was in de volgorde sojaboon, cowpea, gele maïs en nierboon of gelijkwaardig, gevolgd door tarwe. Tabel drie toonde het totale fenolgehalte en de antioxidantcapaciteit van de monsters. De antioxidantcapaciteit bestond uit DPPH radicale opruimcapaciteit, TEAC, ORAC en de totale antioxidantcapaciteit van de monsters.

De totale antioxidantcapaciteit is de som van de DPPH-, TEAC- en ORAC-waarden. Net als in tabel twee had soja de hoogste totale antioxidantcapaciteit. In plaats van cowpea was het echter eerder een nierboon met de op een na hoogste totale antioxidantcapaciteit, hoewel cowpea het op een na hoogste totale fenolzuurgehalte had.

Deze anomalie is gerelateerd aan de structuren van de individuele fenolzuren en het mogelijke antagonistische effect van het hydroxybenzoëzuur vanillic zuur op de antioxiderende effecten van de hydroxycinnamic zuren in cowpea. Deze studie concludeerde dat volle granen verschillen in hun fenolzuursamenstellingen. Van de bestudeerde volle granen heeft soja de hoogste totale hoeveelheid fenolzuren en, dienovereenkomstig, de hoogste antioxidantcapaciteit.