Beeldvorming en kwantificering van intacte neuronale dendrieten via CLARITY Tissue Clearing

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om belangrijke vragen te beantwoorden over neuronale patronen van connectiviteit en ruimtelijke organisatie die ten grondslag liggen aan de functie binnen een circuit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het visualisatie mogelijk maakt van neuronale morfologieën die zich diep in intact driedimensionaal weefsel bevinden. Deze methode is eenvoudig en dus gemakkelijk reproduceerbaar.

Beginnende experimentatoren moeten zich comfortabel voelen bij het uitvoeren van deze techniek. Het is noodzakelijk om een duidelijk weefselmonster te hebben om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen. De visuele demonstratie van geschikte weefselhelderheid en clearingtechnieken zal gemakkelijk reproduceerbare resultaten mogelijk maken.

Plaats om te beginnen het hydrogel-ondergedompelde hersenweefsel gedurende drie uur in een vacuümincubator bij 37 graden Celsius met min 90 kilopascal vacuüm. Laat de bovenkant van de buis losgeschroefd zodat het vacuüm zich goed kan vormen. Was het doekje met PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur met zacht schudden.

Plaats het gepolymeriseerde weefselmonster in de elektroforesekamer en houd de oriëntatie van het weefsel in de kamer bij. Vul de kamer en het reservoir met de meegeleverde elektroforese SDS-buffer. Voer het monster uit op 70 volt, één ampère en 35 graden Celsius met constante stroom gedurende ongeveer twee uur per milliliter weefsel.

Controleer het monster regelmatig op voldoende opruiming van hersenweefsel door het uit de kamer te verwijderen en in dezelfde richting te vervangen. Nadat het monster is opgeruimd, wast u het 's nachts in PBS op kamertemperatuur en vervangt u de PBS zo vaak mogelijk door verse PBS. Na de laatste wasbeurt in PBS, was het weefsel gedurende vijf minuten drie keer in gedeioniseerd water op kamertemperatuur.

Het weefsel wordt ondoorzichtig en kan uitzetten. Incubeer het weefsel in de refractieve index matching oplossing gedurende ten minste vier uur bij kamertemperatuur. Bouw tijdens de incubatie een geschikte behuizingskamer om het monster in beeld te geven.

Begin met het gebruik van een glazen schuif als basis voor montage, leg vervolgens rubberen of plastic afstandhouders neer en bevestig ze met superlijm, zorg ervoor dat er geen gaten zijn. Plaats het heldere weefsel in de montagekamer die vooraf is gevuld met een oplossing voor het matchen van brekingsindexen. Monteer het weefsel stevig door er een glazen afdekplaat op te leggen en deze af te dichten met nagellak.

Stel dit weefsel voor door een druppel brekingsindex die overeenkomt met de montageoplossing direct op het glas toe te voegen. Om een grote weefselbeeldvormingskamer te bouwen voor weefsels met een dikte van meer dan vijf millimeter, gebruikt u een glazen schaal van 10 centimeter met een hoge wand. Plaats een conische buis van 50 milliliter in het midden en zorg ervoor dat de diameter van de buis groot genoeg is om de loop van de gebruikte objectieflens te accepteren.

Maak 3% agarose in water en giet het in de ruimte tussen de glazen schaal en de conische buis en laat het vervolgens een uur afkoelen. Dit vormt een ring van vaste agarose. Hecht het weefsel stevig aan de onderkant van de kamer met behulp van superlijm en vul de kamer met een brekingsindex-bijpassende oplossing, die kan beginnen te polymeriseren tenzij bewaard uit lucht en opgeslagen bij vier graden Celsius.

Verkrijg het beeld met behulp van een confocale microscoop. Schakel alle relevante beeldapparatuur in. Plaats het monster op het podium.

Benader de onderdompelingsmedia zorgvuldig met het doel en vorm een continue kolom van media. Zoek met behulp van epifluorescentie een geschikt beeldvormingsveld. Begin met het instellen van de instellingen voor resolutie en scansnelheid.

Als u een confocale microscoop afbeeldt, sluit u het gaatje volledig om het kleinste optische gedeelte en dus de beste Z-resolutie te verkrijgen. Verhoog geleidelijk het laservermogen of de sensorverkrachting totdat een geschikt beeld wordt verkregen met een hoge signaal-ruisverhouding. Als u standaard EGFP of tdTomato tweekleurenbeeldvorming gebruikt, stelt u de instellingen voor lichtverzameling in.

Stel de Z-stack parameters in op basis van het waargenomen begin- en eindpunt van het weefsel. Stel de stapgrootte in op basis van de gewenste Z-resolutie. Kleinere stapgroottes leveren een grotere Z-resolutie op, maar kunnen leiden tot het bleken van monsters.

Wanneer u tevreden bent met de instellingen voor beeldacquisitie, verwerft u de afbeelding. Zorg ervoor dat het beeld een hoge signaal-ruisverhouding heeft en duidelijke grenzen van structuren vertoont. Na beeldacquisitie werd de representatieve celmorfologie geanalyseerd met behulp van ingebedde statistieken en het classificeren van scripts binnen de analysesoftware.

De verzamelde gegevens weerspiegelen dat Neuron 2 een grotere dan dendritische structuur heeft met een hogere dichtheid van stekels in vergelijking met Neuron 1. Om dit resultaat te onderbouwen, werd standaard Scholl-analyse uitgevoerd, die bevestigt dat Neuron 2 dendritisch complexer is dan Neuron 1, zoals aangegeven door het toegenomen aantal Scholl-kruispunten op 50 tot 100 micrometer van de soma. Neuron 1 bevat een groter deel van de stekels met meer filopodia-achtige vormen en is een onvolgroeid wervelkolomsubtype.

Stekels met gedefinieerde hoofden, paddenstoelstekels genoemd, bevatten waarschijnlijk meer ontwikkelde en volwassen synapsen. Neuron 2 is dus volwassener met een hogere dichtheid van volwassen stekels. Na het opruimen kunnen de weefselbrokken worden gekleurd met behulp van traditionele immunohistochemie.