Detectie van SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody met behulp van een HiBiT-gebaseerde Bioreporter

Mijn lab heeft gewerkt aan COVID-19-onderzoek en we hebben onlangs een nieuwe test ontwikkeld waarmee we SNEL en nauwkeurig SARS-CoV-2-antilichamen konden detecteren. Dit protocol schetst een hoge doorvoertest voor het detecteren van anti-SARS-CoV-2-antilichamen in serummonsters van patiënten, wat van cruciaal belang is gezien de huidige pandemie. De meeste van de huidige serologische testen offeren snelheid op voor gevoeligheid of omgekeerd.

Onze gegevens laten zien dat onze test zowel gevoelig is als een snelle reactietijd heeft. Om een voldoende hoeveelheid hoge HiBiT-RBD bioreporter te produceren, begint u met de voorbereiding op celkweek. Bereid eerst het gemodificeerde adelaarmedium van Dulbecco met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline en streptomycine.

Verwarm vervolgens de media in een waterbad van 37 graden Celsius. Zet de biologische veiligheidskast aan en gebruik 70% ethanol voor het steriliseren van het kastoppervlak. Om de cellijn te kweken, haal je het uit min 80 graden Celsius of vloeibare stikstof en ontdooi je het in een waterbad van 37 graden Celsius.

Meng de ontdooide cellen met ten minste 10 milliliter volledig medium. Pipetteer de celsuspensie in een petrischaaltje van 15 centimeter en draai de plaat om de cellen gelijkmatig te verdelen. Plaats de schaal in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 85 tot 95% luchtvochtigheid.

Observeer de cellen onder de microscoop totdat het confluentieniveau 80 tot 90% bereikt Bij hoge confluentie verwijdert u het medium, wast u de cellen met warme PBS en voegt u drie tot vijf milliliter van 0,25% trypsine-EDTA toe om de cellen van het oppervlak los te maken. Bekijk na ongeveer vijf minuten de cellen onder een microscoop. Als alle cellen drijven, voegt u ten minste vier milliliter medium toe en brengt u de celsuspensie over in een nieuwe steriele buis.

Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en voeg een miljoen cellen toe aan elke put van een plaat met zes putten voor transfectie. Om transfectie van het HiBiT-RBD plasmide uit te voeren, gebruikt u één microgram hiBiT-RBD expressie plasmide met een geschikt transfectiereagens. Incubeer gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur en voeg vervolgens het totale volume druppelsgewijs toe aan elk putje van de plaat.

Vervang de volgende dag het medium met het transfectiemengsel door het volledige medium. Observeer de transfectiecontrole goed 48 uur na transfectie. Verzamel het supernatant in microbuisjes van 1,5 milliliter.

Voeg 500 microliter 1X passieve lysisbuffer of PLB toe aan de cellen, incubeer en schud de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voor cellysis. Om vervolgens het luminescentiesignaal van de bioreporter te evalueren met behulp van een luciferasetest, bereidt u eerst de reactiecomponenten voor en gebruikt u het supernatant als bron van de bioreporter. Verdun de grote BiT en het substraat voor gebruik tot 1X.

Breng 50 microliter van het supernatant van elke put of buis over naar een plaat met 96 putten en voeg 50 microliter 1x grote BiT toe aan elke put. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Open de luminometersoftware, voeg 50 microliter 1X substraat toe aan elke put, plaats de plaat in de luminometer en voer de software uit.

Om de HiBiT-RBD antilichaamdetectietest uit te voeren, bereidt u de HiBiT-RBD-bioreporter voor zoals eerder beschreven en combineert u 50 microliter van het HiBiT-RBD-bevattende supernatant met één microgram van het commerciële SARS-CoV-2 RBD-antilichaam in een microbuisje van 1,5 milliliter. Voeg 20 microliter immunoglobulinebindend eiwit of eiwit G toe aan de oplossing. Breng het totale volume op 300 microliter door PBS toe te voegen.

Incubeer de buizen op een buisschudder of rotator gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 12.000 G gedurende 30 seconden. Gooi vervolgens het supernatant weg en was met PBS.

Herhaal het proces drie keer om de gratis HiBiT-RBD te verwijderen. Resuspend de cellen in 50 microliter PBS en breng het over naar een 96-well plaat. Voeg 50 microliter 1x grote BiT toe en wacht vijf minuten.

Voeg vervolgens 50 microliter 1X NanoLuc-substraat toe. Lees onmiddellijk het luminescentiesignaal af met een luminometer. Bereid grotere hoeveelheden van de HiBiT-RBD bioreporter voor een high throughput assay en combineer 20 microliter magnetisch eiwit G met 50 microliter van het HiBiT-RBD supernatant in elke put van een 96-well plaat voor elk monster.

Voeg 10 microliter van het serummonster toe aan elke put en breng het totale volume op 150 microliter door PBS toe te voegen. Incubeer gedurende 30 minuten op een shaker bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de plaat op een magnetische ring om het Protein G-antilichaamcomplex neer te slaan.

Gooi de oplossing in het middelste gedeelte van elke put weg en voeg PBS toe voor het wassen. Herhaal de wasstap minstens drie keer om overtollige HiBiT-RBD te verwijderen. Voeg 50 microliter 1X PBS en 50 microliter 1X grote BiT toe en incubeer gedurende ten minste vijf minuten bij kamertemperatuur.

Bereid de luminometersoftware voor. Voeg vervolgens 50 microliter 1X substraat toe. Plaats de plaat in de machine, voer software uit en neem de signalen op.

Vergelijk de signalen van serummonsters, controlemonsters en achtergrondsignalen van lege putten. De signalen van zowel de HiBiT-RBD bevattende cellysaat als supernatant van de getransfecteerde cellen werden geregistreerd om de juiste eiwitbron te evalueren. De gegevens toonden een lage achtergrond in vergelijking met een sterk signaal wanneer beide delen werden gecombineerd.

De toevoeging van proteïne G helpt antilichaamprecipitatie. De test werd gebruikt om het signaal van een commercieel SARS-CoV-2 neutraliserend antilichaam te vergelijken met een controle-IgG. Het specifieke antilichaamsignaal was robuust, terwijl het controleantilichaam dicht bij het luminescerende achtergrondniveau lag.

Recombinant verzwakt oncolytisch vesiculair stomatitisvirus of VSV met een mutatie op positie 51 van het M-eiwit dat exogene RBD tot expressie brengt, werd gebruikt om muizen te vaccineren. Het serum verzameld van gevaccineerde muizen produceerde een robuust signaal in vergelijking met geen signaal bij muizen geïnjecteerd met controle VSV. Dit protocol kan worden gebruikt voor de detectie van de SARS-CoV-2-antilichamen in serummonsters van patiënten.

De wasstappen na incubatie met proteïne G zijn van cruciaal belang voor het verminderen van de achtergrond. Daarnaast is het belangrijk om het substraat zo snel mogelijk toe te voegen om signaalverlies te voorkomen. Met een paar extra optimalisatiestappen kan dezelfde test worden gebruikt om bloedmonsters te analyseren en kan het een effectieve methode zijn voor het bepalen van anti-SARS-CoV-2-antilichamen in bloedmonsters van patiënten.