Name: In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer twee-foton microscopie voor in vivo beeldvorming van megakaryocyten en proplatelets in het schedelbeenmerg van muizen. Deze methode maakt real-time kwantificering van plaatjesproductie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Oostenrijk) bedanken voor zijn deskundige advies over twee-fotonmicroscopie-experimenten op het moment dat we de techniek in het laboratorium vestigden, en Yves Lutz van het Imaging Center IGBMC / CBI (Illkirch, Frankrijk) voor zijn expertise en hulp met de twee-fotonenmicroscoop. We danken ook Jean-Yves Rinkel voor zijn technische hulp en Ines Guinard voor de tekening van het schema in figuur 1. Wij danken ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) voor haar steun bij de aankoop van de twee-fotonenmicroscoop. AB werd ondersteund door postdoctorale beurzen van Etablissement Français du Sang (APR2016) en van Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+kinase+2+%28Sphk2%29+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li>
<li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1alpha+induces+thrombopoiesis+through+megakaryocyte+rupture+in+response+to+acute+platelet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs.</a> Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>Potts, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+budding+is+a+major+mechanism+of+in+vivo+platelet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li>
<li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li>
<li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361(2012).</li>
<li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127(2017).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li>
<li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

De mechanismen van bloedplaatjesvorming zijn sterk afhankelijk van de beenmergomgeving. Vandaar dat intravitale microscopie een belangrijk hulpmiddel in het veld is geworden om het proces in realtime te visualiseren. Muizen met fluorescerende megakaryocyten kunnen worden verkregen door muizen die de Cre-recombinase in megakaryocyten tot expressie brengen, te kruisen met floxed reportermuizen die een voorwaardelijke fluorescerende genexpressiecassette bevatten. Hier werden mTmG reporter muizen gebruikt (B6.129(Cg)-Gt(...

Bloedplaatjes worden geproduceerd door megakaryocyten-gespecialiseerde cellen in het beenmerg. De precieze manier waarop megakaryocyten bloedplaatjes in de bloedsomloop afgeven, is lang onduidelijk gebleven vanwege de technische uitdaging bij het observeren van real-time gebeurtenissen door het bot. Twee-fotonenmicroscopie heeft geholpen deze uitdaging te overwinnen en heeft geleid tot grote vooruitgang in het begrijpen van het proces van de vorming van bloedplaatjes. De eerste in vivo megakaryocytenwaarnemingen werden gedaan door von Andrian en collega's in 2007, met de visualisatie van fluorescerende megakaryocyten door de schedel1. Dit was mogelijk omdat de botlaag in de frontoparietale schedel van jongvolwassen muizen een dikte heeft van enkele tientallen micron en voldoende transparant is om visualisatie van fluorescerende cellen in het onderliggende beenmerg mogelijk te maken2.
De daaropvolgende studies pasten deze procedure toe om de vorming van proplaatjes onder verschillende omstandigheden te evalueren en de onderliggende mechanismen3,4,5,6te ontcijferen. Deze studies leverden definitief bewijs dat megakaryocyten dynamisch uitsteeksels, proplatelets genaamd, verlengen door de endotheelbarrière van de sinusoïde vaten(figuur 1). Deze proplatelets komen vervolgens vrij als lange fragmenten die enkele honderden bloedplaatjes in volume vertegenwoordigen. De bloedplaatjes zullen worden gevormd na de remodellering van de proplatelets in de microcirculatie van stroomafwaartse organen, met name in de longen7. Tot op heden blijven het precieze proces en de moleculaire mechanismen echter onderwerp van discussie. De voorgestelde rol van de cytoskeletale eiwitten in de verlenging van proplatelets verschilt bijvoorbeeld tussen in vitro en in vivo omstandigheden3, en verschillen in proplateletvorming zijn aangetoond onder inflammatoire omstandigheden6. Om de zaken nog ingewikkelder te maken, betwistte een recente studie het proplatelet-gedreven concept en stelde voor dat in vivo, bloedplaatjes in wezen worden gevormd door een membraan-ontluikend mechanisme op het megakaryocytenniveau8.
Dit artikel presenteert een protocol voor de observatie van megakaryocyten en proplatelets in het beenmerg uit het schedelbot bij levende muizen, met behulp van een minimaal invasieve procedure. Soortgelijke benaderingen zijn eerder beschreven om andere mergcellen te visualiseren, met name hematopoëtische stam- en voorlopercellen9. De focus ligt hier op de observatie van megakaryocyten en bloedplaatjes om enkele parameters te beschrijven die kunnen worden gemeten, met name proplatelet morfologieën en bloedplaatjessnelheid. Dit protocol presenteert hoe een katheter in de halsader kan worden ingebracht om fluorescerende tracers en geneesmiddelen te injecteren en door het schedelbot te observeren. Het calvariale bot wordt blootgesteld met behulp van een kleine operatie, zodat een ring aan het bot wordt gelijmd. Deze ring dient om het hoofd te immobiliseren en bewegingen als gevolg van ademhaling te voorkomen en een beker gevuld met zoutoplossing te vormen als het onderdompelingsmedium van de lens. Deze techniek is zeer geschikt om i) in realtime de sinusoïde geometrie en megakaryocyten te observeren die interageren met de vaatwand; ii) volg megakaryocyten in het proces van proplateletvorming, verlenging en afgifte; en iii) meet bloedplaatjesbewegingen om de complexe sinusoïde bloedstroom te controleren. Gegevens verkregen met behulp van dit protocol zijn onlangs gepubliceerd3.

<table><tbody><tr><td>GNU Octave software</td><td>GNU Project</td><td></td><td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp;Histoacryl 5 x 0, 5 mL</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>injectable oplossing van chirurgische lijm</td></tr><tr><td>HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>GNU project</td><td></td><td>Minimale vereiste versie</td></tr><tr><td>Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL</td><td>Boehring</td><td>03661103003199</td><td>oogbescherming</td></tr><tr><td>Leica SP8 MP DIVE microscoop uitgerust met een 25x waterobjectief, numerieke opening van 0,95</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>gelijktijdige excitatie van AlexaFluor-488 en Qtracker-655</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr><tr><td>Ocrygel 10 g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td><td>03700454505621</td><td>Blauwe en gele siliconen tandpasta</td></tr><tr><td>Picodent twinsin speed</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 vasculair label</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>injecteerbare oplossing</td></tr><tr><td>Resonant scanner, 8 of 12 kHz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Xylazine 2% fl/25 mL</td><td>Bayer</td><td>04007221032311</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td></td><td></td><td>om de ring aan het bot te lijmen</td></tr><tr><td>Surflo IV katheter - Blauw 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saph pulserende laser (Coherent) (femtoseconde)</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo twee-foton beeldvorming van megakaryocyten en proplatelets in de muis schedel beenmerg

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Bloedplaatjes worden geproduceerd door megakaryocyten, gespecialiseerde cellen in het beenmerg. De mogelijkheid om megakaryocyten in realtime en hun oorspronkelijke omgeving in beeld te brengen, werd meer dan 10 jaar geleden beschreven en werpt nieuw licht op het proces van bloedplaatjesvorming. Megakaryocyten strekken langwerpige uitsteeksels, proplatelets genoemd, uit door de endotheelbekleding van sinusoïde bloedvaten. Dit artikel presenteert een protocol om gelijktijdig in real time fluorescerend gelabelde megakaryocyten in het beenmerg en sinusvormige bloedvaten van de schedel in beeld te geven. Deze techniek is gebaseerd op een kleine operatie die de schedel intact houdt om ontstekingsreacties te beperken. De muizenkop wordt geïmmobiliseerd met een ring die op de schedel is gelijmd om te voorkomen dat bewegingen ademen.
Met behulp van twee-fotonenmicroscopie kunnen megakaryocyten tot een paar uur worden gevisualiseerd, waardoor celuitsteeksels en proplatelets kunnen worden geobserveerd tijdens het proces van verlenging in sinusoïde vaten. Dit maakt de kwantificering mogelijk van verschillende parameters met betrekking tot de morfologie van de uitsteeksels (breedte, lengte, aanwezigheid van vernauwingsgebieden) en hun rekgedrag (snelheid, regelmaat of aanwezigheid van pauzes of retractiefasen). Deze techniek maakt ook gelijktijdige registratie van circulerende bloedplaatjes in sinusoïde vaten mogelijk om de snelheid van de bloedplaatjes en de richting van de bloedstroom te bepalen. Deze methode is bijzonder nuttig om de rol van genen van belang bij de vorming van bloedplaatjes met behulp van genetisch gemodificeerde muizen te bestuderen en is ook vatbaar voor farmacologische tests (bestudeer de mechanismen, evalueer geneesmiddelen bij de behandeling van bloedplaatjesproductiestoornissen). Het is een waardevol hulpmiddel geworden, vooral als aanvulling op in vitro studies, omdat het nu bekend is dat in vivo en in vitro proplateletvorming afhankelijk zijn van verschillende mechanismen. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat in vitro microtubuli nodig zijn voor proplatelet elongatie op zich. In vivodienen ze echter eerder als een steiger, waarbij de verlenging voornamelijk wordt bevorderd door bloedstroomkrachten.

Met behulp van dit protocol werd de fluorescerende tracer, Qtracker-655, intraveneus toegediend om anastomosed merg sinusoïde vaten in het schedelbeenmerg en de stroomrichting zoals weergegeven door de pijlen in beeld te brengen(Figuur 4A, links). Met behulp van mTmG-muizen werden eGFP-fluorescerende bloedplaatjes geregistreerd over 20 s in elke vaattak, en hun snelheid werd gemeten met behulp van ImageJ en GNU Octave software(Figuur 4A,rechts). Let op de hetero...

We beschrijven hier de methode voor het afbeelden van megakaryocyten en proplatelets in het merg van het schedelbot van levende muizen met behulp van twee-fotonenmicroscopie.

In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Deze methode maakt het mogelijk om in realtime verschillende gebeurtenissen te visualiseren, die plaatsvinden in het beenmerg van de schedelmuis, zoals megakaryocyten, die proplatelets in de sinusoïde vaten verlengen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een kleine operatie die nodig is om de ontstekingsreactie te minimaliseren, waardoor een in vivo visualisatie van gebeurtenissen in de bijna fabrieksomstandigheden mogelijk is. Vervoer de muis om te beginnen naar de beeldvormingsruimte.Schakel de microscoop en computer in en stel de vereiste parameters in. Zodra de muis volledig is verdoofd, plaatst u de muis op een verwarmde plaat, verwarmd tot 37 graden Celsius voor alle volgende manipulaties, scheert u de kop en keel van de muis en breng u de gel aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Plaats de muis op zijn rug en bevestig de voorste benen met chirurgische tape om de keel te strekken.Maak na het desinfecteren van de keel een incisie van 0,7 tot 1 centimeter over de rechter- of linker halsader met behulp van een schaar en strek het aangrenzende bindweefsel uit om de externe jongleerader bovenop de borstspier bloot te leggen. Vul de katheter met warme, steriele fysiologische zoutoplossing. Penetreer de katheter door de borstspier en breng de katheter vervolgens in de ader in.Verwijder voorzichtig de naald, sluit de spuit aan op de fluorescerende tracers en injecteer het dode volume van de katheter. Plaats een druppel chirurgische lijm om de katheter te stabiliseren. Breng de muis voorzichtig terug naar een liggende positie.Desinfecteer de hoofdhuid met 70% ethanol met een papieren handdoek terwijl je het losse haar verwijdert. Gebruik steriele fijne scharen en pincetten om een T-vormige incisie te maken op de middellijn tot één centimeter tussen de oren op de hoofdhuid om het calvarium bloot te leggen. Belicht de schedel met een pincet en gebruik vervolgens een schaar en pincet om het botvlies voorzichtig te verwijderen.Gebruik een steriel wattenstaafje gedrenkt en fysiologische zoutoplossing om al het periosteum en eventuele vuil of haren te verwijderen die de beeldvorming kunnen veranderen. Spoel de schedel met zoutoplossing om eventuele bloedsporen te verwijderen en droog het bot snel met een wattenstaafje. Breng de lijmgel aan op de ring, plaats de ring op het blootgestelde bot en houd deze een paar seconden vast om de ring stevig aan de schedel te laten hechten.Bevochtig de schedel lichtjes met een zoutoplossing met wattenstaafje. Bereid de siliconen tandpasta door de blauwe en gele componenten zorgvuldig te mengen in een één-op-één verhouding. Sluit de ring af door de tandpasta aan te brengen om lekkage tijdens het afbeelden te voorkomen.Verwijder voorzichtig alle tandpasta of lijm die mogelijk in de ring is gekomen. Vul vervolgens de ring met zoutoplossing om de lekkage te controleren. Plaats de muis op de steun en plaats een gevouwen kompres onder het hoofd van het dier om het hoofd op te tillen en te voorkomen dat de ring van de schedel loskomt wanneer deze aan de houder is bevestigd.Schroef de ring op de blokhouder. Plaats de ondersteuning en muisassemblage in de verwarmde microscoopkamer. Stel de juiste lasergolflengten in voor de gekozen vier viertallen en herstel van de uitgezonden lichten.Injecteer met behulp van de inter jongleerkatheter 50 microliter 0,2 micromolaire oplossing van de fluorescerende tracer om de vasculatuur te labelen. Plaats het microscoopstadium met de steun en muis onder het objectief van de microscoop. Zorg ervoor dat de ring altijd gevuld is met zoutoplossing en vul deze indien nodig bij en dompel het objectief en de zoutoplossing onder.Gebruik epifluorescentie om de beenmergvaten te lokaliseren en observeer de megakaryocyten die langs de sinusoïde vaten zijn uitgelijnd. Voor lange overnames kunt u een 3D-ruimtetijdacquisitie opzetten met een beeld van 384 bij 384 pixels met behulp van een Hertz-resonantiescanner van acht kilo en een bidirectionele modus. Gebruik lijngemiddelden met een goede resolutie, kies vervolgens de geoptimaliseerde Z-stapgrootte en stel het tijdsinterval in dat nodig is voordat de acquisitie wordt gestart.Kies voor korte en snelle acquisities een ruimte, tijdacquisitietype en minimaliseer de afbeeldingsgrootte. Pas indien nodig het beeld aan het vat aan door het beeldvormingsveld te roteren. Gebruik de hoogst beschikbare scansnelheid en bidirectioneel scannen.Minimaliseer het lijnmiddeling om het optimale compromis te vinden tussen beelddefinitie en snelheid van de acquisitie. Koop slechts één Z-plan en minimaliseer het tijdsinterval voor acquisitie. Voor het meten van de bloedplaatjessnelheid zou 10 tot 20 seconden acquisitie voldoende moeten zijn.De fluorescerende tracer werd intraveneus toegediend om de anastomosed merg sinusoïde vaten in het schedelbeenmerg in beeld te brengen, met de stroomrichting weergegeven door de pijl. De fluorescerende bloedplaatjessnelheid werd geregistreerd in elke vaattak en variatie werd waargenomen. De sinusoïde vaten vertonen complexe stromen als gevolg van de anastomosen, met de aanwezigheid van stroomreflow en zelfs stasis.Pijlen gaven de tegenovergestelde stroomrichting aan bij de bifurcatie. De snelheid van de bloedplaatjes werd ook gemeten voor linker- en rechtervattakken die in de loop van de tijd onregelmatigheid aangaven in elke scheepstak met fasen van versnelling, stasis en vertraging. Verschillende morfologieën van proplatelets werden waargenomen, waaronder proplatelets met onregelmatige marges, Then en longed proplatelets en dikke en korte proplatelets.Wanneer megakaryocyten de proplatelets uitbreidden in de gebieden van complexe stromingen, woelden de proplatelets van de ene vaattak naar de andere, afhankelijk van de stroomrichting. Bij het stoppen van de bloedstroom ontspanden de proplatelets en onderging de muis onverwacht een hartstilstand, wat het belang van hydrodynamische krachten bij proplatelet-rek aangaf. De breedte en lengte van de proplatelets werden ook gemeten met een gemiddelde breedte van 5,2 micrometer en een gemiddelde maximale lengte van ongeveer 185 micrometer werden waargenomen.Het uitzetten van de proplateletlengte als functie van de tijd maakt de visualisatie van het gedrag van proplatelets mogelijk tijdens fasen van rek, stasis of zelfs terugtrekking. De gemiddelde reksnelheid van ongeveer 10 micrometer per minuut werd waargenomen. Installatie van de katheter, maakte de injectie van geneesmiddelen mogelijk om de effecten op proplateletvorming of andere gebeurtenissen van belang in realtime te bestuderen.

in-vivo-two-photon-imaging-megakaryocytes-proplatelets-mouse-skull

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we describe a surgical procedure to implant a cranial ring assembly on the exposed skull bone and further immobilize the mouse’s head for high-resolution brain imaging for a long duration.

Cranial Ring Assembly Installation in Mouse Model: A Surgical Procedure to Implant Visualization Window Assembly on Murine Skull for High-resolution Skull Bone Marrow Imaging

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Tracking muisbeenmerg Monocyten<em&gt; In Vivo</em

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Het protocol beschrijft een nieuw model voor een muis dijbeenraamkamer dat kan worden gebruikt om de beweging van cellen in het beenmerg in vivo te volgen. Intravitale multifotonfluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om drie componenten van het dijbeenmerg (vaatstelsel, collageenmatrix en neutrofielen) in de tijd te beeldvormen.

Dijbeen Window Chamber Model voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Hier presenteren we een protocol om de ultrastructuur van de megakaryocyten in situ te analyseren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Murine beenmerg wordt verzameld, gefixeerd, ingebed in epoxyhars en gesneden in ultradunne secties. Na contrastkleuring wordt het beenmerg waargenomen onder een TEM-microscoop bij 120 kV.

In situ Exploratie van Murine Megakaryopoiesis met behulp van Transmissie ElektronenMicroscopie

Hier beschrijven we de beenmergexplantmethode, van monstervoorbereiding tot microscopische dia-analyse, om het vermogen van megakaryocyten te evalueren die in hun fysiologische omgeving hebben gedifferentieerd om proplatelets te vormen.

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

Intravitale microscopie maakt het mogelijk om dynamische biologische processen zoals weefselregeneratie en tumorontwikkeling te bestuderen. Het calvariale beenmerg, een zeer dynamisch weefsel, biedt inzicht in hematopoëse en vasculaire functie. Het gebruik van een biocompatibel 3D-geprint hoofdfixatie-implantaat maakt repetitieve longitudinale beeldvorming mogelijk, waardoor ons begrip van weefseldynamiek en de micro-omgeving van de tumor wordt verbeterd.

Intravitale longitudinale beeldvorming van vasculaire dynamiek in het calvariale beenmerg

Leer twee-foton microscopie voor in vivo beeldvorming van megakaryocyten en proplatelets in het schedelbeenmerg van muizen. Deze methode maakt real-time kwantificering van plaatjesproductie mogelijk.

In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg

Meer video's verkennen