Name: Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het isoleren van muizen megakaryocyt voorlopers (MEP en MKp) uit beenmerg met behulp van magnetische depletie en flowcytometrie. Dit protocol verhoogt de celopbrengst en vermindert diergebruik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Monique Freund, Catherine Ziessel en Ketty bedanken voor de technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), en door Grant ANR-17-CE14-0001-01 to Henri.de la. Salle.

Protocollen met betrekking tot dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met het CREMEAS Committee on the Ethics of Animal Experiments van de Universiteit van Straatsburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Vergunningsnummer: E67-482-10).
1. Verzameling van muisbotten
<ol><li>Offer het dier op in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. OPMERKING: De gegevens in dit manuscript zijn verkregen van C57Bl/6 muizen van 8 tot 12 weken oud. Het aantal verkregen cellen en de frequentie van de genoemde populaties kunnen variëren met leeftijd en muizenstam.</li>
	<li>Spray het lichaam met 70% ethanol.</li>
	<li>Maak met een schaar een incisie van 0,5-1 cm van de huid loodrecht op de wervelkolom en scheur de huid rond het hele lichaam. Trek de huid van het onderlichaam naar beneden en verwijder de huid.</li>
	<li>Plaats het dier op het dissectiekussen, met de voorkant naar beneden. Lokaliseer de bekkenbotten door je vingers langs de blootgestelde wervelkolom van boven naar beneden te laten glijden. Om de iliacale top te lokaliseren, identificeert u de kleine bult in het lumbale gebied in de buurt van de achterpoten (het anterosuperiorgebied van het bekkenbot). Figuur 1A(B) geeft een schematische weergave van de anatomie van de muis.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig01.jpg"> Figuur 1: Muisanatomie. (A) Röntgenfoto van muizen met de achterpoten. Let op de ruimte tussen het bekkenbot en de wervelkolom (gele pijl), waar de schaar moet worden ingebracht om de achterpoten goed te scheiden van het lichaam van de muis (gele stippellijn). (B) Schematische weergave van de beenmergrijke botten van belang. De bekkenbeenderen zijn afgebeeld in rood, de dijbenen in paars en de tibia's in groen. (C) Schematische weergave van het bekkenbot van de muis. Het darmbeen komt overeen met het mergrijke deel van het bekkenbot en is rood gemarkeerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol start="5"><li>Plaats de schaar evenwijdig aan de wervelkolom tegen de wervels en dicht bij de iliacale kuifbult. Ga verder met het snijden van de spieren langs de zijkant van de wervelkolom boven het bekkenbot door de schaar langs de wervels helemaal naar beneden naar de staart te schuiven. OPMERKING: Dit eerste deel van de spieren kan ook worden uitgevoerd met behulp van een scalpelmes.</li>
	<li>Plaats de schaar evenwijdig aan de wervelkolom en ga verder met knippen tussen de wervels en de iliacale top, zoals aangegeven door de gele stippellijn op figuur 1A. Zorg ervoor dat je zo dicht mogelijk bij de wervels blijft. Snijd de resterende spieren om de ledemaat los te maken van het lichaam. OPMERKING: Er zou weinig tot geen weerstand moeten zijn.</li>
	<li>Herhaal dit aan de andere kant om het tweede ledemaat los te maken.</li>
	<li>Breng de ledematen over op een schoon oppervlak en gooi de rest van het lichaam weg in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.</li>
	<li>Stel de bekken-, femur- en tibiale botten bloot door zoveel mogelijk omringend weefsel te verwijderen met de tang en de scalpels.</li>
	<li>Ga verder met het voorzichtig ontwrichten van de heupkop van het bekkenbot door het distale uiteinde van het dijbeen met de tang vast te houden terwijl je de spieren rond de articulatie voorzichtig doorsnijd met de scalpels snijdt. Wiebel de botten om de dislocatie te vergemakkelijken.</li>
	<li>Schraap de resterende spier van het bekkenbot af en snijd met een scalpel in het midden van de holte die wel de dijbeenkop vasthield. Het darmbeen wordt bewaard omdat het rijk is aan hematopoëtische voorlopercellen, terwijl de driehoekige zeer dunne kant van het bot wordt weggegooid, zoals weergegeven in figuur 1C.</li>
	<li>Verwijder de resterende weefsels rond het darmbeen met het scalpel en plaats het gereinigde bot in steriel PBS aangevuld met 2% Newborn Calf Serum (PBS-2% NBCS).</li>
	<li>Knip met een schaar de voet af van het been bij de enkel.</li>
	<li>Houd het onderste deel van het scheenbeen vast met de tang en schraap de spier omhoog naar de knie. Gooi de kuitbeen weg en snijd met het scalpel over het tibiale plateau. Plaats het scheenbeen in steriele PBS-2%NBCS.</li>
	<li>Verwijder de resterende weefsels rond het dijbeen met scalpels.</li>
	<li>Houd de bovenzijde van het dijbeen vast met een tang; plaats het scalpelmesje aan de basis van de knieschijf. Oefen een kracht uit op de knieschijf parallel aan het dijbeen tot het losmaken van de knieschijf. Plaats het dijbeen in steriele PBS-2%NBCS. Verwijdering van de knieschijf biedt een schone toegang voor het inbrengen van de naald voor mergspoeling.</li>
</ol>2. Magnetische uitputting van afstammingspositieve cellen
<ol><li>Breng in een laminaire flowkast de botten over in een steriel petrischaaltje gevuld met steriele PBS-2%NBCS.</li>
	<li>Snijd met een scalpel de kop van de dijbenen af.</li>
	<li>Vul een spuit van 1 ml met steriele PBS-2% NBCS en bevestig een naald van 21 G aan de uitlaat.</li>
	<li>Vul een polypropyleen buis van 5 ml met 2 ml steriele PBS-2% NBCS.</li>
	<li>Houd het dijbeen vast met de tang; steek de naald voorzichtig in de groef die overblijft na het verwijderen van de knieschijf. Breng rotatie aan op de naald tijdens het inbrengen om te voorkomen dat de naald verstopt. Zorg ervoor dat de naald volledig in het bot is ingebracht tot aan de schuine kant.</li>
	<li>Breng het bot met de naald over in de buis met 2 ml PBS-2% NBCS. Dispenseer en aspirateer de PBS-2%NBCS uit de spuit totdat het bot helder is.</li>
	<li>Verwijder de naald uit het dijbeen en steek deze in het gat aan de andere kant waar de dijbeenkop zat. Verwijder en aspirateer de buffer opnieuw en gooi het bot weg.</li>
	<li>Voor de iliacale kam en het scheenbeen, houd het bot met de tang; steek de naald voorzichtig in de open zijde. Breng rotatie aan op de naald tijdens het inbrengen om te voorkomen dat de naald verstopt. Zorg ervoor dat de naald volledig in het bot is ingebracht tot aan de schuine kant. Breng het bot met de naald over in de buis met 2 ml PBS-2% NBCS. Dispenseer en aspirateer de PBS-2%NBCS uit de spuit totdat het bot helder is. Gooi de botten weg. OPMERKING: Botten van maximaal drie muizen kunnen in dezelfde buis worden gespoeld. Pool de cel suspensies.</li>
	<li>Passeer de gepoolde celsuspensie door een celzeefdop van 40 μm die op een steriele polystyreenbuis van 5 ml wordt geplaatst.</li>
	<li>Ga verder met het tellen van de cellen. OPMERKING: Het aantal cellen kan worden uitgevoerd met elke hemocytometer, met behulp van Trypan Blue voor de beoordeling van de levensvatbaarheid of met een geautomatiseerde celteller. Eén muis levert meestal 105 ± 7 x 106 cellen.</li>
	<li>Neem 100 μL van de celsuspensie apart als totaal beenmerg, voeg 500 μL PBS-2% NBCS toe en bewaar het op ijs voor de kleuringsprocedure.</li>
	<li>Pellet de gefilterde suspensie door centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. OPMERKING: Rode bloedcellen kunnen worden gelyseerd door de pellet opnieuw te suspenderen in vers bereide Lysis-oplossing (1/10e in dH2O). Incubeer gedurende 5 minuten totdat de suspensie helder en helderrood wordt en voeg 10 volumes steriel PBS toe. Ga verder met het wassen van de cellen in PBS-2%NBCS door centrifugeren op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Wees voorzichtig bij het verwijderen van het supernatant, omdat de celkorrel erg los zit. Voer een tweede wasbeurt uit met PBS-2%NBCS door centrifugering bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en ga verder met stap 2.13.</li>
	<li>Resuspend de celkorrel in vers bereide primaire antilichaamcocktail met een verhouding van 100 μL per 1 x 107 cellen. Incubeer op ijs gedurende 30-45 min.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antistof</td>
			<td>Verdunning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gr-1-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>B220-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mac-1-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD5-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>TER119-biotine</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD127-biotine</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1.
<ol start="14"><li>Neem 10 μL van de celsuspensie apart in een steriele 5 ml polystyreenbuis met het label Lin-Pos Fraction. Voeg 90 μL PBS-2%NBCS toe en bewaar het op ijs voor de kleuringsprocedure.</li>
	<li>Ga verder met het tweemaal wassen van de cellen met steriele PBS-2%NBCS door centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zorg ervoor dat u de laatste was doet in een steriele polypropyleen buis van 5 ml.</li>
	<li>Bereid tijdens de wasstappen de kralen voor op de magnetische uitputting.<ol>
<li>Resuspend de kralen in de injectieflacon door grondig te vortexen gedurende 30 s.</li>
		<li>Breng een volume kralen dat overeenkomt met twee kralen per doelcel over in een polypropyleenbuis van 5 ml.</li>
		<li>Was de kralen tweemaal met PBS-2%NBCS door de buis op de magneet te plaatsen en de wasbuffer te verwijderen met een steriel glazen Pasteur pipet.</li>
		<li>Resuspend de kralen in 500 μL steriel PBS-2NBCS%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend de pellet van gelabelde cellen in 250 μL kralen en meng voorzichtig gedurende 5 minuten op ijs. Voeg 2 ml steriele PBS-2%NBCS toe en meng voorzichtig. Schud de tube niet.</li>
	<li>Plaats de buis gedurende 2 minuten op de magneet.</li>
	<li>Ga verder met het verzamelen van de niet-magnetische fractie met een steriel glazen Pasteur pipet en voeg deze toe aan de resterende 250 μL magnetische kralen. Sluit de buis af met parafilm.</li>
	<li>Plaats de buis gedurende 20 minuten op een buisrol bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg 2 ml steriele PBS-2%NBCS toe en meng voorzichtig. Schud de tube niet.</li>
	<li>Plaats de buis gedurende 2 minuten in de magneet.</li>
	<li>Ga verder met het verzamelen van de niet-magnetische fractie in een steriele 5 ml polypropyleenbuis met het label Lin-Neg Fraction met een steriele glazen Pasteur pipet.</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugering bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspend de niet-magnetische cellen in 500 μL steriel PBS-2%NBCS.</li>
	<li>Ga verder met het tellen van de cellen. OPMERKING: Eén muis levert meestal 3,9 ± 1,1 x 106 cellen. Typische afstammingskleuring voor en na de uitputting zijn weergegeven in figuur 2B.</li>
</ol>3. Celsortering van megakaryocytenvoorlopers door flowcytometrie
<ol><li>Neem de buizen met het label Total Bone Marrow, Lin-Pos Fraction en Lin-Neg Fraction.</li>
	<li>Ga verder met het splitsen van de inhoud van de buis Total Bone Marrow gelijkelijk in zes steriele 5 ml polystyreenbuizen. Label de buizen met de nummers 1-6.</li>
	<li>Ga verder met het labelen van de buis Lin-Pos Fraction met het nummer 7.</li>
	<li>Ga verder met het splitsen van de inhoud van de buis Lin-Neg Fraction als volgt.<ol>
<li>Breng 50 μL over in een steriele polystyreenbuis van 5 ml met 250 μL steriele PBS-2%NBCS. Splits vervolgens de inhoud gelijkelijk in 3 steriele 5 ml polystyreenbuizen. Label deze buizen met de nummers 8-10.</li>
		<li>De resterende 450 μL lin-neg fractie celsuspensie komt overeen met de buis met het getal 11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg de antilichamen toe aan de buisjes zoals beschreven in tabel 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buis</td>
			<td>Etiket</td>
			<td>Antilichaam cocktail</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Totaal beenmerg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Onbevlekte controle</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Enkele bevlekte bediening</td>
			<td>CD45-FITC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Enkele bevlekte bediening</td>
			<td>CD45-PE (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Enkele bevlekte bediening</td>
			<td>TER119-APC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Enkele bevlekte bediening</td>
			<td>CD45-PECy7 (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Enkele bevlekte bediening</td>
			<td>CD45-APC-Cy7 biotine (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Lin-Pos Fractie</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Enkele bevlekte bediening</td>
			<td>Enkele bevlekte controle. Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Lin-Neg Fractie</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>FMO FITC-besturing</td>
			<td>c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>FMO PE-regeling</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>FMO PECy7-besturing</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Positieve buis voor het sorteren</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2.
<ol start="6"><li>Incubeer op ijs gedurende 30-45 minuten in het donker.</li>
	<li>Was de cellen met steriele PBS-2%NBCS door centrifugeren op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Resuspend de celkorrels als volgt.<ol>
<li>Resuspend voor de buizen 1 tot en met 10 de pellet in 300 μL steriele PBS-2%NBCS aangevuld met 7AAD (2,5 μg/ml finale) (PBS-7AAD). LET OP: 7AAD is een DNA-intercalant en moet daarom met de juiste PBM (handschoenen) worden behandeld.</li>
		<li>Voor buis 11, resuspend de pellet in steriel PBS-7AAD in een maximale concentratie van 5 x 106 cellen per ml en een minimumvolume van 1 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid twee polypropyleen verzamelbuizen met het label MEP en MKp met 2 ml PBS-2% NBCS. OPMERKING: Als alternatief kunnen cellen worden verzameld in kweekmedium of cellysisbuffer, afhankelijk van de daaropvolgende toepassing voor de gesorteerde cellen. Het gebruik van polystyreenbuizen wordt niet aanbevolen vanwege mogelijke interferentie met de geladen druppels die de cellen van belang bevatten.</li>
	<li>Bewaar alle buizen op ijs in het donker.</li>
	<li>Ga verder met de celsorteerder instellen.<ol>
<li>Gebruik de buizen 1-7 om spanning en compensatie in te stellen, buizen 7-10 om de sorteerpoorten voor de celpopulaties van belang te bepalen en buis 11 voor celsortering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De eerste stappen van de gatingstrategie zijn gericht op het uitsluiten van doubletten en dode cellen van de analyse, zoals beschreven in figuur 3. Identificeer enkele levensvatbare cellen en geef SSC-vs Lin-APC-Cy7 dot plot weer om de efficiëntie van de uitputting van de afstamming te bevestigen. Vanuit de Lin- cellen is een poort ingesteld om cellen te selecteren die positief zijn voor c-kit en negatief of dim voor Sca-1 en CD16/32. Een CD9 vs CD150 expressie dot plot voor de geselecteerde cellen maakt de identificatie van vier populaties mogelijk. OPMERKING: MEP- en MKp-cellen zijn beide positief voor CD150. Er kunnen drie expressieniveaus voor CD9 worden gedefinieerd (neg, dim en high). MKp drukt een hoog niveau van CD9 uit en MEP drukt CD9 uit bij een intermediair fluorescentie-intensiteitsniveau. MEP-populatie komt overeen met Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9dim en MKp-populatie komt overeen met Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9helder. De discriminatie tussen CD9 hoge en CD9 dim populaties voor de CD150 positieve cellen wordt ingesteld op basis van het maximale niveau van CD9 expressie in de CD150 negatieve populatie. Eén muis levert doorgaans 5,3 ± 0,6 x 103 MKp en 27,2 ± 2,4 x 103 MEP.</li>
</ol>

<ol><li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+review%3A+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li>
<li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2%2Fflt3%2B+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li>
<li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+bipotent+%28erythroid+and+megakaryocytic%29+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li>
<li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+phenotypic%2C+functional%2C+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li>
<li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li>
<li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+thrombopoietin+%28TPO%29-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li>
<li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJOVE%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li>
<li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li>
<li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14(2014).</li>
<li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.

De methode die in dit artikel wordt beschreven, maakt de extractie en zuivering van muis MEP en MKp mogelijk. Een belangrijke parameter in de optimalisatie van het protocol was het verkrijgen van voldoende cellen die compatibel zouden zijn met de meeste moleculaire en cellulaire assays. De algemene praktijk van het verzamelen van muizenbotten voor hematopoëtische celextractie bestaat meestal uit het oogsten van zowel de dijbenen als de tibia's van elke muis. Het bekkenbot, een andere bron van hematopoëtisch materiaal, wo...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bloedplaatjes worden geproduceerd door megakaryocyten. Deze grote polyploïde cellen bevinden zich in het beenmerg en zoals voor alle bloedcellen zijn ze afgeleid van hematopoëtische stamcellen (HSC)1. De klassieke productieroute van megakaryocyten in het beenmerg is afkomstig van HSC en omvat de generatie van verschillende voorlopers die hun differentiatiepotentieel geleidelijk beperken2. De eerste stamvader die de verbintenis tot de megakaryocytische afstamming ondertekent, is de Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), een bipotente voorloper die zowel erytroïde cellen als megakaryocyten kan produceren3,4,5. De MEP produceert vervolgens een unipotente voorloper /precursor (MKp) die zich zal differentiëren tot een volwassen megakaryocyt die in staat is om bloedplaatjes te produceren. De mechanismen die betrokken zijn bij het genereren van deze voorlopers, evenals hun differentiatie en rijping tot megakaryocyten zijn complex en slechts gedeeltelijk begrepen. Bovendien zijn de heterogeniteit van de MEP-populatie in termen van differentiatiepotentieel en het intrinsieke betrokkenheidsniveau van deze cellen nog steeds onduidelijk. Om deze processen te ontcijferen, is het essentieel om gezuiverde populaties van MEP en MKp te verkrijgen (of er toegang toe te hebben) voor fijne moleculaire en eencellige analyses.
Verschillende studies hebben specifieke combinaties van celoppervlakmarkers aangetoond voor de identificatie van voorlopers die zich inzetten voor de megakaryocytische afstamming in de muis6,7,8. Hieruit werd een methode bedacht waarmee MEP en MKp van muizen konden worden gezuiverd. Deze methode werd geoptimaliseerd om cellen in voldoende aantal en kwaliteit te verkrijgen voor een groot aantal testen. Met ethische overwegingen in gedachten, en om het aantal dieren dat betrokken is bij de experimenten te minimaliseren, hebben we uitgelokt om het beenmerg te oogsten van het dijbeen en het scheenbeen, en ook van de iliacale kam. Dit bot bevat een hoge frequentie en aantal hematopoëtische voorlopers en wordt meestal beschadigd tijdens lange botoogst. Hier gepresenteerd is een gedetailleerde methode voor de betrouwbare verzameling van dit bot.
Het tweede criterium van optimalisatie is het produceren van sterk gezuiverde celpopulaties. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) is een methode bij uitstek om gezuiverde populaties van cellen van belang te verkrijgen. Lage opbrengsten worden echter bereikt wanneer de celpopulatie van belang zeer zeldzaam is. Verrijkingsprocedures zijn dus noodzakelijk. In dit protocol is gekozen voor een negatieve selectieprocedure met behulp van magnetische kralen.

<table><tbody><tr><td>21-gauge needles</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Antibody Gr-1-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody B220-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0452-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody Mac-1-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD3e-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0031-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD4-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-9766-82</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD5-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD8a-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0081-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody TER119-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD127-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody CD45-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody TER119-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5921-83</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody CD45-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0451-82</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody CD45-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody CD9-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0091-82</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody&nbsp; c-kit-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody Sca-1-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-83</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody CD16/32-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0161-83</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody CD150-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-1502-82</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Culture medium StemSpan-SFEM</td><td>Stemcell technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Dissection pad</td><td>Fisher Scientific</td><td>10452395</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>vWR Chemicals</td><td>83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Euronexia</td><td>P-120-AS</td><td></td></tr><tr><td>Glass pasteur pipette</td><td>Dutscher</td><td>42011</td><td></td></tr><tr><td>Magnet :&nbsp; DynaMag-5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Megacult</td><td>Stemcell technologies</td><td>#04970</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult SF M3436</td><td>Stemcell technologies</td><td>#03436</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Dutscher</td><td>50750-500</td><td></td></tr><tr><td>Red Cell Lysis solution</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Fisher Scientific</td><td>12308009</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Euronexia</td><td>C-165-ASB</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1 mL syringes</td><td>BD Bioscience</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Sterile tubes with 70&micro;m cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Sterile petri dish</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>554063</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Tube roller</td><td>Benchmark Scientific</td><td>R3005</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Beenmerg megakaryocyten zijn grote polyploïde cellen die zorgen voor de productie van bloedplaatjes. Ze ontstaan uit hematopoëtische stamcellen door megakaryopoiese. De laatste stadia van dit proces zijn complex en omvatten klassiek de bipotente Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) en de unipotente Megakaryocyte Progenitors (MKp). Deze populaties gaan vooraf aan de vorming van bonafide megakaryocyten en als zodanig zou hun isolatie en karakterisering de robuuste en onbevooroordeelde analyse van megakaryocytenvorming mogelijk kunnen maken. Dit protocol presenteert in detail de procedure om hematopoëtische cellen uit het beenmerg van muizen te verzamelen, de verrijking van hematopoëtische voorlopercellen door magnetische depletie en ten slotte een celsorteerstrategie die sterk gezuiverde MEP- en MKp-populaties oplevert. Eerst worden beenmergcellen verzameld uit het dijbeen, het scheenbeen en ook de iliacale kam, een bot dat een groot aantal hematopoëtische voorlopers bevat. Het gebruik van iliacale kambotten verhoogt het totale celaantal per muis drastisch en draagt zo bij aan een ethischer gebruik van dieren. Een magnetische afstammingsdepletie werd geoptimaliseerd met behulp van 450 nm magnetische kralen die een zeer efficiënte celsortering door flowcytometrie mogelijk maakten. Ten slotte presenteert het protocol de etiketterings- en gatingstrategie voor het sorteren van de twee sterk gezuiverde megakaryocytenvoorloperpopulaties: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) en MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright ). Deze techniek is eenvoudig te implementeren en biedt voldoende cellulair materiaal om i) moleculaire karakterisering uit te voeren voor een diepere kennis van hun identiteit en biologie, ii) in vitro differentiatietests, die een beter begrip zullen geven van de mechanismen van rijping van megakaryocyten, of iii) in vitro modellen van interactie met hun micro-omgeving.

Fenotypische analyse van de cellen geïdentificeerd als MEP en MKp werden uitgevoerd door middel van flowcytometrie. Cellen werden gelabeld met fluorescentie geconjugeerde antilichamen tegen CD41a en CD42c, klassieke markers van de megakaryocytische en bloedplaatjeslijn. Beide markers werden uitgedrukt door de cellen van de MKp-populatie, terwijl deze markers nog niet worden gedetecteerd aan het oppervlak van de cellen van de MEP-populatie (Figuur 4Ai, 4Aii). Polyploïdie is e...

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

De isolatie van belangrijke Megakaryocyte Progenitor-populaties maakt de fijne analyse van de afstammingshiërarchie in celcultuur op moleculaire assays mogelijk, tot op het niveau van één cel. Dit protocol combineert een meer ethische praktijk door het aantal benodigde dieren te minimaliseren, in een efficiënt proces voor het sorteren van cellen van MEP- en MKP-populaties. Voor bot, verzamel het lichaam van een acht tot 12 weken oude C57 zwarte zes muis, met 70% ethanol.Gebruik een schaar om een punt vijf tot één centimeter incisie van de huid te maken, loodrecht op de wervelkolom. En scheur de huid rond het hele lichaam, door het naar beneden te trekken. Plaats de muis met de voorkant naar beneden op het dissectiepad en lokaliseer vervolgens de bekkenbotten door vingers of scharen langs de blootgestelde wervelkolom van boven naar beneden te schuiven.Om de iliacale top te lokaliseren, identificeert u de kleine bult in het lumbale gebied in de buurt van de achterpoten. Na het plaatsen van de schaar parallel aan de wervelkolom, tegen de wervels en dicht bij de iliacale kuifbult, gaat u verder met het snijden van de spieren langs de zijkant van de wervelkolom boven het bekkenbot, door de schaar langs de wervels naar beneden naar de staart te schuiven. Snijd vervolgens tussen de wervels en de iliacale top en blijf zo dicht mogelijk bij de wervels.En snijd de resterende spieren om de ledemaat van het lichaam los te maken. Breng de losgemaakte ledematen over naar een schoon oppervlak. Nadat u de rest van het lichaam hebt weggegooid in overeenstemming met de institutionele richtlijnen, gebruikt u een tang en scalpels om de bekken-, femur- en tibiale botten bloot te leggen door het omliggende weefsel te verwijderen.Gebruik een tang om het distale uiteinde van het dijbeen vast te houden en ontwricht de heupkop voorzichtig van het bekkenbot door de spieren rond de articulatie voorzichtig te snijden met een scalpel. Schraap de resterende spier van het bekkenbot af en snijd in het midden van de holte die de heupkop vasthield. Houd het darmbeen en gooi de driehoekige dunne kant van het bot weg.Verwijder met behulp van een scalpel de resterende weefsels rond het darmbeen en plaats het gereinigde bot in steriel PBS aangevuld met 2% Newborn Calf Serum. Gebruik dan een schaar om de voet van het been bij de enkel af te knippen. Houd het onderste deel van het scheenbeen vast met de tang, schraap de spier omhoog naar de knie.Gooi het kuitbeen weg. Maak vervolgens een snede over het tibiale plateau met het scalpel en plaats het scheenbeen in steriele PBS 2% NBCS. Na het verwijderen van de resterende weefsels rond het dijbeen, houdt u de bovenzijde van het dijbeen vast met een tang en plaatst u het scalpelmes aan de basis van de knieschijf.Oefen een kracht uit op de knieschijf, parallel aan het dijbeen om de knieschijf los te maken. Plaats vervolgens het dijbeen, in steriel PBS 2%NBCS. Breng in een laminaire flowkast de botten over in een steriel petrischaaltje gevuld met steriele PBS 2%NBCS.Gebruik een scalpel om de kop van de dijbenen af te snijden. Vul een spuit van één milliliter met steriele PBS 2% NBCS en bevestig een naald van 21 gauge aan de uitlaat. Vul vervolgens een vijf milliliter polypropyleen buis met twee milliliter steriele PBS 2%NBCS.Houd het dijbeen met een tang vast, steek de naald in de groef links, na het verwijderen van de knieschijf door rotatie aan te brengen, ervoor te zorgen dat de naald volledig in het bot wordt ingebracht, tot aan de schuine kant. Breng na het inbrengen van de naald het bot met de naald over in de buis met twee milliliter PBS 2%NBCS. Geef vervolgens de PBS 2%NBCS af en adem deze op, vanaf de spuit totdat het bot helder is.Verwijder de naald uit het dijbeen en steek deze in het gat aan de andere kant, waar de dijbeenkop zat. Na het doseren en aspirateren van de buffer, gooit u het bot weg. Gebruik voor de iliacale kam en het scheenbeen een tang om het bot vast te houden en steek de naald voorzichtig in de open kant, door rotatie aan te brengen.Ervoor zorgen dat de naald volledig in het bot wordt ingebracht, tot aan de schuine kant. Breng vervolgens het bot met de naald over in de buis met twee milliliter PBS 2%NBCS. Dispenseer en aspirateer de PBS 2%NBCS uit de spuit totdat het bot helder is.Passeer alle celsuspensie door een celzeefdop van 40 micron, geplaatst op een steriele polystyreenbuis van vijf milliliter en voeg 500 microliter PBS 2% NBCS toe. Zet 100 microliter van de celsuspensie opzij als totaal beenmerg. Bewaar het vervolgens op ijs voor de kleuringsprocedure.Pellet de gefilterde suspensie door centrifugeren. Na het weggooien van het supernatant, resuspend de pellet in een vers bereide primaire antilichaamcocktail, met de incubatie op ijs, gedurende 30 tot 45 minuten. Zet 10 microliter van de celsuspensie opzij in een steriele polystyreenbuis van vijf milliliter, gelabeld met Lin Pores Fraction, en voeg 90 microliter PBS 2% NBCS toe.Bereid ondertussen een kraal voor op magnetische uitputting, door ze in de injectieflacon te resuspenderen, met grondige vortexing gedurende 30 seconden. Breng een volume kralen over dat overeenkomt met twee kralen per doelcel, in een polypropyleenbuis van vijf milliliter en was de kralen twee keer, met PBS 2% NBCS, door de buis op de magneet te plaatsen. Na het verwijderen van de wasbuffer met een steriele glazen pasteurpipet, resuspendeert u de kralen in 500 microliter steriele PBS 2% NBCS.Voeg voor de eerste stap van magnetische uitputting 250 microliter kralen toe aan de pellet van gewassen cellen en incubeer met zachte menging gedurende vijf minuten op ijs. Voeg vervolgens twee milliliter steriele PBS 2% NBCS toe, met voorzichtig mengen, en plaats de buis gedurende twee minuten in de magneet. Ga verder met het verzamelen van de niet-magnetische fractie met een steriele glazen pasteurpipet.En voor de tweede stap van magnetische uitputting, voeg het toe aan de resterende 250 microliter magnetische kralen. Plaats de buis afgesloten met paraffine op een buisrol, gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Voeg vervolgens twee milliliter steriele PBS 2% NBCS toe met zachte menging.En plaats de buis met de magneet gedurende twee minuten. Verzamel de niet-magnetische fractie in een steriele polypropyleenbuis van vijf milliliter, gelabeld, niet-magnetische Lin Neg Fraction, met een steriele glazen pastreurpipet, en ga verder met celsortering megakaryocytenvoorlopers, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voor de gating-strategie voor celsortering worden in de Lin Neg-populatie de cellen geselecteerd die C-kit tot expressie brengen en een lage tot geen expressie van Sca-1- of CD16/32-antigeen.In deze populatie worden MEP geïdentificeerd als CD150-positieve en CD9-dimcellen. De MKP als CD150 positief, en CD9 heldere cellen. In de representatieve flowcytometrieanalyse werden cellen geïdentificeerd als MEP en Mkp gelabeld met fluorescentie geconjugeerde antilichamen voor CD41a en CD42c klassieke markers van de megakaryocytische en bloedplaatjeslijn.Beide markers werden uitgedrukt door de cellen van de MKp-populatie en werden niet gedetecteerd aan het oppervlak van de cellen van de MEP-populatie. Het DNA-gehalte van de gesorteerde megakaryocyten toonde aan dat de cellen meestal 2n zijn voor de MEP-populatie. En een klein deel van de MKp-cellen is vreemd.Hogere ploïdiecellen werden niet significant gedetecteerd in deze populaties. In semi-solide clonogene assays werd CFU-MK gedetecteerd in zowel MEP- als MKp-populaties. BFU-E werd niet gedetecteerd in de MKp-populatie, maar gedetecteerd in MEP en de CD150-negatieve CD9 dimvoorlopercelpopulatie.Microscopische observatie op de derde dag van differentiatie toont aan dat MEP en MKp voornamelijk megakaryocyten produceerden, geïdentificeerd als grote cellen. Megakaryocyten verkregen na drie dagen cultuur, werden geïdentificeerd met behulp van CD41- en CD42c-expressie en vertegenwoordigen respectievelijk 54 en 82% van de cellen geproduceerd uit MEP- en MKp-celpopulaties. De ploïdie van de geproduceerde megakaryocyten was groter van de megakaryocyt afgeleid van de MKp-populatie, vergeleken met de MEP-populatie.Alleen de cellen afgeleid van de MKp-populatie waren in staat tot proplateletemissie, wat een meer gevorderd rijpingsstadium voor de MKp-populatie suggereert. Het gebruik van het bekkenbot neemt drastisch toe tot het celnummer, terwijl magnetische uitputting in twee stappen de werkzaamheid van de uitputting van de afstamming verbetert. Dit protocol maakt de daaropvolgende kweek van MEP- en MKp-populatie van afzonderlijke cellen mogelijk, die, samen met transcriptomische en proteomische analyse, zeker de betrokken mechanismen zullen moeten ontcijferen, biogenese moeten implementeren.

isolation-of-mouse-megakaryocyte-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Methode voor de enzymatische dissociatie, oppervlakte-etikettering en de zuivering door flowcytometrie van fibro / adipogenic en myogene voorlopercellen uit muizen skeletspieren.

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Hier presenteren we een protocol dat grote hoeveelheden muis-monocyten genereert uit heterogeen beenmerg voor translationele toepassingen. In vergelijking met andere methoden helpt deze nieuwe methode het aantal geofferde dieren te verminderen en de kosten te drukken door dure methoden zoals hooggradige magnetische celscheiding (MACS) te vermijden.

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, zeer reproduceerbaar protocol om Mesodermale Voorlopercellen (MPCs) te isoleren uit menselijk beenmerg (hBM). MPCs werden gekenmerkt door middel van flowcytometrie en nestine-expressie. Ze toonden het vermogen om aanleiding te geven tot exponentieel groeiende MSC-achtige celculturen terwijl ze hun angiogenesepotentieel behielden.

Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Hier beschrijven we de beenmergexplantmethode, van monstervoorbereiding tot microscopische dia-analyse, om het vermogen van megakaryocyten te evalueren die in hun fysiologische omgeving hebben gedifferentieerd om proplatelets te vormen.

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

Inmiddels wordt erkend dat de driedimensionale omgeving van cellen een belangrijke rol kan spelen in hun gedrag, rijping en/of differentiatie. Dit protocol beschrijft een driedimensionaal celkweekmodel dat is ontworpen om de impact van fysieke insluiting en mechanische beperkingen op megakaryocyten te bestuderen.

Megakaryocytencultuur in 3D-hydrogel op basis van methylcellulose om de celrijping te verbeteren en de impact van stijfheid en opsluiting te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

Deze studie heeft een stabiele en efficiënte methode vastgesteld voor de isolatie, kweek en functionele bepaling van CD34+ stamcellen in de vaatwand (CD34+ VW-SC's). Deze gemakkelijk te volgen en tijdbesparende isolatiemethode kan door andere onderzoekers worden gebruikt om de mogelijke mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij hart- en vaatziekten.

Immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner CD34+ stamcellen van muizen

Leer een efficiënte methode voor het isoleren van muizen megakaryocyt voorlopers (MEP en MKp) uit beenmerg met behulp van magnetische depletie en flowcytometrie. Dit protocol verhoogt de celopbrengst en vermindert diergebruik.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Meer video's verkennen