Leukodepletiefilters-afgeleide CD34 + -cellen als een celbron om megakaryocytendifferentiatie en bloedplaatjesvorming te bestuderen

Dit protocol stelt een eenvoudige methode voor voor het verkrijgen van menselijke hematopoietische voorlopers en voor het induceren van hun differentiatie in megakaryocyten. Het kan dienen als basis voor een beter begrip van megakaryopoiese Deze techniek maakt gebruik van een bron, maar biedt het voordeel dat het betaalbaar en overvloedig is voor laboratoriumonderzoek naar hematopoëse. Deze methode wordt gebruikt om megakaryopoiese beter te begrijpen voor de cel die moet worden gebruikt in therapie die ze moeten worden voorbereid in de GMP-omstandigheden, wat momenteel niet het geval is.

Het begrijpen van de stappen inclusief PBMC-verzameling kan alleen volledig worden voltooid met een visuele demonstratie. Voordat u met een experiment begint, sluit u een leukoreductiefilter aan op een lege transferzak van 600 milliliter en op een slangenset. Injecteer in een bioveiligheidskast 25 milliliter gefilterde elutiebuffer per leukoreductiefilter in de lege zak en gebruik een spuit van 30 milliliter om de inhoud van de zak voorzichtig door het filter te zuigen.

Breng de verzamelde rode bloedcellen over in een nieuwe buis van 50 milliliter en verdun de celsuspensie met de helft met 2% dextran. Meng goed om de bloedcellen te aggregeren en laat de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bezinken. Wanneer de rode bloedcellen zijn bezonken, breng het supernatant over naar een buis van 50 milliliter en vul de buis met twee millimolaire PBS EDTA-oplossing.

Leg voorzichtig de helft van het supernatant op 25 milliliter dichtheidsgradiëntmedium in elk van de twee buizen van 50 milliliter zonder het gradiëntoppervlak te verstoren en scheid de cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Gebruik een wegwerppipet om de cellen van elke interface over te brengen naar een nieuwe buis van 50 milliliter. Was de cellen twee keer in 50 milliliter van twee millimolaire PBS EDTA per wasbeurt.

Na de tweede wasbeurt, resuspend de pellets in een enkel volume van 50 milliliter verse PBS EDTA voor het tellen. Hier is het mogelijk om de procedure te stoppen door de verzamelde cellen 's nachts op vier graden Celsius te houden. Voor CD34+celselectie, bepaal het celnummer en verzamel de cellen door centrifugeren en resuspend de celkorrel in 300 microliter van twee millimolar PBS EDTA per 10 tot de achtste cellen.

Voeg het juiste volume FC-receptorblokkerend reagens en 50 microliter CD34 microparels per 10 toe aan de achtste cellen. Was na 30 minuten bij vier graden Celsius de cellen met twee millimolaire PBS EDTA en resuspend de pellet in 500 microliter verse twee millimolaire PBS EDTA, per 10 tot de acht cellen. Bevochtig de magnetische kolom en plaats de juiste grootte met PBS EDTA en voeg vervolgens het monster toe aan de kolom.

Was de kolom twee keer met drie milliliter van twee millimol PBS EDTA per wasbeurt. Alvorens de CD34+-cellen te ontwijken, met twee volumes van vijf milliliter van twee millimolaire PBS EDTA per elutie. Om de zuiverheid van de geselecteerde magnetische kraalcellen te beoordelen, voegt u twee microliter van een geschikt menselijk anti-CD34-antilichaam toe aan een aliquot van 100 microliter van de geïsoleerde cellen en mengt u ruim voordat u gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius broedt.

Was na incubatie de cellen in PBS en resuspend de pellet in 200 microliter PBS voor analyse van de zuiverheid van het celmonster door middel van flowcytometrie. Verzamel na het tellen de CD34+-cellen door middel van centrifugering en resuspend de pellet onmiddellijk in koude oplossing één tot een dichtheid van 10 tot de zes cellen per milliliter voordat u de celsuspensie snel toevoegt aan koude oplossing twee. Plaats de cryobuis vervolgens onmiddellijk 24 uur in een vriezer van min 80 graden Celsius voordat de cryobuis wordt overgebracht naar opslag van vloeibare stikstof.

In deze representatieve studie werden de cellen teruggewonnen door leukoreductiefiltratie zoals aangetoond met een levensvatbaarheid van ongeveer 95%. Na magnetische kraalselectie werd een meer dan 90% zuivere CD34+celpopulatie verkregen. Celproliferatie neemt meestal af na een week cultuur, maar zonder significante veranderingen in de levensvatbaarheid van de cel.

Op dag zeven zouden de CD34+-cellen moeten beginnen met het tot expressie brengen van CD41, een specifieke en vroege marker of voor de ontwikkeling van megakaryocyten en bloedplaatjes. Op dag 10 ontwikkelt de meerderheid van de cellen in de kweek zich meestal tot volwassen CD41 die megakaryocyten tot expressie brengen. Op dag 13 kunnen megakaryocyt pro bloedplaatjesverlenging en bloedplaatjesafgifte worden waargenomen door lichtmicroscopie.

Het totale aantal CD41, CD42, 8 positieve bloedplaatjes dat in de cultuur vrijkomt, kan vervolgens worden gekwantificeerd met behulp van een gekalibreerd aantal fluorescerende kralen. Deze methode maakt de weg vrij voor het verbeteren van de onderliggende mechanismen van megakaryopoiese en voor het verhogen van de opbrengst van bloedplaatjes in het visuele. Zelfs als deze methode vervelend lijkt, is het heel eenvoudig dat je gewoon geduldig moet zijn en alle regio's van tevoren moet voorbereiden.

Hoewel onze kritieke zorgen megakaryopoiese we verkrijgen CD42 cellen kunnen worden gebruikt in over hematopoietische paden.