Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

Het algemene doel van deze procedure is om in realtime de vorming van proplatelet uit muis megakaryocyten te volgen, die in hun oorspronkelijke omgeving zijn gerijpt. Deze methode heeft het voordeel dat het eenvoudig, reproduceerbaar en snel is. Men kan veel megakaryocyten analyseren en de vorming van proplatelets in slechts zes uur visualiseren, in plaats van te wachten op de eerste dag van de kweek zoals voor muis megakaryocyten in vitro.

Een interessante toepassing van deze methode is een mogelijkheid om het effect van de farmaceutische behandeling of genetische mutatie te bestuderen, met name in de stap van proplatelet extensie. Hier is er geen interferentie met het differentiatieproces, zoals in het geval van in-vitrocultuur. Deze video helpt deze belangrijke stappen van het spoelen en snijden van het beenmerg te garanderen.

Er wordt ook uitgelegd hoe de morfologie en megakaryocyten moeten worden geclassificeerd, wat echt nuttig is voor de karakterisering van defecten bij trombofiele aandoeningen. Om te beginnen, verwarm de buffer van Tyrode op 37 graden Celsius en zet de verwarmingskamer van de microscoop aan om de temperatuur op 37 graden Celsius te brengen. Bereid alle benodigde gereedschappen voor, zoals een timer, incubatiekamers, vijf milliliter 21 gauge spuiten, tang, een scheermesje, Pasteur pipetten, glazen dia's en 15 milliliter centrifugebuis.

Spoel het beenmerg met twee milliliter Tyrode's buffer door een naald van 21 gauge in de opening van het dijbeen aan de kniezijde te brengen en druk langzaam op de zuiger om een intacte mergcilinder te halen. Gebruik een plastic pipet van drie minuten om het intacte beenmerg voorzichtig en voorzichtig op een glazen dia over te brengen. Snijd de uiteinden van het merg af die mogelijk zijn samengedrukt op het moment van de spoeling.

Snijd vervolgens dunne transversale secties van 0,5 millimeter dikte met behulp van een scherp scheermesje om beschadiging van de megakaryocyten te voorkomen. Verzamel met behulp van een plastic pipet 10 secties in een buis van één milliliter met de buffer van Tyrode. Breng de secties voorzichtig over naar een incubatiekamer met een diameter van 13 millimeter.

Zuig de buffer op en stel het volume in op 30 microliter van Tyrode's buffer aangevuld met 5%muizenserum. Plaats de secties op een afstand. Sluit de zelfklevende kamer af met een afdekslip van 22 bij 55 millimeter, waarbij de afdekslip wordt hellend om de vorming van luchtbellen te voorkomen.

Plaats de kamer in de verwarmingskamer bij 37 graden Celsius. Start de chronometer en voer het experiment zes uur lang uit bij 37 graden Celsius, maak video's om de transformatie van de megakaryocyten vast te leggen. Na 30 minuten migreren de mergcellen geleidelijk naar de periferie van de explant en vormen ze een monolaag.

Na een uur incubatie kunnen megakaryocyten worden geïdentificeerd aan de hand van hun grote omvang en polylobulated kernen. Het aantal megakaryocyten neemt toe na drie uur incubatie en sommige hebben lange verlengingen. Teken een kaart om elke sectie in de incubatiekamer te lokaliseren.

Identificeer na een uur de zichtbare megakaryocyten, die gigantische polylobulated cellen zijn aan de periferie van elke sectie, en plot hun posities op de tekening. Herhaal deze procedure na drie en zes uur. Megakaryocyten worden handmatig geteld en geclassificeerd volgens hun morfologie op drie en zes uur na het afdichten van de incubatiekamer.

Ze zijn geclassificeerd als klein, groot met dikke intentie en proplatelet uitschuivend. Met behulp van mapping kan hun evolutie in de loop van de tijd worden gevolgd. De resultaten worden uitgedrukt als een percentage van elke klasse op elk observatietijds tijdstip.

Klassiek strekt de helft van de megakaryocyten die zichtbaar zijn aan de periferie proplatelets uit na zes uur voor wild type muisbeenmerg. Het lot van ronde megakaryocyten werd gevolgd door het vastleggen van sequentiële beelden in de loop van de tijd om in beeld te krijgen hoe ze proplatelets vormen. Een belangrijk ding om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om de explants op 37 graden Celsius te houden voor de duur van het experiment.

Een andere temperatuur kan de resultaten veranderen. Interessant is dat het explant-protocol kan worden gebruikt na introverte microscopie-experimenten. Uiteindelijk zullen de megakaryocyten in de beenmergexplantaten van nature fluorescerend zijn en kan hun gedrag gemakkelijk worden onderzocht.

Dit maakt het mogelijk om verschillende behandelingen op dezelfde dieren te combineren en zo het aantal muizen te verminderen. Kortom, de explantmethode is snel, eenvoudig en biedt veel informatie over de capaciteit van natuurlijke megakaryocyten aan externe proplatelets. De resulterende kwalitatieve en kwantitatieve bevinding zijn de sleutel tot ons begrip van trombofiele ziekte.

in een fysiologische of pathologische context.