Functionele beoordeling van intestinale tight junction barrier en ionendoorlaatbaarheid in inheems weefsel door Ussing Chamber Technique

Dit protocol wordt gebruikt om de transportkwaliteiten van tight junctions te bestuderen. Met behulp van verdunningspotentialen kunt u de permselectiviteit meten en inzicht krijgen in tight junctions in een weefsel. Deze techniek is specifiek en maakt gebruik van inheemse weefsels voor functionele studies van epithelia.

Bovendien meet deze techniek de real-time fysiologische eigenschappen van een weefsel, wat erg handig is. De grootste uitdaging is de weefselvoorbereiding. Het oefenen van de techniek, evenals het bekijken van deze video zal helpen.

het bevestigen van de levensvatbaarheid van weefsel is ook een belangrijke stap. Plaats om te beginnen de gewenste segmenten van darmweefsel verzameld van claudin-15 knock-out muizen in ijskoude bubbled Ringer's oplossing en snijd het vet en bindweefsel weg. Na het wegsnijden van het vet en bindweefsel, snijdt u langs de mesenterische aanhechtingen om elk segment in de lengterichting te openen, brengt u de segmenten terug naar de ijskoude Ringer-oplossing en wast u de stukken grondig.

Om de spierlaag te strippen, giet je twee tot drie milliliter verse ijskoude bubbels Ringer's-oplossing in een met siliconenrubber bedekte dissectieplaat onder een dissectiemicroscoop en gebruik je de pinnen om de uiteinden van een darmweefselsegment in de schaal vast te zetten met de mucosale kant naar beneden gericht. Ontleed met behulp van een fijne tang botweg de spierlaag van het onderliggende slijmvlies, waarbij u voorzichtig bent om niet te scheuren of gaten in het weefsel te introduceren. Zodra de spierlaag is verwijderd, knipt u een stuk dat groot genoeg is voor een opening met een diameter van vijf millimeter en plaatst u het weefsel op een stuk gestanst filterpapier met ringer's oplossing slijmvlieszijde naar beneden met behulp van een zwarte achtergrond om ervoor te zorgen dat de opening in het filterpapier volledig wordt bedekt door het weefsel zonder rimpels.

Om de darmpreparaten in een Ussing-kamer te monteren, verwijdert u eerst elke oplossing uit de kamer voordat u deze verwijdert. Leg het filtreerpapier met de darmpreparaatslijmvlieszijde naar beneden op de slijmvlieszijkamer met behulp van de zwarte markeringen om het kamervenster uit te lijnen met het gat in het filtreerpapier. Verbind de serosale zijkamer voorzichtig met de mucosale zijkamer zonder het darmblad te verplaatsen.

Vul snel beide kamers met de HEPES-buffer en plaats borrelende kamers aan het andere uiteinde van elke kamer uit de buurt van het membraan. Sluit de zoutbruggen opnieuw aan en controleer of de spanning stabiel is, pulseer vervolgens de stroom om ervoor te zorgen dat de verbindingen in orde zijn voordat u het systeem ongeveer 15 minuten in evenwicht laat. Om een verdunningspotentiaalexperiment uit te voeren, wast u eerst beide zijden van de kamer met vijf milliliter verse voorverwarmde HEPES-buffer per zijde.

Schakel het opnamesysteem in en stel het bereik in op 250 millivolt. Stel de markeringsposities in, stel het opnamesysteem in op maat en stel de Ussing-kamersystemen in op klemmodus. Zodra het meetpotentieel is gestabiliseerd, gebruikt u de gegevens voor metingen.

Vervang snel de HEPES-buffer vanaf de slijmvlieszijde van de kamer door vijf milliliter verwarmde verdunning HEPES-buffer aangevuld met 75 millimolair natriumchloride. Zodra de membraanpotentiaal zijn hoogtepunt heeft bereikt, vervangt u de verdunningsbuffer van de slijmvlieszijde door een verse HEPES-buffer. Om ervoor te zorgen dat het weefsel levensvatbaar is, voegt u 10 micromolaire Forskolin toe aan de serosale zijde.

Zodra het membraanpotentiaalverschil een piek heeft bereikt en begint af te nemen, is het experiment voorbij. Om de transepitheliale elektrische geleiding en baseline kortsluitstroom te meten, voegt u na het wassen van beide zijden van de kamer, zoals gedemonstreerd, vijf milliliter verse bubbeloplossing van Ringer toe aan elke kant en stelt u het bereik van het registratiesysteem in op 2,5 volt. Stel de markeringsposities in, stel het opnamesysteem in op maat en stel het Ussing-kamersysteem in op de klemmodus.

Zodra de kortsluitstroom en -geleiding zijn gestabiliseerd, gebruikt u de gegevens voor basismetingen. Om ervoor te zorgen dat het weefsel levensvatbaar is, voegt u Forskolin toe aan de serosale kant zoals aangetoond. Zodra het membraanpotentiaalverschil een piek heeft bereikt en is begonnen af te nemen, is het experiment voorbij.

In deze representatieve analyse was de baseline transmucosale geleiding van het middelste dunne darmsegment lager in de claudin-15 knock-out muizen onder kortsluitingsomstandigheden in vergelijking met die waargenomen bij wild-type muizen, terwijl de baseline kortsluitstroom hoger was. Bij luminale natriumchlorideverdunning werd een positief potentiaalverschil ten opzichte van de serosale zijde waargenomen bij wildtype muizen, maar het verschil was verminderd bij de claudin-15 knock-out muizen. Evenzo was de relatieve permeabiliteit van natriumchloride ook afgenomen bij de knock-outdieren.

Berekening van de absolute permeabiliteiten toonde aan dat de absolute permeabiliteit van natrium afnam in de claudin-15 knock-out muizen, terwijl de absolute permeabiliteit van chloride dat niet deed, wat suggereert dat de afname van de relatieve permeabiliteit te wijten is aan een afname van de permeabiliteit van natrium. Zoals verwacht veroorzaakte de toevoeging van Forskolin aan de serosale kant van de kamer geen significant verschil in de verandering van kortsluitstroom tussen de knock-out en wild-type muizen. Aangezien de darmsegmenten een voldoende grote respons op Forskolin vertoonden, werden de membraanpreparaten als levensvatbaar beschouwd.

Het is belangrijk om de juiste spierlaagverwijdering uit te voeren en ervoor te zorgen dat weefsel levensvatbaar is. Spoel het dissectiegedeelte van de muizen af of het preparaat levensvatbaar is.