Profilering van H3K4me3 Modificatie in Planten met behulp van Splitsing onder Doelen en Tagmentatie

Het algemene doel van het experiment was om eiwit-geaffilieerde DNA-fragmenten in het genoom te identificeren, die de status van het chromatine weerspiegelden. Om dit doel te bereiken werden drie speciale operaties uitgevoerd. Allereerst werden de intacte kernen van plantencellen geïsoleerd.

Ten tweede werden modificaties aan het chromatine herkend door een specifiek antilichaam in situ. Ten derde, het antilichaam dat een eiwit A-transposase fusie-eiwit, Tn5 transposase, bindt, splitst het chromatine in situ onder de activering van magnesiumionen. De DNA-fragmenten en chromatinemodificatiebindingsplaatsen werden vervolgens geïntegreerd met adapters en klaargemaakt voor DNA-voorbereiding.

Polymerasekettingreactieverrijking verbeterde generatie-sequencing. Epigenomics regulatie op chromatisch niveau, inclusief DNA- en histonmodificaties, gedrag van transcriptiefactoren en niet-coderende RNA's met hun gerekruteerde eiwitten, leiden tot temporele en ruimtelijke controle van genexpressie. CUT&Tag technologie ontwikkeld door Henikoff Lab is een enzym tethering methode voor chromatine epigenomics profilering met een hoog rendement.

Hier gebruiken we de katoenbladeren als experimentele materialen en om de chromatineprofilering uit te voeren met behulp van antilichaam van Histone H3 Lysine-4 Trimethylation als voorbeeld. We bieden een verfijnd protocol met video voor CUT&Tag-prestaties in fabrieken. Voor elke monstervoorbereiding met CUT&Tag werd gram katoenen bladweefsel verzameld.

Het blad werd vermalen tot een fijn poeder met vloeibare stikstof en overgebracht in een valkbuis van 50 ml met 25 ml gekoelde nucleaire isolatiebuffer A. De bufferoplossing werd voorzichtig gemengd en de buis werd gedurende vijf minuten op ijs geïncubeerd met zacht schudden om het materiaal gelijkmatig te verspreiden. Het werd vervolgens gesponnen met 500 relatieve centrifugale kracht of rcf, bij 4 graden Celsius, gedurende vijf minuten, om de celkorrel te vormen. Het supernatant werd gedecanteerd en de pellet werd geresuspendeerd met 20 ml gekoelde nucleaire isolatiebuffer B, aangevuld met 0,5% Triton.

De buis werd voorzichtig omgekeerd om de pellet volledig te resuspenderen. Het resulterende cellysaat werd vervolgens gefilterd met een combinatie van twee zeven, een zeef met 500 mazen bovenop werd gebruikt om het grotere weefselafval te verwijderen. En een zeef met 1000 mazen werd op de bodem gebruikt om de kernen te verzamelen.

De keuze van de juiste maaswijdte van de zeven hangt af van de grootte van de kernen van de planten. Steriel filterpapier werd aan de achterkant van de zeef gebruikt om een deel van het lysaat en kleincellig puin te absorberen. Het lysaat dat de kernen bevat, werd overgebracht naar een verse centrifugebuis van 1,5 milliliter en gedurende vier minuten gesponnen bij 300 rcf, bij 4 graden Celsius celsius om de kernen te verzamelen.

Na het centrifugeren werd een pipetpunt gebruikt om zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen. Een hoeveelheid van 800 microliter, een nucleaire wasbuffer werd toegevoegd. En de buis werd voorzichtig omgekeerd om de kernen te resuspenderen.

De buis werd opnieuw gesponnen bij 300 rcf, gedurende vier minuten bij 4 graden Celsius. Na in totaal drie wasbeurten werden de resulterende kernen gecombineerd in een verse centrifugebuis van 1,5 milliliter en gesponnen bij 300 rcf, gedurende vier minuten bij 4 graden Celsius. Een pipetpunt werd gebruikt om zoveel mogelijk de resterende buffer te verwijderen.

De volgende stap was de incubatie van het antilichaam. Een aliquot van 50 microliter kernen werd geresuspendeerd in 1 milliliter antilichaambuffer aangevuld met EDTA, BSA, proteaseremmer cocktail in digitonine. Een aliquot van 150 microliter van de kernsuspensie werd in een verse buis van 1,5 milliliter geplaatst voor één reactie, twee microliter antilichaam werden aan elke buis toegevoegd.

In deze test werden twee biologische replicaties voor de anti-histon-H3-Lysine-4-Trimethylatie-antilichaam en immunoglobuline G negatieve controlegroepen opgezet nadat antilichaam was toegevoegd. De oplossing werd voorzichtig gemengd en de buizen werden op een horizontale schudder achtergelaten voor hybridisatie 's nachts bij vier graden Celsius in 12 tpm. De volgende ochtend werden de buisjes eruit gehaald en werden de kernen gewassen met 800 microliter immunoprecipitatiewasbuffer.

De buis werd voorzichtig omgekeerd om te mengen en werd vijf minuten op horizontale shaker gelaten bij kamertemperatuur in 12 rpm. Na het wassen werd de buis vier minuten lang bij vier graden Celsius op 300 rcf gesponnen. Na het centrifugeren werd het supernatant verwijderd met behulp van een pipetpunt.

Dit werd herhaald voor een totaal van drie wasbeurten. Na de derde wasbeurt werd de buis gedurende twee minuten bij vier graden Celsius een 300 rcf gesponnen en werd een pipetpunt gebruikt om de resterende buffer zoveel mogelijk te verwijderen. Om de Tn5 transposase mix voor incubatie te bereiden.

Eén microliter transposase werd toegevoegd aan elke 150 microliter van de transposase-incubatiebuffer. We raden aan om de transposase-oplossingsmix eerst te bereiden op basis van het aantal reacties. En dan een aliquot van 150 microliter aan elke buis toevoegen.

De oplossing werd voorzichtig gemengd en gedurende twee uur op een horizontale shaker bij kamertemperatuur in 12 tpm gelaten. De buizen werden om de 10 tot 15 minuten voorzichtig gemengd. Na incubatie werden de kernen driemaal gewassen met behulp van 800 microliter immunoprecipitatiewasbuffer bij kamertemperatuur om het ongebonden Tn5-transposase te verwijderen.

Na de derde wasbeurt werd de buis gedurende twee minuten bij vier graden Celsius bij 300 rcf gesponnen en werd een pipetpunt gebruikt om de resterende buffer te verwijderen. Voor de tagmentatiestap werd 300 microliter tagmentatiebuffer toegevoegd aan de reactiebuis. De oplossing werd goed gemengd en gedurende een uur geïncubeerd bij 37 graden Celsius.

Na incubatie werden 10 microliters van 0,5 mol per liter EDTA bij 30 microliter van 10% SDS toegevoegd om de reactie te bepalen. Vervolgens werden 300 microliter DNA-extractiebuffer toegevoegd. Er werd onregelmatig DNA-extractie uitgevoerd.

De DNA-fragmenten werden opgelost in 25 microliter steriel water. 24 microliter werden gebruikt voor PCR-versterking in de NGS-bibliotheekconstructie. Deze figuur toont de intacte kernvlek met DAPI in beeld, onder een microscoop het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid intacte en relatief schone kernen is de kritieke stap voor CUT & Tag.

Na PCR werden twee microliters overgedragen en werd de grootte van het DNA gecontroleerd op 1,5% agarosegel. Deze figuur laat zien dat vergelijkbaar met de immunoglobuline gen negatieve controle. Het grootste deel van de DNA-fragmenten van het Histone H3 Lysine 4 Trimethylation-monster zou moeten variëren van 280 tot 500 basenparen.

De DNA-fragmenten kunnen worden gezuiverd en vervolgens worden geprofileerd door sequencing met hoge doorvoer. Deze figuur toont de resultaten generatie sequencing voor de anti-histon H3 Lysine 4 Trimethylation antilichaam vergelijken met de immunoglobuline G negatieve controlegroepen. Deze technologie genereert de DNA-bibliotheken met een hoge resolutie en een uitzonderlijk lage achtergrond met behulp van een klein aantal cellen met een vereenvoudigde procedure in vergelijking met ChIP-seq.

CUT&Tag is een nieuwe methode en nog steeds in uitvoering.