Name: Profilering van H3K4me3 Modificatie in Planten met behulp van Splitsing onder Doelen en Tagmentatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer de CUT&Tag-methode voor epigenomisch profiel van histonmodificaties in planten. Dit protocol toont efficiënte isolatie van intacte kernen en analyse van H3K4me3 in katoenbladeren voor genexpressieregulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk financieel ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) en Fundamental Research Funds for the Central Universities, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) en het JCIC-MCP-project.

1. Bereid transposase- en voorraadoplossingen voor (dag 1)
OPMERKING: In dit deel worden de oligonucleotideadapters gecomplexeerd met Tn5-transposase om actief transposase te maken.
<ol><li>Verdun primers (primer A, primer B en primer C) tot een concentratie van 100 μM met behulp van de gloeibuffer (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (zie tabel 1 voor sequentie-informatie van primers en tabel 2 voor de recepten voor werkoplossingen). Bewaren bij -20 °C tot gebruik.</li>
	<li>Stel de volgende twee reacties in PCR-buizen in: Reactie 1 (adapter AB), 10 μL van 100 μM primer A, 10 μL van 100 μM primer B; Reactie 2 (adapter AC), 10 μL van 100 μM primer A, 10 van μL 100 μM primer C.</li>
	<li>Gloei de adapters in de PCR-machine met behulp van het volgende programma: warmtedeksel (102 °C), 75 °C gedurende 15 minuten, 60 °C gedurende 10 minuten, 50 °C gedurende 10 minuten, 40 °C gedurende 10 minuten, 25 °C gedurende 30 minuten. OPMERKING: De adapters zijn gedeeltelijk dubbelstrengs DNA-moleculen (concentratie = 50 pmol/μL).</li>
	<li>Stel de volgende reactie in een centrifugebuis van 1,5 ml in: 10 μl pA-Tn5 transposase (500 ng/μl of 7,5 pmol/μl), 0,75 μl adapter AB (50 pmol/μl), 0,75 μl adapter AC (50 pmol/μl), 7 μl koppelingsbuffer. Pipetteer 20x zachtjes om goed te mengen en incubeer bij 30 °C in een waterbad gedurende 1 uur. De uiteindelijke concentratie transposase = 4 pmol/μL. Bewaren bij -20 °C tot gebruik. OPMERKING: Molaire verhouding van adapter AB: adapter AC: transposase = 0,5:0,5:1.</li>
	<li>Bereid de stamoplossingen volgens de recepten in tabel 2 en autoclaaf of filtreer de stamoplossingen om te steriliseren.</li>
	<li>Autoclaaf en steriliseren schaar, filtreerpapier, een roestvrijstalen zeef, een vijzel, stampers, enz.</li>
</ol>2. Kernisolatie (Dag 2)
<ol><li>Koel de centrifuge voor tot 4 °C. Bereid voor elke 1 g van de grondstof (katoenen bladeren) 25 ml nucleaire isolatiebuffer A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 ml nucleaire isolatiebuffer B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 ml nucleaire wasbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, proteaseremmer cocktail 0,1%), 1 ml antilichaambuffer (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, 1 mg/ml BSA, proteaseremmer cocktail 0,1%, 0,05% w/v digitonine). Laat de buizen op ijs zitten tot gebruik.</li>
	<li>Maal verse bladeren (~ 1 g) in vloeibare stikstof tot een fijn poeder en breng over in een buis van 50 ml met 25 ml gekoelde nucleaire isolatiebuffer A.</li>
	<li>Meng de bufferoplossing voorzichtig en incubeer de buis gedurende 5 minuten op ijs met zacht schudden om het materiaal gelijkmatig te verspreiden.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 rcf bij 4 °C om de celkorrel te vormen.</li>
	<li>Decanteer het supernatant en resuspend de pellet met 20 ml gekoelde nucleaire isolatiebuffer B aangevuld met 0,5% Triton X-100. Keer de buis voorzichtig om om de pellet volledig te resuspenderen. OPMERKING: De nucleaire isolatiebuffer B van 20 ml is van toepassing op 1 g uitgangsmateriaal en dit volume kan dienovereenkomstig worden geschaald.<ol>
<li>Voer een pilottest uit om het effect van de serieconcentratie van Triton X-100 te testen (bijv. 2 ml nucleaire isolatiebuffer B, elk met 0,1%, 0,25%, 0,5% en 1% Triton X-100 voor 100 mg gemalen weefsels). De juiste concentratie triton X-100 wordt aangegeven door een ophoping van witte /grijze kernen aan de onderkant en een donkergroen supernatant na lysis en centrifugeren op lage snelheid (< 500 rcf gedurende 4 minuten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filter het resulterende cellysaat met een combinatie van twee zeven: een zeef met 500 mazen aan de bovenkant om het grotere weefselafval te verwijderen en een zeef met 1000 mazen aan de onderkant om de kernen te verzamelen. OPMERKING: Kies een geschikte maaswijdte voor de zeven, afhankelijk van de kerngrootte van de planten.</li>
	<li>Gebruik steriel filterpapier aan de achterkant van de zeef om kleincellig vuil in het lysaat te absorberen.</li>
	<li>Breng de resterende kernen met lysaat aan de bovenzijde van de zeef met 1000 mazen over in vier verse centrifugebuizen van 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C om de kernen op te vangen.</li>
	<li>Verwijder zoveel mogelijk van het supernatant met een pipetpunt en was de pellet met nucleaire wasbuffer.</li>
	<li>Voeg 800 μL van de nucleaire wasbuffer toe en keer de buizen voorzichtig om om de pellet opnieuw te scharuspenderen. Draai de buis opnieuw gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C.</li>
	<li>Voer in totaal 3 wasbeurten uit.</li>
	<li>(Optioneel) Stel de kernen voor onder een microscoop voor DAPI-kleuring.<ol>
<li>Breng 100 μL kernsuspensie over in de nucleaire wasbuffer vanaf stap 2.11. naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Voeg 900 μL nucleaire wasbuffer en 2 μL DAPI-stamoplossing (1 mg/ml) toe om een uiteindelijke werkconcentratie van 2 μg/ml voor DAPI te maken. Incubeer de buis in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Centrifugeer na het kleuren gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C om de kernen op te vangen.</li>
		<li>Verwijder zoveel mogelijk van het supernatant met behulp van een pipetpunt. Was 3 keer met 800 μL van de nucleaire wasbuffer.</li>
		<li>Verwijder zoveel mogelijk van het supernatant en resuspend de kernen met 100 μL nucleaire wasbuffer.</li>
		<li>Stel de kernen voor onder een fluorescentiemicroscoop met behulp van het DAPI-kanaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combineer de kernen uit twee buizen (~ 50 μL kernen in volume in elke buis van 1,5 ml). Centrifugeer gedurende 4 min bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder zoveel mogelijk van de resterende buffer met behulp van een pipetpunt.</li>
</ol>3. Antilichaam incubatie
<ol><li>Resuspend elke 50 μL kernen in een buis van 1,5 ml met 1 ml antilichaambuffer.</li>
	<li>Stel de volgende reacties in 1,5 ml buizen in: twee biologische replicaties van IgG-controlegroepen met 150 μL kernen (~ 1 μg chromatine) en 2 μL IgG (1 mg/ml) in elke buis, twee biologische replicaties van H3K4me3-testgroepen met 150 μL kernen en 2 μL anti-H3K4me3-antilichaam (1 mg/ml) in elke buis.</li>
	<li>Meng de oplossing voorzichtig en laat de buizen op een horizontale schudder voor hybridisatie gedurende een nacht bij 4 °C en 12 tpm.</li>
	<li>Koel de centrifuge voor tot 4 °C. Bereid verse 50 ml immunoprecipitatie (IP) wasbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, proteaseremmer cocktail 0,1%, 0,05% w / v digitonine) in een centrifugebuis van 50 ml. Laat de buis op ijs zitten.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder de antilichaambuffer uit elke buis.</li>
	<li>Voeg 800 μL IP-wasbuffer toe aan elke buis en meng voorzichtig. Laat de buizen op een horizontale shaker gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en 12 rpm.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen na het wassen gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een pipetpunt. OPMERKING: Om verstoring van de kernkorrel te voorkomen, laat u ~ 50-80 μL van de buffer met de kernen.</li>
	<li>Herhaal stap 3.6.-3.7. nog twee keer.</li>
	<li>Na de derde wasbeurt gedurende 2 minuten centrifugeren bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder de resterende buffer zoveel mogelijk.</li>
</ol>4. Transposase incubatie
<ol><li>Maak vers 1 ml transposase-incubatiebuffer (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, proteaseremmer cocktail 0,1%, 0,05% w/v digitonine) door 1 ml van de IP-wasbuffer te mengen met 30 μL van 5 M NaCl.</li>
	<li>Om het Tn5 transposasemengsel voor incubatie te bereiden, voegt u 1 μL van het transposase toe aan elke 150 μL van de transposase-incubatiebuffer. OPMERKING: Bereid de transposase-oplossingsmix eerst op basis van het aantal reacties en voeg vervolgens een aliquot van 150 μL toe aan elke buis.</li>
	<li>Resuspend de kernen met 150 μL transposase-oplossing.</li>
	<li>Laat de buizen op een horizontale shaker bij 12 rpm gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur en meng elke 10-15 min.</li>
	<li>Centrifugeer na transposase-incubatie de buizen gedurende 4 minuten bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder de transposase-incubatiebuffer in elke buis.</li>
	<li>Was de buizen met ip-wasbuffer. Voeg hiervoor 800 μL IP-wasbuffer toe aan elke buis, meng voorzichtig en laat de buizen op een horizontale shaker bij 12 tpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur staan.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 4 min bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een pipetpunt.</li>
	<li>Herhaal stap 4.6.-4.7. nog twee keer.</li>
	<li>Na de derde wasbeurt gedurende 2 minuten centrifugeren bij 300 rcf bij 4 °C. Verwijder de resterende buffer zoveel mogelijk.</li>
</ol>5. Tagmentatie
<ol><li>Maak vers 2 ml van de tagmentatiebuffer (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidine, proteaseremmer cocktail 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% w/v digitonine) door 2 ml IP-wasbuffer te mengen met 60 μL van 5 M NaCl en 20 μL van 1 M MgCl2.</li>
	<li>Resuspend de kernen met 300 μL tagmentatiebuffer.</li>
	<li>Meng de oplossing en incubeer in een waterbad van 37 °C gedurende 1 uur voor tagmentatie.</li>
	<li>Stop de tagmentatie met 10 μL van 0,5 M EDTA (eindconcentratie ~15 mM) en 30 μL van 10% SDS (eindconcentratie 1%).</li>
</ol>6. DNA-extractie en NGS-bibliotheekconstructie
<ol><li>Voeg 300 μL CTAB DNA-extractiebuffer toe zoals beschreven7. Incubeer de buizen in een waterbad van 65 °C gedurende 30 minuten. Keer om om elke ~ 10 min.</li>
	<li>Voeg 600 μL fenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) toe aan elke buis. Meng.</li>
	<li>Centrifugeer de faseslots gelbuizen gedurende 2 minuten bij 13.000 rcf bij 4 °C. Breng de bovenstaande oplossing over in fasevergrendelingsgeleizen.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 rcf bij 4 °C.</li>
	<li>Breng het supernatant (~600 μL) over in een nieuwe buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 600 μL chloroform toe aan elke buis. Meng.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 rcf bij 4 °C.</li>
	<li>Breng het supernatant (~600 μL) over in een nieuw buisje van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 12 μL 100% ethanol en 2 μL GlycoBlue Coprecipitant toe. Meng goed en bewaar bij -20 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 rcf bij 4 °C.</li>
	<li>Decanteer het bovennatuurlijke. Was de DNA-pellet met 75% (v/v) ethanol en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 13.000 rcf bij 4 °C.</li>
	<li>Decanteer het bovennatuurlijke. Droog de DNA-pellet aan de lucht en resuspend het DNA in 25 μL ddH2O.</li>
	<li>Stel de PCR-reactie als volgt in. Voeg voor een totaal van 50 μL reactie 24 μL DNA, 11 μL ddH2O, 10 μL 5x TAE-buffer, 2 μL P5 primer (10 μM), 2 μL P7 primer (10 μM) en 1 μL TruePrep Amplify Enzyme toe. PCR-programma: 72 °C gedurende 3 min, 98 °C gedurende 30 s; vervolgens 14 cycli van 98 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s, gevolgd door 72 °C gedurende 5 minuten. OPMERKING: De eerste 72 °C gedurende 3 minuten voor verlenging kan niet worden overgeslagen. Overemplificatie van de bibliotheek zal leiden tot een hoog niveau van PCR-duplicaten in de NGS. Begin met 12-14 PCR-cycli in PCR-reactie voor H3K4me3 bij gebruik van ~ 1 μg chromatine in elke reactie.</li>
	<li>Laad 2 μL van de PCR-producten op 1,5% agarosegel voor elektroforese.</li>
	<li>Zuiver de PCR-producten met behulp van commerciële DNA-zuivering magnetische kralen.</li>
	<li>Kwantificeer de bibliotheek met een fluorometer en agarose gel elektroforese. OPMERKING: De effectieve concentratie van de bibliotheek moet worden >2 nM door qPCR om een goede kwaliteit te garanderen.</li>
	<li>Voer next-generation sequencing (NGS) en data-analyse uit.</li>
</ol>

<ol><li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+ENCODE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.</a> Plant Methods. 16, 120(2020).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
<li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CUT%26Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li>
<li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+%28Gossypium+spp.%29+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11(2007).</li>
<li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).</li>
<li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li>
</ol>

Alle auteurs hebben geen belangenconflicten met een bedrijf dat handelt in een van de bovengenoemde producten.

Hier hebben we CUT & Tag beschreven, een technologie voor het genereren van DNA-bibliotheken met een hoge resolutie en een uitzonderlijk lage achtergrond met behulp van een klein aantal cellen met een vereenvoudigde procedure in vergelijking met chromatine-immunoprecipitatie (ChIP). Ons succes met H3K4me3-profilering in katoenbladeren suggereert dat CUT & Tag, dat voor het eerst werd ontworpen voor dierlijke cellen, ook kan worden gebruikt voor plantencellen. Zowel het Tris-buffersysteem dat vaak wordt gebruikt voor ChIP...

Transcriptiefactorbindende DNA-sites en open chromatine geassocieerd met histonmodificatiemerken vervullen een cruciale functionele rol bij het reguleren van genexpressie en zijn de belangrijkste aandachtspunten van epigenetisch onderzoek1. Conventioneel is chromatine immunoprecipitatie assay (ChIP) in combinatie met diepe sequencing (ChIP-seq) gebruikt voor de genoombrede identificatie van specifieke chromatine histonmodificatie of DNA-doelen met specifieke eiwitten, en wordt op grote schaal toegepast op het gebied van epigenetica2. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) technologie werd oorspronkelijk ontwikkeld door het Henikoff Lab om de eiwit-geaffilieerde DNA-fragmenten in het hele genoom te vangen5. In vergelijking met ChIP genereert CUT&Tagcan DNA-bibliotheken met een hoge resolutie en een uitzonderlijk lage achtergrond met behulp van een klein aantal cellen met een vereenvoudigde procedure3. Tot op heden zijn methoden voor de analyse van chromatinegebieden met specifieke histonmodificaties met behulp van CUT&Tag vastgesteld in dierlijke cellen4,5. Specifiek is eencellige CUT&Tag (scCUT&Tag) ook met succes ontwikkeld voor menselijke weefsels en cellen6. Vanwege de complexiteit van de celwand en secundaire metabolieten is CUT&Tag echter nog steeds technisch uitdagend voor plantenweefsels.
Eerder rapporteerden we een CUT& Tag-protocol met intacte kernen geïsoleerd uit allotetraploïde katoenbladeren4. Om de efficiëntie van kernisolatie en DNA-vastlegging met behulp van plantenweefsel aan te tonen, wordt hier de profileringsprocedure gepresenteerd. De belangrijkste stappen omvatten intacte kernisolatie, in situ incubatie met het antilichaam voor chromatinemodificatie, transposase-incubatie, adaptorintegratie en DNA-bibliotheekvoorbereiding. De probleemoplossing richt zich op de CUT&Tag-bibliotheekvoorbereiding voor de isolatie van de kernen van de plant en de kwaliteitscontrole. 
In deze studie presenteren we een verfijnde CUT&Tag strategie voor planten. We bieden niet alleen een stapsgewijs protocol voor H3K4me3-profilering in katoenbladeren, maar we bieden ook een geoptimaliseerde methodologie voor isolatie van plantenkernen, inclusief de strategie voor het selecteren van de concentratie van wasmiddel voor een goede cellyse en de strategie om de kernen te filteren. Gedetailleerde stappen met kritische opmerkingen zijn ook opgenomen in dit bijgewerkte protocol.

<table><tbody><tr><td>Antilichaam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Normaal konijn IgG</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA)</td><td></td><td></td><td>Maak 10 mg/ml BSA stockoplossing. Bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>digitonine (~50% (TLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Maak 5% digitonine stockoplossing (200 mg digitonine [~50% zuiverheid] op 2 mL DMSO). Opmerking: Steriliseer met behulp van een 0.22- micron filter. Bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethyleen-diamine-tetra-azijnzuur (EDTA)</td><td></td><td></td><td>Maak 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stockoplossing. Opmerking: Voor het maken van 100 mL 0.5-M EDTA (pH = 8.5) zijn ongeveer 2 g natriumhydroxide (NaOH) pellets nodig om de pH aan te passen</td></tr><tr><td>ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumchloride (MgCl2)</td><td></td><td></td><td>Maak 1 M MgCl2 stockoplossing</td></tr><tr><td>protease inhibitor cocktail</td><td>Calbiochem</td><td>539133-1SET</td><td></td></tr><tr><td>kaliumchloride (KCl)</td><td></td><td></td><td>Maak 1 M KCl stockoplossing</td></tr><tr><td>fenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>natriumchloride (NaCl)</td><td></td><td></td><td>Maak 5 M NaCl stockoplossing</td></tr><tr><td>spermidine</td><td></td><td></td><td>Maak 2 M spermidine stockoplossing, bewaar bij -20&deg;C.</td></tr><tr><td>natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td></td><td></td><td>Maak 10% SDS stockoplossing. Opmerking: Niet autoclaveren; steriliseren met behulp van een 0.22-micron filter</td></tr><tr><td>Tris base</td><td></td><td></td><td>Maak 1 M Tris (pH = 8.0) stockoplossing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Maak 20% Triton X-100 stockoplossing</td></tr><tr><td>Enzym</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase voor CUT&amp;Tag</td><td>Vazyme</td><td>S602/S603</td><td>Controleer de antilichaamaffiniteit van het proteïne A of proteïne G dat is gefuseerd met de Tn5. Over het algemeen hebben proteïnen A en G een brede antilichaamaffiniteit. Echter, proteïne A heeft een relatief hogere affiniteit voor konijnantilichamen en proteïne G heeft een relatief hogere affiniteit voor muisantilichamen. Selecteer de juiste transposaseproducten die overeenkomen met uw antilichaam.</td></tr><tr><td>TruePrep Amplify Enzyme</td><td>Vazyme</td><td>TD601</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI9700</td><td></td></tr><tr><td>Orbitale shaker</td><td>MIULAB</td><td>HS-25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One&nbsp; spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr></tbody></table>

profilering van h3k4me3 modificatie in planten met behulp van splitsing onder doelen en tagmentatie

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomische regulatie op chromatisch niveau, inclusief DNA- en histonmodificaties, gedrag van transcriptiefactoren en niet-coderende RNA's met hun gerekruteerde eiwitten, leiden tot temporele en ruimtelijke controle van genexpressie. Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT & Tag) is een enzym-tetheringmethode waarbij het specifieke chromatine-eiwit eerst wordt herkend aan zijn specifieke antilichaam en vervolgens het antilichaam een eiwit A-transposase (pA-Tn5) fusie-eiwit bindt, dat het beoogde chromatine in situ splitst door de activering van magnesiumionen. Hier bieden we ons eerder gepubliceerde CUT & Tag-protocol met intacte kernen geïsoleerd uit allortetraploïde katoenbladeren met modificatie. Dit stapsgewijze protocol kan worden gebruikt voor epigenomisch onderzoek in planten. Daarnaast worden substantiële wijzigingen voor de isolatie van plantenkernen voorzien van kritische opmerkingen.

Figuur 1 toont de CUT&Tag workflow. Figuur 2 toont de DAPI-kleuring van de intacte kernen. Het doel van de "kernisolatie" stap was om de intacte kernen te verkrijgen in een voldoende hoeveelheid voor de daaropvolgende CUT & Tag-reactie. Figuur 3 toont de agarose gel elektroforese van PCR producten. De IgG-negatieve controle is parallel vereist bij het opzetten van het experiment. Vergeleken met de IgG-controlegroep varieerde het gro...

Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&Tag) is een efficiënte chromatine epigenomische profileringsstrategie. Dit protocol presenteert een verfijnde CUT&Tag strategie voor de profilering van histonmodificaties in planten.

Profilering van H3K4me3 Modificatie in Planten met behulp van Splitsing onder Doelen en Tagmentatie

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Het algemene doel van het experiment was om eiwit-geaffilieerde DNA-fragmenten in het genoom te identificeren, die de status van het chromatine weerspiegelden. Om dit doel te bereiken werden drie speciale operaties uitgevoerd. Allereerst werden de intacte kernen van plantencellen geïsoleerd.Ten tweede werden modificaties aan het chromatine herkend door een specifiek antilichaam in situ. Ten derde, het antilichaam dat een eiwit A-transposase fusie-eiwit, Tn5 transposase, bindt, splitst het chromatine in situ onder de activering van magnesiumionen. De DNA-fragmenten en chromatinemodificatiebindingsplaatsen werden vervolgens geïntegreerd met adapters en klaargemaakt voor DNA-voorbereiding.Polymerasekettingreactieverrijking verbeterde generatie-sequencing. Epigenomics regulatie op chromatisch niveau, inclusief DNA- en histonmodificaties, gedrag van transcriptiefactoren en niet-coderende RNA's met hun gerekruteerde eiwitten, leiden tot temporele en ruimtelijke controle van genexpressie. CUT&Tag technologie ontwikkeld door Henikoff Lab is een enzym tethering methode voor chromatine epigenomics profilering met een hoog rendement.Hier gebruiken we de katoenbladeren als experimentele materialen en om de chromatineprofilering uit te voeren met behulp van antilichaam van Histone H3 Lysine-4 Trimethylation als voorbeeld. We bieden een verfijnd protocol met video voor CUT&Tag-prestaties in fabrieken. Voor elke monstervoorbereiding met CUT&Tag werd gram katoenen bladweefsel verzameld.Het blad werd vermalen tot een fijn poeder met vloeibare stikstof en overgebracht in een valkbuis van 50 ml met 25 ml gekoelde nucleaire isolatiebuffer A. De bufferoplossing werd voorzichtig gemengd en de buis werd gedurende vijf minuten op ijs geïncubeerd met zacht schudden om het materiaal gelijkmatig te verspreiden. Het werd vervolgens gesponnen met 500 relatieve centrifugale kracht of rcf, bij 4 graden Celsius, gedurende vijf minuten, om de celkorrel te vormen. Het supernatant werd gedecanteerd en de pellet werd geresuspendeerd met 20 ml gekoelde nucleaire isolatiebuffer B, aangevuld met 0,5% Triton.De buis werd voorzichtig omgekeerd om de pellet volledig te resuspenderen. Het resulterende cellysaat werd vervolgens gefilterd met een combinatie van twee zeven, een zeef met 500 mazen bovenop werd gebruikt om het grotere weefselafval te verwijderen. En een zeef met 1000 mazen werd op de bodem gebruikt om de kernen te verzamelen.De keuze van de juiste maaswijdte van de zeven hangt af van de grootte van de kernen van de planten. Steriel filterpapier werd aan de achterkant van de zeef gebruikt om een deel van het lysaat en kleincellig puin te absorberen. Het lysaat dat de kernen bevat, werd overgebracht naar een verse centrifugebuis van 1,5 milliliter en gedurende vier minuten gesponnen bij 300 rcf, bij 4 graden Celsius celsius om de kernen te verzamelen.Na het centrifugeren werd een pipetpunt gebruikt om zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen. Een hoeveelheid van 800 microliter, een nucleaire wasbuffer werd toegevoegd. En de buis werd voorzichtig omgekeerd om de kernen te resuspenderen.De buis werd opnieuw gesponnen bij 300 rcf, gedurende vier minuten bij 4 graden Celsius. Na in totaal drie wasbeurten werden de resulterende kernen gecombineerd in een verse centrifugebuis van 1,5 milliliter en gesponnen bij 300 rcf, gedurende vier minuten bij 4 graden Celsius. Een pipetpunt werd gebruikt om zoveel mogelijk de resterende buffer te verwijderen.De volgende stap was de incubatie van het antilichaam. Een aliquot van 50 microliter kernen werd geresuspendeerd in 1 milliliter antilichaambuffer aangevuld met EDTA, BSA, proteaseremmer cocktail in digitonine. Een aliquot van 150 microliter van de kernsuspensie werd in een verse buis van 1,5 milliliter geplaatst voor één reactie, twee microliter antilichaam werden aan elke buis toegevoegd.In deze test werden twee biologische replicaties voor de anti-histon-H3-Lysine-4-Trimethylatie-antilichaam en immunoglobuline G negatieve controlegroepen opgezet nadat antilichaam was toegevoegd. De oplossing werd voorzichtig gemengd en de buizen werden op een horizontale schudder achtergelaten voor hybridisatie 's nachts bij vier graden Celsius in 12 tpm. De volgende ochtend werden de buisjes eruit gehaald en werden de kernen gewassen met 800 microliter immunoprecipitatiewasbuffer.De buis werd voorzichtig omgekeerd om te mengen en werd vijf minuten op horizontale shaker gelaten bij kamertemperatuur in 12 rpm. Na het wassen werd de buis vier minuten lang bij vier graden Celsius op 300 rcf gesponnen. Na het centrifugeren werd het supernatant verwijderd met behulp van een pipetpunt.Dit werd herhaald voor een totaal van drie wasbeurten. Na de derde wasbeurt werd de buis gedurende twee minuten bij vier graden Celsius een 300 rcf gesponnen en werd een pipetpunt gebruikt om de resterende buffer zoveel mogelijk te verwijderen. Om de Tn5 transposase mix voor incubatie te bereiden.Eén microliter transposase werd toegevoegd aan elke 150 microliter van de transposase-incubatiebuffer. We raden aan om de transposase-oplossingsmix eerst te bereiden op basis van het aantal reacties. En dan een aliquot van 150 microliter aan elke buis toevoegen.De oplossing werd voorzichtig gemengd en gedurende twee uur op een horizontale shaker bij kamertemperatuur in 12 tpm gelaten. De buizen werden om de 10 tot 15 minuten voorzichtig gemengd. Na incubatie werden de kernen driemaal gewassen met behulp van 800 microliter immunoprecipitatiewasbuffer bij kamertemperatuur om het ongebonden Tn5-transposase te verwijderen.Na de derde wasbeurt werd de buis gedurende twee minuten bij vier graden Celsius bij 300 rcf gesponnen en werd een pipetpunt gebruikt om de resterende buffer te verwijderen. Voor de tagmentatiestap werd 300 microliter tagmentatiebuffer toegevoegd aan de reactiebuis. De oplossing werd goed gemengd en gedurende een uur geïncubeerd bij 37 graden Celsius.Na incubatie werden 10 microliters van 0,5 mol per liter EDTA bij 30 microliter van 10% SDS toegevoegd om de reactie te bepalen. Vervolgens werden 300 microliter DNA-extractiebuffer toegevoegd. Er werd onregelmatig DNA-extractie uitgevoerd.De DNA-fragmenten werden opgelost in 25 microliter steriel water. 24 microliter werden gebruikt voor PCR-versterking in de NGS-bibliotheekconstructie. Deze figuur toont de intacte kernvlek met DAPI in beeld, onder een microscoop het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid intacte en relatief schone kernen is de kritieke stap voor CUT & Tag.Na PCR werden twee microliters overgedragen en werd de grootte van het DNA gecontroleerd op 1,5% agarosegel. Deze figuur laat zien dat vergelijkbaar met de immunoglobuline gen negatieve controle. Het grootste deel van de DNA-fragmenten van het Histone H3 Lysine 4 Trimethylation-monster zou moeten variëren van 280 tot 500 basenparen.De DNA-fragmenten kunnen worden gezuiverd en vervolgens worden geprofileerd door sequencing met hoge doorvoer. Deze figuur toont de resultaten generatie sequencing voor de anti-histon H3 Lysine 4 Trimethylation antilichaam vergelijken met de immunoglobuline G negatieve controlegroepen. Deze technologie genereert de DNA-bibliotheken met een hoge resolutie en een uitzonderlijk lage achtergrond met behulp van een klein aantal cellen met een vereenvoudigde procedure in vergelijking met ChIP-seq.CUT&Tag is een nieuwe methode en nog steeds in uitvoering.

profiling-h3k4me3-modification-plants-using-cleavage-under-targets

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een betrouwbare en bruikbare benadering van de histon-modificaties op specifieke plantengenen te detecteren is beschreven. De aanpak combineert chromatine immunoprecipitatie (chip) en real-time kwantitatieve PCR. Het maakt de ontdekking van histon-modificaties op specifieke genen met een rol spelen in verschillende fysiologische processen.

Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Het protocol is ontwikkeld om intacte histonen effectief te extraheren uit sorghumbladmaterialen voor profilering van histon post-translationele modificaties die kunnen dienen als potentiële epigenetische markers om droogtebestendige gewassen te helpen.

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.

Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Onderzoekers die nieuw zijn in het epigenetische veld zullen CUT&amp;Tag een aanzienlijk eenvoudiger alternatief vinden voor ChIP-tests. CUT&amp;Tag heeft enorm geprofiteerd van de epigenetische studies op zeldzame en primaire celpopulaties, door hoogwaardige gegevens te genereren uit zeer weinig cellen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van H3K4me1 CUT&amp;Tag-assays op muizenmyoblasten geïsoleerd uit de achterpotspieren van muizen.

Met behulp van splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&#38;tag) assay in muizenmyoblastonderzoek

Dit protocol maakt efficiënte histonextractie uit verschillende klinische monsters mogelijk voor latere posttranslationele modificatieanalyse door LC-MS/MS. Door robuuste detectie van belangrijke histonmodificaties te faciliteren, dient het als een waardevol hulpmiddel voor uitgebreide epigenetische profilering in grote klinische cohorten.

Extractie van histonen uit klinische monsters voor epigenetisch profileren door middel van massaspectrometrie

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&amp;Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

Leer de CUT&Tag-methode voor epigenomisch profiel van histonmodificaties in planten. Dit protocol toont efficiënte isolatie van intacte kernen en analyse van H3K4me3 in katoenbladeren voor genexpressieregulatie.

Profilering van H3K4me3 Modificatie in Planten met behulp van Splitsing onder Doelen en Tagmentatie

Meer video's verkennen